原發(fā)性醛固酮增多癥的分子機(jī)制研究進(jìn)展

蔣怡然， 王衛(wèi)慶

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科 上海市內(nèi)分泌代謝病研究所國(guó)家代謝性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（上海） 國(guó)家衛(wèi)健委內(nèi)分泌代謝病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市內(nèi)分泌腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025）

原發(fā)性醛固酮增多癥是繼發(fā)性高血壓最常見(jiàn)的形式，早期診斷和治療對(duì)預(yù)防不良心血管結(jié)局至關(guān)重要。近年來(lái)，隨著分子診斷進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)醛固酮合成的基因胚系和體系突變是導(dǎo)致疾病發(fā)生的主要機(jī)制。本文將闡述原發(fā)性醛固酮增多癥的分子機(jī)制及基于機(jī)制的動(dòng)物模型。

基因突變與原發(fā)性醛固酮增多癥

一、 內(nèi)向整流型鉀離子通道亞家族J 成員5（recombinant potassium inwardly rectifying channel subfamily J, member 5，KCNJ5）基因

2011 年，Choi 等[1]在22 例醛固酮腺瘤（aldosterone-producing adenomas，APA） 患者中發(fā)現(xiàn)8 例KCNJ5體細(xì)胞突變。 人類KCNJ5基因編碼G 蛋白耦聯(lián)內(nèi)向整流鉀離子通道4 蛋白（G proteincoupled inwardly-rectifying potassium channels 4,GIRK4），APA 組織中KCNJ5突變導(dǎo)致GIRK4 蛋白結(jié)構(gòu)和功能改變，最常見(jiàn)的突變包括p. Gly151Arg、p. Thr158Ala、 p. Leu168Arg，位于通道選擇性過(guò)濾器區(qū)域，突變使鉀離子選擇性缺失，增加鈉離子滲透性，因電壓-門(mén)控鈣離子通道開(kāi)放導(dǎo)致膜去極化，激活鈣離子信號(hào)通路， 并最終增加醛固酮合成酶（aldosterone synthase,CYP11B2） 表達(dá)和醛固酮生物合成。

KCNJ5體細(xì)胞突變?cè)贏PA 中最為常見(jiàn)， 西方國(guó)家報(bào)道APA 中KCNJ5突變率約40%[2-3]， 在亞洲國(guó)家更高，為60%～77%[4-5]。KCNJ5突變的腺瘤患者更年輕，女性多見(jiàn)，血醛固酮水平更高，腫瘤體積更大。 Cao 等[6]通過(guò)二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)KCNJ5突變率為80.7%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)10 個(gè)新的顯著突變基因（significantly mutated genes, SMG），并提出APA 基因表達(dá)譜， 為原發(fā)性醛固酮增多癥進(jìn)一步分子分型奠定基礎(chǔ)。 相比其他突變，攜帶KCNJ5突變的APA 表達(dá)CYP11B1 細(xì)胞比例更高，但CYP11B2 及GIRK4 蛋白表達(dá)較低[7]。 也有研究表明KCNJ5突變是腎上腺切除術(shù)后手術(shù)獲益的標(biāo)志[8]。KCNJ5胚系突變與家族性醛固酮增多癥Ⅲ型 （familial hyperaldosteronism Ⅲ,FH-Ⅲ）相關(guān)。 2008 年，F(xiàn)H-Ⅲ首次被描述， 臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重早發(fā)性高血壓伴低鉀血癥[9]，之后在此患者中鑒定出KCNJ5基因種系突變[1]。在FH-Ⅲ家系中觀察到不同嚴(yán)重程度的醛固酮增多癥，部分患者嚴(yán)重程度與KCNJ5突變類型相關(guān)[10]。體外研究表明， 高劑量鈣通道阻滯劑維拉帕米或大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以阻斷突變的GIRK4， 從而降低CYP11B2 表達(dá)和醛固酮合成[11]。 目前已有針對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行的臨床研究， 以評(píng)估大環(huán)內(nèi)酯類藥物用于KCNJ5突變的APA 的無(wú)創(chuàng)診斷及靶向治療效果[12]。

二、L-型電壓依賴性鈣離子通道α1D 亞基（calcium channel, voltage-dependent, L type, alpha 1D subunit，CACNA1D） 和T-型電壓依賴鈣離子通道α1H 亞基（calcium channel, voltage dependent,T-type, alpha 1H subunit，CACNA1H）基因

CACNA1D基因編碼L 型鈣通道Cav1.3 的α1亞單位，包含4 個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域（Ⅰ～Ⅳ），每個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域有6 個(gè)跨膜段（S1～S6）。 這些改變的殘基位于S6 片段中沿溝道孔排列，突變影響Cav1.3 通道多種特性， 包括延遲電壓門(mén)控依賴的失活狀態(tài)或者在低水平去極化情況下誘導(dǎo)通道開(kāi)放， 細(xì)胞內(nèi)鈣離子聚集，醛固酮大量合成，導(dǎo)致APA 發(fā)生[13-14]。利用CYP11B2 免疫組化引導(dǎo)的高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)該突變?cè)诿绹?guó)、 法國(guó)及非裔APA 患者中分別為21%、37%和42%[15-16]。而在2 例嚴(yán)重早發(fā)醛固酮增多癥患兒中發(fā)現(xiàn)CACNA1D的新種系突變，該醛固酮增多癥與復(fù)雜的神經(jīng)障礙[原發(fā)性醛固酮增多癥、癲癇發(fā)作和神經(jīng)異常（syndrome of primary aldosteronism, seizures and neurologic abnormalities，PASNA）]相關(guān)[17]。

CACNA1H基因轉(zhuǎn)錄翻譯T 型鈣離子通道Cav3.2， 該基因的胚系突變影響Cav3.2 通道特性，誘導(dǎo)其功能增強(qiáng)，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增加，激活鈣信號(hào)通路，是FH-Ⅳ的發(fā)病基因。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)5 例患兒具有CACNA1H的p.Met1549Val 位點(diǎn)突變，在10 歲前就出現(xiàn)APA[18]，其中2 例患兒伴有發(fā)育遲緩或注意力缺陷障礙。 在家族遺傳的成人患者中也同樣發(fā)現(xiàn)了CACNA1H的胚系突變[19]。在一項(xiàng)75 例APA 患者研究中發(fā)現(xiàn)3 例CACNA1H的體細(xì)胞突變[20]， 提示該基因突變?cè)谏l(fā)APA體細(xì)胞中可能致病，但是更大規(guī)模的人群數(shù)據(jù)還有待進(jìn)一步探究。 鈣通道阻滯劑可靶向用于CACNA1H突變或體細(xì)胞CACNA1D突變的APA患者。 也有報(bào)道PASNA 患者對(duì)于硝苯地平治療反應(yīng)良好。

三、Na+-K+ATP 酶α1 亞單位（sodium/potassium ATPase alpha-1, ATP1A1） 和鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 酶B3（ATPase plasma membrane Ca2+ transporting 3，ATP2B3）基因

Beuschlein 等[21]報(bào)道5.2%APA 患者攜帶ATP1A1突變，ATP1A1基因編碼細(xì)胞膜上ATP1A1，由10 個(gè)跨膜蛋白組成M1～M10 結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)的N 端和C 端。ATP1A1的體細(xì)胞突變主要位于M1、M4 及M9 結(jié)構(gòu)域。 M1 和M4 結(jié)構(gòu)域中的突變會(huì)影響鉀離子結(jié)合帶，降低離子泵對(duì)鉀離子的親和性；M9 結(jié)構(gòu)域中的突變可能會(huì)影響鈉特異性位點(diǎn)，所有突變都降低離子泵的活性。 對(duì)鉀離子親和性降低和離子泵活性的下降在不明顯升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的情況下導(dǎo)致膜去極化。 利用CYP11B2 免疫組織化學(xué)（組化）引導(dǎo)的高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)8%～17%的APA 患者具有ATP1A1突變。

Beuschlein 等[21]報(bào)道1.6% APA 患者攜帶ATP2B3突變，ATP2B3基因編碼細(xì)胞膜鈣泵（Ca2+-ATP 酶，又稱PMCA3），由10 個(gè)跨膜蛋白組成M1～M10 結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)的N 端和C 端。 所有ATP2B3突變均是框內(nèi)缺失突變， 影響在M4 結(jié)構(gòu)域的PEGL（脯氨酸-谷氨酸-甘氨酸-亮氨酸）位點(diǎn)，該區(qū)域參與鈣結(jié)合以及離子門(mén)控。 一些研究發(fā)現(xiàn)1.7%～10% APA 中攜帶有ATP2B3突變， 利用CYP11B2免疫組化引導(dǎo)的高通量測(cè)序技術(shù)這一比例可進(jìn)一步提高。ATP2B3突變導(dǎo)致離子泵活性下降，使鈣外流受損，增加胞漿內(nèi)的鈣離子濃度，激活鈣信號(hào)通路。 另外有研究證明，該突變可能通過(guò)離子泵的鈉離子內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，從而使電壓門(mén)控的鈣離子通道開(kāi)放，或由鈣內(nèi)流直接引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加[22]。

四、氯化物通道2（chloride channel 2, CLCN2）基因

FH-Ⅱ是FH 最常見(jiàn)形式， 其表型具有多樣性，既往FH-Ⅱ診斷基于2 個(gè)或2 個(gè)以上家庭成員受到影響，且無(wú)法確定其他的遺傳病因[23]。 2018年發(fā)表的一項(xiàng)研究中， 在第一個(gè)報(bào)道FH-Ⅱ家族中發(fā)現(xiàn)了編碼氯離子通道ClC-2 的CLCN2種系突變[24]。CLCN2編碼在腎上腺、腎小球表達(dá)的電壓門(mén)控的氯離子通道，該通道在超極化膜電位下開(kāi)放，通道開(kāi)放使腎小球細(xì)胞去極化，并誘導(dǎo)醛固酮合成酶的表達(dá)。 基因突變可使通道功能增強(qiáng)，在腎小球靜息電位下的開(kāi)放率更高，該研究證明了陰離子通道在腎小球膜電位測(cè)定、醛固酮生成和高血壓中的作用[25]。 而在多項(xiàng)對(duì)APA 行全外顯子組測(cè)序的研究中， 均未發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞的CLCN2突變。

五、β-連環(huán)素（catenin beta-1, CTNNB1）、環(huán)磷酸腺苷激活性蛋白激酶α 催化亞基（protein kinase cAMP-activated catalytic subunit alpha, PRKACA）和犰狳重復(fù)序列蛋白質(zhì)5 （armadillo-repeat containing 5, ARMC5）基因

CTNNB1基因編碼β-連環(huán)素，在2.1%～5.1%APA 中可檢測(cè)到該基因的體細(xì)胞突變[26]。CTNNB1突變定位于3 號(hào)外顯子，在皮質(zhì)醇分泌腺瘤及腎上腺皮質(zhì)癌中也曾被發(fā)現(xiàn)。 有研究發(fā)現(xiàn)女性中該突變更為普遍， 且提示與懷孕期間性腺受體在APA內(nèi)的異常表達(dá)相關(guān)[27]，但沒(méi)有CTNNB1基因突變的APA 組織內(nèi)同樣發(fā)現(xiàn)由性腺激素調(diào)控醛固酮合成的現(xiàn)象。PRKACA基因催化合成環(huán)磷酸腺苷依賴蛋白激酶催化亞基α （cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit α）， 在2 例APA 及1 例醛固酮和皮質(zhì)醇共分泌的患者中發(fā)現(xiàn)有該基因的體細(xì)胞突變[28]。 皮質(zhì)醇腺瘤中也存在PRKACA突變，其在自主醛固酮生成和APA 發(fā)展中的作用尚不清楚。在美國(guó)非裔原發(fā)性醛固酮增多癥患者中觀察到ARMC5的胚系突變[29]，以及在歐洲的一個(gè)原發(fā)性醛固酮增多癥患者隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)有胚系A(chǔ)RMC5突變，但是后者經(jīng)生物學(xué)工具預(yù)測(cè)，未提示有明確的致病作用[30]。 之前的研究提示ARMC5突變與原發(fā)性大結(jié)節(jié)性腎上腺增生的皮質(zhì)醇增多癥相關(guān)。以上3 個(gè)基因的體細(xì)胞突變?cè)贏PA 中均較罕見(jiàn)，其與其他腎上腺疾病關(guān)系更多。

醛固酮產(chǎn)生細(xì)胞簇的研究進(jìn)展

醛固酮產(chǎn)生細(xì)胞簇 （aldosterone-producing cell clusters, APCC） 的概念首先于2010 年被提出和描述[31]。 在此之前，醛固酮合成酶（CYP11B2）的表達(dá)及醛固酮的合成被認(rèn)為只發(fā)生在腎上腺球狀帶細(xì)胞內(nèi)，并主要受血管緊張素Ⅱ及鉀離子調(diào)控。APCC位于包膜下，主要由外部的球狀帶樣細(xì)胞和內(nèi)部的束狀帶樣細(xì)胞組成。 利用CYP11B2 免疫組化指引的二代測(cè)序技術(shù)分析APCC 的基因突變， 結(jié)果在35%的APCC 內(nèi)發(fā)現(xiàn)與APA 相同的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因，包括CACNA1D、ATP1A1、ATP2B3， 但是沒(méi)有發(fā)現(xiàn)KCNJ5突變[32]。 近來(lái)，有研究描述了從APCC 到APA的轉(zhuǎn)變過(guò)渡狀態(tài)，包括包膜下APCC 樣結(jié)構(gòu)和微小APA 樣結(jié)構(gòu)組成， 并且?guī)в畜w細(xì)胞突變， 提示APCC 可能是APA 發(fā)生的起點(diǎn)[33]。 然而，有其他研究表示APA 的發(fā)展有兩條獨(dú)立的路線， 結(jié)果顯示毗鄰APA 的腎上腺皮質(zhì)可能出現(xiàn)球狀帶的增生及結(jié)節(jié)增多，血管生成減少。 相互遠(yuǎn)離的CYP11B2 陽(yáng)性結(jié)節(jié)在同一腎上腺內(nèi)可能帶有不同的體細(xì)胞突變， 與APA 相鄰的不同APCC 同樣可能帶有不同的體細(xì)胞突變[34]。 在過(guò)去10 年中，對(duì)于APCC 的發(fā)現(xiàn)和探索為理解調(diào)控醛固酮生物合成的機(jī)制提供了一種新的模式，但其在正常腎上腺中的生理性作用有待進(jìn)一步研究。APCC 中存在APA 驅(qū)動(dòng)基因的體細(xì)胞突變， 表明其可能在APA 及增生型醛固酮增多癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用，APCC 模型支持APA 可能來(lái)源于APCC 的觀點(diǎn)。

原發(fā)性醛固酮增多癥的動(dòng)物模型

以上遺傳學(xué)研究極有助于理解原發(fā)性醛固酮增多癥的發(fā)病機(jī)制，明確了離子通道以及Wnt/β-連環(huán)素信號(hào)通路的重要作用。雖然小鼠模型并未能完全復(fù)制人原發(fā)性醛固酮增多癥的典型癥狀，但其在機(jī)制的深入研究、藥物的篩選研發(fā)中有著不可替代的作用。研究同樣發(fā)現(xiàn)鉀通道與Wnt/β-連環(huán)素信號(hào)通路在調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)醛固酮合成和穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。 在小鼠中， TASK1 和TASK3 是鉀通道的雙孔域蛋白，由KCNK3和KCNK9基因編碼合成。通過(guò)全身敲除這2 個(gè)基因， 研究明確了鉀通道在腎上腺皮質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中的重要作用， 敲除基因小鼠出現(xiàn)不同形式的醛固酮增多癥/低腎素性高血壓[35-37]。

如前述CACNA1H激活突變?cè)谌巳褐袑?dǎo)致FH-Ⅳ， 最新有研究利用規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）/CRISPR 相關(guān)蛋白9（Cas9）在小鼠中敲入M1560V 突變位點(diǎn)， 并同時(shí)研究CACNA1H基因敲除小鼠。結(jié)果顯示，突變小鼠醛固酮明顯升高，CYP11B2表達(dá)也明顯增加。 敲除小鼠的Ren1表達(dá)升高， 但是CYP11B2表達(dá)沒(méi)有改變。以上小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果是人群基因測(cè)序結(jié)果的有力補(bǔ)充，證明了CACNA1H胚系突變足以引起原發(fā)性醛固酮增多癥， 并且在Cav3.2 丟失后能通過(guò)激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)進(jìn)行功能代償[38]。

前述CLCN2突變是FH-Ⅱ的致病基因，2 種不同的基因敲入小鼠模型提供了有關(guān)氯離子通道在原發(fā)性醛固酮增多癥發(fā)展中的作用[39-40]。 敲除在ClC-2 氯離子通道失活區(qū)域的N 端8 個(gè)殘端，而人p.Met22Lys、p.Gly24Asp 和p.Tyr26Asn 突變均在該區(qū)域，可以使小鼠同樣出現(xiàn)高血壓、低血鉀癥、醛固酮升高和腎素水平降低，重現(xiàn)原發(fā)性醛固酮增多癥的主要特征。攜帶p.Arg180Gln 雜合突變的小鼠，與FH-Ⅱ中發(fā)現(xiàn)的人p.Arg172Gln 突變相似， 表現(xiàn)為輕度原發(fā)性醛固酮增多癥， 包括醛固酮水平升高，輕度血壓升高，但沒(méi)有導(dǎo)致腎上腺形態(tài)的異常。這些模型是研究FH-Ⅱ自主醛固酮產(chǎn)生機(jī)制有價(jià)值的工具。 此外，有研究利用人工突變模擬大部分原發(fā)性醛固酮增多癥相關(guān)的人CLCN2突變， 結(jié)果有力地支持了以下觀點(diǎn)，ClC-2 離子內(nèi)流增加足以導(dǎo)致原發(fā)性醛固酮增多癥，而不需其他額外突變相關(guān)的機(jī)制參與。