熱打擊誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞組織因子早期表達(dá)分泌的初步研究

錢晶，王凡凡，萬(wàn)露露，楊加樂(lè)，施學(xué)智，童華生*，周偉梁

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣東廣州 510000；2南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510000；3南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510000；4廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518000；5南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510000

近年來(lái)，全球極端氣候事件頻發(fā)，高溫日數(shù)增加，中暑的發(fā)病率隨之增長(zhǎng)。重癥中暑伴高熱、器官衰竭或嚴(yán)重代謝紊亂等常危及患者生命[1]，即使接受重癥監(jiān)護(hù)治療，患者病死率仍居高不下。尸檢結(jié)果顯示，重癥中暑死亡患者的多個(gè)器官均有廣泛血栓形成，嚙齒類及狒狒重癥中暑動(dòng)物模型體內(nèi)凝血激活，導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)及組織損傷[2-3]。即使治療及時(shí)，多數(shù)重癥中暑患者早期仍會(huì)出現(xiàn)多器官功能障礙，使長(zhǎng)期殘疾及死亡的風(fēng)險(xiǎn)上升。重癥中暑多器官損傷由組織直接熱損傷、凝血功能障礙及多因素誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)發(fā)展而來(lái)[4]，其器官損傷機(jī)制尚不完全清楚，凝血激活甚至DIC 可能是重癥中暑多器官損傷發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制，并與高病死率有關(guān)[4-6]。

重癥中暑凝血激活的啟動(dòng)機(jī)制目前仍不清楚。組織因子(tissue factor，TF)又名凝血因子Ⅲ(F3)，是一種細(xì)胞膜跨膜糖蛋白，也是凝血酶生成的主要啟動(dòng)因子[7]。TF 由多種細(xì)胞分泌至血液循環(huán)中可啟動(dòng)凝血激活[8]，在DIC的發(fā)生中發(fā)揮核心作用[9]。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞低水平表達(dá)TF，受不同刺激后可誘導(dǎo)TF表達(dá)增多[8]。Witkowski等[10]提出，血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分泌TF在凝血及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。嚴(yán)重感染及炎癥釋放的炎性因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生成TF，亦有體外實(shí)驗(yàn)佐證，TF介導(dǎo)凝血酶產(chǎn)生，使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，同時(shí)激活血小板釋放P-選擇素，促進(jìn)TF進(jìn)一步釋放[11]。此外，TF與凝血酶結(jié)合并激活不同細(xì)胞的蛋白酶激活受體(protease-activated receptors，PARs)，誘導(dǎo)更多細(xì)胞因子表達(dá)[12]。血管內(nèi)皮細(xì)胞TF參與炎癥反應(yīng)主要經(jīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而非激活凝血[13]。近年來(lái)，TF在炎癥及凝血反應(yīng)中的聯(lián)結(jié)樞紐功能日益得到研究者們的重視。

臨床病例分析及動(dòng)物疾病模型顯示，重癥中暑宿主體內(nèi)TF 上升，驗(yàn)證了TF 對(duì)重癥中暑誘發(fā)凝血反應(yīng)具有重要作用[3]。重癥中暑患者體內(nèi)的血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)及內(nèi)皮素增加，表明存在內(nèi)皮損傷[14-15]，但現(xiàn)有研究成果無(wú)法明確重癥中暑對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞本身的影響。TF是炎癥與凝血反應(yīng)的重要聯(lián)結(jié)，在被激活的單核細(xì)胞及受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面均有表達(dá)，但循環(huán)TF 的具體細(xì)胞來(lái)源尚不清楚[16]。重癥中暑作為一種劇烈的炎癥及凝血反應(yīng)狀態(tài)，TF 的表達(dá)分泌是否源自血管內(nèi)皮細(xì)胞更是未知。本研究通過(guò)建立體內(nèi)外熱打擊模型，初步探討熱打擊血管內(nèi)皮細(xì)胞TF早期表達(dá)分泌的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，細(xì)胞培養(yǎng)雙抗溶液(青霉素-鏈霉素溶液，美國(guó)HyClone 公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、彩色預(yù)染蛋白Marker(中國(guó)白鯊公司)。12.5%聚丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司)，兔TF 單抗(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，A4395)、兔TF 多抗(北京博奧森生物科技有限公司，bs-4690R)、山羊抗兔IgG DyLight?488(ab96899)及山羊抗兔IgG(ab97080)購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，GAPDH 單克隆抗體(美國(guó)Proteintech 公司，60004-1-Ig)，山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZB-2305)。含DAPI 抗熒光衰減封片劑(北京索萊寶科技有限公司)。去除基因組DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)專用反轉(zhuǎn)錄試劑(日本TaKaRa 公司，RR047A)，SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司，AG11701)，Rotor-Gene RT-qPCR 儀(德國(guó)Qiagen 公司)。人TF 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、小鼠TF ELISA試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司)。三氣培養(yǎng)箱(上海力新儀器有限公司)，動(dòng)物專用培養(yǎng)箱(寧波戴維醫(yī)療器械有限公司)，動(dòng)物專用體溫計(jì)(中國(guó)康寧公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)，熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Leica 公司)，臺(tái)式離心機(jī)(日本Kubota公司)，高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只8～12周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠(體重20～25 g)購(gòu)自廣州南方醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展有限公司[動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(粵)2021-0041]。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水，飼養(yǎng)于安靜、恒溫、恒濕的潔凈環(huán)境，12 h 光照及12 h 黑暗交替變化，使用動(dòng)物專用測(cè)溫計(jì)測(cè)量核心體溫。本實(shí)驗(yàn)獲南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(動(dòng)物倫理審查編號(hào)：2021111801)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家及單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理及使用規(guī)定。

1.2.2 熱打擊小鼠模型建立 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將30 只C57BL/6 小鼠分為5 組：對(duì)照組與熱打擊后復(fù)溫0、3、6、9 h 組(n=6)。熱打擊前30 min 小鼠禁食禁水。動(dòng)物專用孵箱溫度設(shè)置為39 ℃，相對(duì)濕度為60%，將熱打擊組小鼠放入達(dá)到熱打擊條件的孵箱內(nèi)，每隔15 min 測(cè)量小鼠核心體溫，達(dá)42.5 ℃時(shí)即認(rèn)為發(fā)生重癥中暑[17]。將小鼠移出孵箱，復(fù)溫3、6、9 h組小鼠置于原正常飼養(yǎng)環(huán)境，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2.3 器官組織切片HE染色 熱打擊造模完成后采血，頸椎脫臼法處死小鼠，立即解剖留取肝、腎及肺組織，使用4%多聚甲醛固定，脫水、包埋制成石蠟塊后切片，并進(jìn)行HE染色，正置光學(xué)顯微鏡下觀察各組織病理學(xué)改變并拍照。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)器官TFmRNA相對(duì)表達(dá)水平取肝臟、肺臟及腎臟組織(10～25 mg)置于潔凈EP管，徹底剪碎組織，加入1 ml Trizol吹打混勻，直至無(wú)肉眼可見大顆粒組織塊，靜置5～10 min，Trizol 法提取組織總RNA。測(cè)定RNA 濃度后用RR047A 試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用AG11701 試劑盒配制反應(yīng)體系，在實(shí)時(shí)定量PCR儀上機(jī)完成qPCR反應(yīng)。每管反應(yīng)體系為20 μl，包含10 μl 2×qPCR試劑、2 μl cDNA模板、0.4 μl 引物F(10 μmol/L)、0.4 μl 引物R(10 μmol/L)、7.2 μl DEPC水。實(shí)時(shí)定量PCR儀反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃擴(kuò)增延伸反應(yīng)40 s，重復(fù)40次循環(huán)。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。采用2-ΔΔCt法計(jì)算TFmRNA 表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 小鼠組織RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR Primer sequence for mouse tissues

1.2.5 ELISA法檢測(cè)小鼠血漿TF水平 腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠，摘除眼球取血法采集小鼠血液樣本，置于含EDTA 的EP 管，在室溫下以3000 r/min 離心15 min，收集上層血漿，使用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血漿TF水平。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及體外熱打擊刺激 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，使用DMEM 高糖培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清及1%雙抗)。將細(xì)胞分為對(duì)照組與熱打擊復(fù)溫0、3、6、9 h 組，將HUVECs 置于42 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中3 h進(jìn)行熱打擊，結(jié)束后立即轉(zhuǎn)移至常規(guī)培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中復(fù)溫。

1.3.2 細(xì)胞總蛋白及細(xì)胞培養(yǎng)上清蛋白提取 收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清。使用足量4 ℃預(yù)冷蛋白裂解液在冰上充分裂解細(xì)胞，10 000 r/min離心20 min后提取細(xì)胞總蛋白。將細(xì)胞培養(yǎng)上清以3000 r/min離心5 min，采用三氯乙酸沉淀蛋白法提取細(xì)胞培養(yǎng)上清蛋白[18]，用適量蛋白裂解液將蛋白沉淀重懸成蛋白溶液保存。

1.3.3 Western blotting 檢測(cè)HUVECs 中TF 的表達(dá)水平 采用BCA 法檢測(cè)細(xì)胞裂解蛋白溶液及細(xì)胞培養(yǎng)上清蛋白提取溶液中的蛋白濃度，取蛋白樣品溶液，加入1/4 體積的蛋白上樣緩沖液(5×)混勻后，100 ℃加熱5 min 使蛋白變性。12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(A4395)孵育過(guò)夜、二抗(ab97080)孵育、洗膜及顯影。

1.3.4 ELISA 檢測(cè)HUVECs 培養(yǎng)上清中TF 濃度 將細(xì)胞培養(yǎng)上清以1000×g離心10 min，采用ELISA 法檢測(cè)HUVECs培養(yǎng)上清中的TF濃度。

1.3.5 RT-qPCR 檢測(cè)HUVECs 中TFmRNA 的表達(dá)水平 采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，RT-qPCR 法測(cè)定TFmRNA的相對(duì)表達(dá)水平，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表2。

表2 人類細(xì)胞RT-qPCR引物序列Tab.2 Human cellular RT-qPCR Primer sequence

1.3.6 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)HUVECs 細(xì)胞膜表面TF表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)前于35 mm玻底培養(yǎng)皿接種細(xì)胞，熱打擊后棄培養(yǎng)基，使用4 ℃預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞3 次，使用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛在冰上固定細(xì)胞30 min 后洗滌，依次進(jìn)行抗原封閉、一抗(bs-4690R)孵育過(guò)夜、熒光二抗(ab96899)避光孵育，使用含DAPI抗熒光衰減封片劑染核，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠不同器官TFmRNA表達(dá)水平比較 相較于對(duì)照組小鼠，熱打擊復(fù)溫0、3 h 組的腎TFmRNA (1.719±0.018、1.241±0.178vs.1.000±0.063)、復(fù)溫3 h 組的肺TFmRNA (2.444±0.511vs.1.000±0.106)及復(fù)溫6 h 組的肝TFmRNA (7.312±0.618vs.1.000±0.147)相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腎及肺TFmRNA 表達(dá)量在熱打擊結(jié)束時(shí)即出現(xiàn)上調(diào)，肝TFmRNA表達(dá)量在復(fù)溫6 h時(shí)明顯上調(diào)(圖1)。

圖1 各組小鼠腎(A)、肺(B)及肝(C)組織TF mRNA表達(dá)量比較(n=3)Fig.1 Comparison of TF mRNA expression levels in kidney (A), lung (B), and liver (C) tissues of mice in each group (n=3)

2.2 各組小鼠血漿TF水平比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，熱打擊小鼠復(fù)溫0、3、6、9 h組血漿TF水平均較對(duì)照組小鼠升高[(132.426±17.920) pg/ml、(119.400±10.267) pg/ml、 (107.374±13.495)pg/ml、 (163.767±22.810) pg/mlvs.(75.479±13.831) pg/ml，P<0.01]，盡管復(fù)溫3、6 h小鼠血漿TF水平有所下降，但熱打擊組小鼠整體血漿TF水平仍高于對(duì)照組(圖2)。

圖2 各組小鼠血漿TF含量比較(n=6)Fig.2 Comparison of plasma TF content in each group of mice (n=6)

2.3 各組小鼠器官組織病理學(xué)觀察 對(duì)照組小鼠各組織未見明顯病理?yè)p傷。熱打擊組小鼠肺、腎、肝均出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)破壞、出血及炎癥表現(xiàn)。重癥中暑(即復(fù)溫0 h組)小鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)部均存在出血現(xiàn)象，腎間質(zhì)小血管及毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，有充血出血、血栓形成，腎間質(zhì)紅細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球結(jié)構(gòu)有破壞(圖3A)。重癥中暑小鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)支氣管及終末細(xì)支氣管結(jié)構(gòu)破壞、出血性滲出增多，上皮組織壞死脫落，血管周圍、肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)增多，復(fù)溫6、9 h 組小鼠肺泡隔明顯變細(xì)(圖3B)。重癥中暑小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯，有淤血征象，光鏡下可見肝小葉中央靜脈及肝竇擴(kuò)張充血，有紅細(xì)胞充斥其間，肝細(xì)胞受壓萎縮，肝索變細(xì)(圖3C)。

2.4 體外熱打擊HUVECs持續(xù)表達(dá)分泌TF Western blotting 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，熱打擊HUVECs不同復(fù)溫時(shí)長(zhǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)上清能穩(wěn)定持續(xù)檢測(cè)出TF，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清中未檢測(cè)出TF，提示熱打擊誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞TF 胞外分泌可能(圖4A)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，熱打擊HUVECs復(fù)溫0、3、6、9 h 組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TF 含量均明顯高于對(duì)照組[(36.309±4.101) pg/ml、(38.425±5.484) pg/ml、(41.655±4.380) pg/ml、 (43.586±4.718) pg/mlvs.(14.996±0.254) pg/ml，P<0.01，圖4B]。

圖4 各組HUVECs表達(dá)分泌TF水平比較Fig.4 Comparison of TF levels expressed and secreted by HUVECs in each group

細(xì)胞免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組HUVECs 細(xì)胞膜表面TF 熒光強(qiáng)度較弱，符合TF 在正常生理情況下的表達(dá)水平(圖5A)。熱打擊HUVECs 復(fù)溫0、3、6、9 h 組細(xì)胞膜表面TF 相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(3.733±0.419、2.210±0.235、2.618±0.081、 4.636±0.373vs.1.000±0.214，P<0.01)，即熱打擊使HUVECs細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)性表達(dá)TF增強(qiáng)(圖5B)。

圖5 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè)HUVECs細(xì)胞膜表面TF表達(dá)Fig.5 Cellular immunofluorescence chemical detection of TF expression on HUVECs cytomembrane surface

2.5 各組HUVECs的TFmRNA表達(dá)水平比較 提取熱打擊HUVECs 的mRNA 進(jìn)行RT-qPCR 分析結(jié)果顯示，熱打擊復(fù)溫6、9 h 組的TFmRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(1.905±0.354、2.564±0.297vs.1.000±0.097，P<0.01，圖6)。

圖6 RT-qPCR檢測(cè)HUVECs中TF mRNA表達(dá)(n=3)Fig.6 RT-qPCR detection of TF mRNA expression in HUVECs(n=3)

3 討 論

重癥中暑具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的“三高”特征，被認(rèn)為是最危險(xiǎn)的熱相關(guān)疾病，DIC作為該疾病的常見伴隨高危事件，其病理機(jī)制的研究是攻克重癥中暑治療難題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。研究顯示重癥中暑DIC的發(fā)生發(fā)展與TF的表達(dá)分泌存在關(guān)聯(lián)，探索TF 的來(lái)源及作用是闡明重癥中暑DIC發(fā)病機(jī)制的研究基礎(chǔ)。

本研究中，重癥中暑小鼠多組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)及凝血障礙；重癥中暑早期小鼠多組織TFmRNA表達(dá)增加，且其循環(huán)內(nèi)TF水平明顯升高；熱打擊血管內(nèi)皮細(xì)胞膜內(nèi)TF表達(dá)分泌增加，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是重癥中暑TF分泌的潛在來(lái)源之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑小鼠組織發(fā)生出血性及炎性損傷，呈現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、出血及血栓形成，一定程度上符合既往研究中重癥中暑導(dǎo)致多器官?gòu)V泛出血及血栓形成的DIC病理特征[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑組織炎癥反應(yīng)及凝血障礙與TF表達(dá)分泌增加有關(guān)[19-20]。Huisse 等[20]在2003 年巴黎熱浪期重癥中暑臨床病例中發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)循環(huán)TF 水平升高。Roberts 等[19]在重癥中暑狒狒的血液及組織中均檢測(cè)出TF 含量明顯上升，并與細(xì)胞凋亡相關(guān)，提示TF是重癥中暑凝血反應(yīng)啟動(dòng)的潛在重要因素。本研究采用重癥中暑小鼠模型進(jìn)一步證實(shí)了多組織TFmRNA 表達(dá)增加，血漿分泌TF 增加。此外，Bouchama 等[4]在重癥中暑狒狒模型中發(fā)現(xiàn)，重組線蟲抗凝蛋白c2(組織因子/凝血因子Ⅶ抑制劑)明顯改善了重癥中暑動(dòng)物凝血紊亂狀態(tài)，進(jìn)一步提示TF在重癥中暑凝血紊亂中發(fā)揮作用。

血液循環(huán)中TF的潛在來(lái)源廣泛，不同疾病患者體內(nèi)TF的來(lái)源各不相同[21]。Franco等[22]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素血癥患者血細(xì)胞(主要為單核細(xì)胞)TFmRNA 及蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與高水平凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(凝血激活標(biāo)志物)有關(guān)。膿毒癥狒狒的脾臟及主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、膿毒癥小鼠的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)TF，血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源TF可能也在膿毒癥凝血中發(fā)揮了作用[23]。脂多糖體內(nèi)外刺激單核細(xì)胞及HUVECs 均可誘導(dǎo)TF表達(dá)，單核細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞被看作是內(nèi)毒素血癥TF 的兩個(gè)最有可能的來(lái)源[11]。目前重癥中暑表達(dá)分泌TF的細(xì)胞來(lái)源尚不十分清楚。體外熱打擊細(xì)胞模型顯示，熱打擊后不同復(fù)溫時(shí)間HUVECs 的TFmRNA 表達(dá)均有不同程度上調(diào)；細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè)表明，HUVECs 細(xì)胞膜表面TF的熒光強(qiáng)度持續(xù)升高。本研究還發(fā)現(xiàn)熱打擊HUVECs后，細(xì)胞培養(yǎng)上清分泌TF明顯增加，提示熱打擊可能誘導(dǎo)細(xì)胞中TF向分泌形式轉(zhuǎn)化，并可分泌至細(xì)胞外，由此推測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是重癥中暑TF表達(dá)分泌的重要來(lái)源。

熱打擊基于何種機(jī)制誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌型TF 的表達(dá)轉(zhuǎn)化是下一步研究的關(guān)鍵。Wu 等[24]提出蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)及p38在人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞TF的誘導(dǎo)表達(dá)分泌中發(fā)揮關(guān)鍵作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基于兩種途徑誘導(dǎo)HUVECs 中TF 的表達(dá)[7]，剪切力激活HUVECs 中早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1(early growth response protein 1，Egr-1)誘導(dǎo)TF 表達(dá)上調(diào)[25]。多項(xiàng)研究表明，不同刺激誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)TF均基于核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)[26-28]。然而熱打擊誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)分泌的分子機(jī)制尚未見報(bào)道，也是本文的局限性所在。

綜上所述，本研究中重癥中暑小鼠多組織存在炎癥及凝血特征性病理?yè)p傷，驗(yàn)證了組織及循環(huán)TF可能參與該病理?yè)p傷過(guò)程。體外熱打擊可能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞TF 向分泌型轉(zhuǎn)變，TF 分泌增加，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是重癥中暑TF的來(lái)源之一。探討熱打擊血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分泌TF的分子機(jī)制及有關(guān)調(diào)控措施將是未來(lái)研究的重點(diǎn)。