血必凈注射液抑制肺血管內(nèi)皮糖萼降解改善重癥中暑大鼠急性肺損傷

丁程佳，陀勁，曹晶晶，黃潔恩，劉超帆，童華生，陳懌*

1東莞市濱海灣中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東東莞 523900；2深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院，廣東深圳 518000；3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510632；4南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院急診科，廣東廣州 510632

中暑是繼發(fā)于熱應(yīng)激之后的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，?？蛇M(jìn)展至多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1-2]。隨著全球氣候變暖，重癥中暑的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，其病死率可達(dá)20%～70%，即便存活者也有30%存在神經(jīng)等系統(tǒng)后遺癥[3-6]。呼吸系統(tǒng)是中暑常見的首發(fā)打擊器官，常表現(xiàn)為急性肺損傷[7]，加之血管通透性增加、液體復(fù)蘇不當(dāng)?shù)纫蛩兀s45%的中暑患者會出現(xiàn)肺水腫并進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[8]。目前研究認(rèn)為，繼發(fā)于血管內(nèi)皮損傷的器官組織微循環(huán)障礙及異常激活的炎性細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)，不僅會導(dǎo)致組織器官的缺血缺氧及代謝障礙，更可進(jìn)一步惡化并加劇器官功能障礙[9-11]。

血管內(nèi)皮糖萼是位于血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔面細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物，是血管內(nèi)皮表面的重要結(jié)構(gòu)，對維持內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定、防止炎性細(xì)胞黏附、調(diào)控血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞、維護(hù)血管壁屏障功能完整、調(diào)節(jié)微循環(huán)血流及抑制血栓形成等均具有重要作用[12-14]。Schmidt 等[13]證實(shí)，在膿毒癥肺損傷中異常釋放的乙酰肝素酶可導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮糖萼迅速變薄，同時暴露細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)等黏附分子，多個黏附分子協(xié)同作用導(dǎo)致炎性細(xì)胞內(nèi)流，進(jìn)一步加劇急性肺損傷，重癥中暑后炎癥細(xì)胞活性異常與肺血管內(nèi)皮糖萼損傷的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。血必凈注射液具有抑制炎性介質(zhì)釋放、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能、減少促炎因子分泌等作用。在膿毒癥、重癥肺炎及毛細(xì)血管滲漏綜合征的研究中，血必凈注射液具有良好的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，且能減輕炎性反應(yīng)，降低MODS 發(fā)生率[15-18]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立重癥中暑大鼠模型模擬中暑后的病理生理過程，觀察大鼠肺組織病理變化、肺水腫及肺毛細(xì)血管滲漏情況，檢測肺血管內(nèi)皮糖萼損傷及炎癥反應(yīng)異常激活情況，分析血必凈對中暑打擊后肺血管內(nèi)皮糖萼及急性肺損傷可能的保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 健康雄性成年SPF 級Wistar 大鼠48 只，體重220～250 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。喂養(yǎng)于溫度(22±1) ℃及濕度50%±5%的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)前禁食2 h、禁水6 h。本實(shí)驗(yàn)動物處置流程獲得東莞市濱海灣中心醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(審批號：2016022)，符合單位及國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物的管理及使用規(guī)定。BCA 蛋白濃度測定試劑盒(P0012，上海碧云天公司)；伊文思藍(lán)(EB，E2129，德國Merck 公司)；大鼠透明質(zhì)酸(HA)抗體(ab182009，英國Abcam 公司)；大鼠多配體蛋白聚糖-1(Syndecan-1，bs-1309R)、大鼠磷脂酰肌醇聚糖-1(Glypican-1，bs-2426R)、大鼠血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VECadherin，bs-4310R)、大鼠緊密連接蛋白(Occludin，bs-10011R)、大鼠VCAM-1(bs-0396R)、大鼠E-選擇素(E-selectin，bs-1273R)抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α，KRC3011)、白細(xì)胞介素-6(IL-6，ERA31RB)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒購自美國Thermo 科技公司；大鼠乙酰肝素酶(HPA) ELISA 試劑盒(MM-70424R1)購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 模型建立及分組 將大鼠隨機(jī)分為對照組、中暑組及血必凈組，每組16只，其中8只用于EB濃度測定。血必凈組大鼠于造模前連續(xù)3 d尾靜脈注射血必凈注射液(2 ml/kg，2 次/d)。對照組大鼠置于室溫24 ℃環(huán)境下觀察100 min，中暑組、血必凈組大鼠置于人工氣候艙內(nèi)[溫度(40±2) ℃、濕度65%±5%]接受高溫高濕打擊60 min，制備經(jīng)典中暑模型，當(dāng)肛溫達(dá)到42.0 ℃時中止熱打擊。各組大鼠于造模后2 h行麻醉處理并取材備用。

1.3 方法

1.3.1 肺濕/干重比 取大鼠右肺上葉稱重記錄，置于80 ℃烘箱48 h后取出稱重記錄，計算肺濕/干重比(濕重/干重)。

1.3.2 肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid，BALF)蛋白濃度檢測 取大鼠左肺，經(jīng)左主支氣管進(jìn)行肺泡灌洗獲得BALF，離心取上清液，采用BCA法測定BALF蛋白濃度。

1.3.3 EB染色檢測大鼠肺血管通透性[19]以2 ml/kg劑量自各組大鼠尾靜脈注入2% EB 染料，2 h 后經(jīng)左心室注入10 ml PBS液，沖出循環(huán)系統(tǒng)中殘留的EB染料，取肺組織稱重，將肺組織與甲酰胺按照0.1 g∶1 ml 的比例浸泡萃取，用分光光度計在620 nm 波長處進(jìn)行比色，測量光密度(OD)值。另取大鼠肺組織，采用BCA法測定組織蛋白濃度。以上清中EB的OD 值與蛋白濃度的比值作為肺血管通透性的測定值。

1.3.4 肺組織病理學(xué)觀察 將右肺中葉固定后，行HE染色，隨機(jī)編碼，由病理學(xué)醫(yī)師盲法進(jìn)行病理損傷評分，具體標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[20]，根據(jù)炎性浸潤、肺水腫及肺泡出血等病理損傷程度，分別給予0～3分(輕度、中度、重度)賦值。每個玻片觀察10 個視野，記錄其平均值。

1.3.5 免疫熒光染色觀察肺組織HA 表達(dá)水平 肺組織石蠟包埋后切片，60 ℃烘烤20 min 后，用二甲苯及乙醇脫蠟；3% BSA 封閉2 h；PBS 稀釋抗體500倍后孵育過夜；用PBS洗滌一抗后，熒光二抗染色；洗滌二抗后，用含DAPI的封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察HA的表達(dá)水平。

1.3.6 Western blotting 檢 測 肺 組 織Syndecan-1、Glypican-1、 VE-Cadherin、 Occludin、 VCAM-1 及E-selectin 的表達(dá)水平 肺組織經(jīng)裂解、轉(zhuǎn)膜后，加入Syndecan-1、Glypican-1、VE-Cadherin、Occludin、VCAM-1及E-selectin等抗體孵育、洗膜及定影，利用凝膠成像分析儀分析，以目標(biāo)條帶與β-actin 內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.7 ELISA法測定肺組織TNF-α、IL-6及HPA的表達(dá)水平 參照試劑盒說明書，采用ELISA 法測定肺組織勻漿上清中TNF-α、IL-6 及HPA 的表達(dá)水平。以空白孔調(diào)零，反應(yīng)終止后于450 nm 波長處測定OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算各炎性因子的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較，若方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血必凈對中暑后大鼠肺血管通透性的影響 與對照組比較，中暑組大鼠肺濕/干重比(5.38±0.37vs.4.15±0.15)、BALF 蛋 白 濃 度[(0.83±0.15) mg/mlvs.(0.41±0.07) mg/ml]及EB 含量[(6.78±1.37) OD/mgvs.(2.43±0.73) OD/mg]均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，血必凈組大鼠肺組織中肺濕/干重比(4.74±0.21)、BALF 蛋白濃度[(0.57±0.11) mg/ml]及EB 含量[(4.89±1.21) OD/mg]均低于中暑組，但仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1 各組大鼠肺濕/干重比、BALF蛋白濃度及肺血管通透性比較(n=8)Fig.1 Comparison of wet to dry lung weight ratio, BALF protein concentration and pulmonary vascular permeability in rats of each group(n=8)

2.2 血必凈對中暑后大鼠肺組織損傷的影響 HE染色顯示，對照組大鼠可見正常肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡無滲出或出血，肺間質(zhì)無充血、水腫或炎癥浸潤；中暑組大鼠肺組織可見彌漫性肺泡滲出，肺間質(zhì)腫脹增厚伴大量炎性細(xì)胞浸潤，局部血栓形成；血必凈組大鼠肺組織可見肺間質(zhì)滲出及炎性浸潤，肺泡出血、淤血等病理性改變減少。肺組織病理損傷評分結(jié)果顯示，中暑組的肺組織損傷評分明顯高于對照組(9.75±1.49vs.0.63±0.52)，而血必凈為(5.87±1.2)分，低于中暑組，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化及病理損傷評分比較Fig.2 Comparison of pathological changes and pathological scores of lung injury in rats of each group

2.3 血必凈對中暑后大鼠肺血管內(nèi)皮損傷的影響中暑組大鼠肺組織中HA、Syndecan-1及Glypican-1蛋白表達(dá)水平分別為0.50±0.19、0.23±0.03、0.31±0.02，均低于對照組(分別為0.98±0.25、0.56±0.09、0.76±0.08)，血必凈組分別為0.75±0.20、0.35±0.06、0.53±0.05，高于中暑組，但仍低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖3 各組大鼠肺組織中HA、Syndecan-1及Glypican-1蛋白表達(dá)水平比較(n=8)Fig.3 Comparison of the protein expression levels of HA, Syndecan-1 and Glypican-1 in the lung tissues of rats in each group (n=8)

2.4 血必凈對內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白VE-Cadherin、Occludin、VCAM-1 及E-selectin 表達(dá)的影響 與對照組比較，中暑組肺組織中VE-Cadherin、Occludin 蛋白表達(dá)水平降低(0.32±0.02vs.0.61±0.06，0.30±0.02vs.0.72±0.07，P<0.01)，血必凈組大鼠肺組織中VECadherin、Occludin 蛋白表達(dá)水平分別為0.47±0.05、0.53±0.05，高于中暑組，但低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，中暑組肺組織中VCAM-1、E-selectin 蛋白表達(dá)水平增高(0.52±0.06vs.0.11±0.01，0.57±0.05vs.0.13±0.02，P<0.01)，血必凈組大鼠肺組織中VCAM-1、E-selectin蛋白表達(dá)水平分別為0.21±0.03、0.32±0.03，低于中暑組，但高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

圖4 各組大鼠肺組織內(nèi)皮連接蛋白、黏附蛋白表達(dá)水平比較(n=8)Fig.4 Comparison of VE-Cadherin, Occludin, VCAM-1 and E-selectin protein expression levels in lung tissues of rats in each group (n=8)

2.5 血必凈對血清中炎性因子TNF-α、IL-6 及肺組織中HPA 的影響 與對照組比較，中暑組大鼠血清中TNF-α、IL-6 表達(dá)水平升高[(148.07±11.39) ng/mlvs.(14.33±5.11) ng/ml，(178.29±9.75) ng/mlvs.(9.73±4.17) ng/ml，P<0.01]，血必凈組大鼠血清中TNF-α、IL-6 表 達(dá) 水 平 分 別 為(84.27±13.35) ng/ml、(108.87±11.91) ng/ml，均低于中暑組，但高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，中暑組大鼠肺組織中HPA 表達(dá)水平異常增高[(463.74±20.19) ng/mlvs.(250.07±13.74) ng/ml，P<0.01]，血必凈組大鼠肺組織中HPA 蛋白表達(dá)水平為(347.89±19.93) ng/ml，低于中暑組，但高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖5)。

圖5 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6及肺組織中HPA蛋白含量比較(n=8)Fig.5 Comparison of serum TNF-α, IL-6 and HPA protein content in lung tissues of rats in each group (n=8)

3 討 論

隨著氣候變暖及熱浪襲擊，全球范圍內(nèi)中暑的發(fā)病率日益增高。重度中暑又稱為熱射病，在熱相關(guān)性疾病中死亡率占據(jù)首位[21]。中暑極易并發(fā)肺損傷，目前報道重癥中暑并發(fā)ARDS 的比例高達(dá)23%，一旦發(fā)生ARDS，病死率可達(dá)75%[22]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是重癥中暑的特征性病理改變，其與SIRS 相輔相成，進(jìn)而引發(fā)全身重要組織及器官損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，中暑誘發(fā)急性肺損傷的主要發(fā)病機(jī)制包括啟動并放大炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，造成廣泛的微血管損傷及炎癥浸潤，促進(jìn)肺組織細(xì)胞的凋亡，上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞促炎受體表達(dá)及炎癥分泌活性等[23-25]。血必凈可緩解中暑誘發(fā)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及凋亡而實(shí)現(xiàn)肺保護(hù)[23]，還具有糾正中暑后微循環(huán)灌注障礙[11]并緩解血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等作用[26-27]。因此，本研究計劃運(yùn)用血必凈注射液防治重癥中暑急性肺損傷，并從血管內(nèi)皮糖萼保護(hù)的角度出發(fā)，在組織學(xué)改變，毛細(xì)血管滲漏，肺血管內(nèi)皮糖萼結(jié)構(gòu)標(biāo)志物、肺血管內(nèi)皮連接蛋白及黏附分子、乙酰肝素酶的表達(dá)等方面驗(yàn)證該藥物的肺保護(hù)效果。

目前認(rèn)為，肺血管內(nèi)皮急性損傷是ALI/ARDS發(fā)病的細(xì)胞基礎(chǔ)，肺血管內(nèi)皮糖萼降解不僅增加了肺毛細(xì)血管的通透性，形成以大量蛋白質(zhì)滲出為主的肺水腫[28]，還可明顯提高肺毛細(xì)血管對炎性細(xì)胞的變形及黏附能力，繼而引發(fā)肺血管通透性增高及炎性細(xì)胞浸潤[29-32]，在肺組織中形成“瀑布式”的炎癥級聯(lián)反應(yīng)[33]。本研究中，重癥中暑后大鼠肺濕/干重比及肺泡灌洗液蛋白濃度明顯升高，結(jié)合EB測定結(jié)果，均證實(shí)重癥中暑可使肺血管通透性明顯提高，而血必凈干預(yù)可有效保護(hù)肺血管的完整性。光鏡觀察顯示，重癥中暑后大鼠肺組織呈現(xiàn)出彌漫性肺泡出血、肺間質(zhì)增厚伴大量炎性細(xì)胞浸潤，同時有大量局部血栓形成，提示該動物模型肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重。HA、Syndecan、Glypican作為血管內(nèi)皮糖萼的主要成分，是血管內(nèi)皮糖萼損傷的經(jīng)典標(biāo)志物[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑后，HA、Syndecan-1、Glypican-1在肺組織中的表達(dá)明顯減少，提示存在血管內(nèi)皮糖萼損傷，而血必凈注射液有一定的抑制其降解的作用。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮糖萼損傷的下一階段就是血管內(nèi)皮連接蛋白及黏附分子的表達(dá)異常[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)，中暑組的連接蛋白VE-Cadherin 及Occludin 表達(dá)明顯降低，VCAM-1 及E-selectin 等黏附分子表達(dá)明顯增高，而血必凈可明顯減輕上述標(biāo)志物表達(dá)水平的改變，這可能是血必凈保護(hù)重癥中暑肺損傷的作用機(jī)制。為了驗(yàn)證以血管內(nèi)皮糖萼崩解所啟動的肺血管內(nèi)皮功能障礙與肺組織炎癥反應(yīng)之間的聯(lián)系，本研究測定了血清中TNF-α 及IL-6 的濃度，發(fā)現(xiàn)中暑組的TNF-α 及IL-6 分泌明顯增加，而血必凈同樣呈現(xiàn)出良好的抑制炎癥反應(yīng)的作用。另一方面，中暑后形成“瀑布式”的炎癥級聯(lián)反應(yīng)可直接損傷血管內(nèi)皮糖萼，同時促進(jìn)HPA的活化，加速糖萼的降解[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑后肺組織HPA 表達(dá)明顯上調(diào)，與炎性介質(zhì)表達(dá)水平的波動相關(guān)，提示血管內(nèi)皮糖萼損傷觸發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能活性異常、凝血異常與炎癥反應(yīng)互為因果、相輔相成，形成類似一種正反饋調(diào)節(jié)的閉環(huán)，推動了重癥中暑從最初熱的應(yīng)激向全身組織及臟器損傷的方向發(fā)生發(fā)展[33,37]。

血必凈注射液是王金達(dá)教授以王清任的血府逐瘀湯為基礎(chǔ)、結(jié)合“菌、毒、炎”并治理論所研制的靜脈制劑，其具有抗炎癥、抗氧化、調(diào)理免疫及改善凝血等功效[38-39]。有研究發(fā)現(xiàn)，血必凈注射液可緩解中暑誘發(fā)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及凋亡而實(shí)現(xiàn)肺保護(hù)[23]，還能糾正中暑后的微循環(huán)灌注障礙[26]，緩解血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[40]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，中暑后失衡的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致HPA 過表達(dá)，肺血管內(nèi)皮糖萼受損是重癥中暑急性肺損傷的潛在機(jī)制，而血必凈具有減少HPA、改善糖萼崩解、修復(fù)肺血管完整性、減輕細(xì)胞連接損傷、下調(diào)黏附分子表達(dá)并抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而緩解重癥中暑所致急性肺損傷的作用。本研究也存在一定局限性，如缺乏體外實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)與本研究結(jié)論的相互驗(yàn)證，同時本研究采用血必凈干預(yù)是在造模前，對其發(fā)病后的治療效果尚需要通過后續(xù)研究驗(yàn)證。