銀杏內(nèi)酯K調(diào)節(jié)AMPK/mTOR/ULK1信號通路對乳腺癌細(xì)胞自噬和凋亡的影響*

時延龍 周鵬 王雪凱 郭煜

(1.解放軍第960醫(yī)院腫瘤科,山東 濟(jì)南 250031;2.解放軍第960醫(yī)院甲狀腺乳腺外科,山東 濟(jì)南 250031;3.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,山東 青島 266000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率居于女性癌癥之首,其治療方式包括內(nèi)分泌、手術(shù)、放化療以及靶向治療[1-3]。其中化療是最重要的治療策略之一,雖然效果顯著,但會對患者造成損傷,影響預(yù)后[4],因此尋找預(yù)防或治療乳腺癌的藥物至關(guān)重要。銀杏內(nèi)酯 K(ginkgolide K,GK)常作為治療人類心血管疾病的天然藥物但其在治療癌癥中鮮有報(bào)道[5-6]。AMPK是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量和代謝的關(guān)鍵因子,通過調(diào)節(jié)多種下游信號分子誘導(dǎo)自噬,參與腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展[7-8]。因此本研究旨在探討GK通過AMPK/mTOR/ULK1信號通路對乳腺癌細(xì)胞自噬和凋亡的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 ATCC提供MCF-7細(xì)胞。將細(xì)胞置于10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中,并培養(yǎng)于溫度為37 ℃,濕度為5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.2 主要材料 GK購自上海研生實(shí)業(yè)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技有限公司;MCE公司提供AMPK抑制劑-Compound C;Sigma提供吖啶橙(AO)染色液;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自銳賽生物有限公司;CCK-8試劑盒購自智杰方遠(yuǎn)科技有限公司;ECL發(fā)光檢測試劑盒購自翌圣生物科技有限公司;Abcam公司提供AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1一抗。

1.3 細(xì)胞分組及處理 取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞,依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分組為對照組、GK低濃度(GK-L)組、GK中濃度(GK-M)組、GK高濃度(GK-H)組、GK-H+Compound C組,其中GK-L、GK-M、GK-H組分別以12.5、25、50 μg/mL GK處理細(xì)胞[9];GK-H+Compound C組分別以50 μg/mL GK、50 μmol/L Compound C同時處理細(xì)胞[10];對照組不作任何處理。

1.4 觀察各組細(xì)胞形態(tài) 將MCF-7細(xì)胞(1×105個細(xì)胞/mL)接種到12孔板中,按照上述分組,并繼續(xù)培養(yǎng)48h后拍攝圖像,在×200倍的光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)變化。

1.5 檢測細(xì)胞增殖 將MCF-7細(xì)胞以5×104個/mL密度接種到96孔板中。細(xì)胞附著后,將上述各組細(xì)胞分別培養(yǎng)0、24、48 h時,加入CCK-8(10 μL,5 mg/mL),孵育2.5 h。用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度(OD)值。

1.6 檢測細(xì)胞凋亡 收獲MCF-7細(xì)胞并用PBS洗滌兩次,重新懸浮細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI染色液,避光孵育。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.7 LC3、P62、Beclin1 mRNA表達(dá)水平 TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以獲取cDNA,使用熒光定量試劑盒對LC3、P62、Beclin1進(jìn)行實(shí)時PCR。以GAPDH為內(nèi)參,通過2-ΔΔCT方法計(jì)算LC3、P62、Beclin1 mRNA的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 AO染色檢測細(xì)胞自噬 將MCF-7細(xì)胞以5×104個/mL密度接種到24孔板中,每孔加入100 μL AO染色液,避光染色1 min。經(jīng)PBS洗滌后,拍照觀察細(xì)胞自噬。

1.9 Western blot檢測AMPK/mTOR/ULK1通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞,用冷PBS沖洗兩次,并用RIPA緩沖液在冰上裂解30 min,SDS-PAGE分離等量蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移PVDF膜上,牛奶封閉3 h,將膜與AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、LC3、P62、Beclin1一抗4 ℃下孵育過夜,室溫下與二抗孵育1 h,Image軟件分析目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)比較 GK-L組、GK-M組、GK-H組較對照組MCF-7細(xì)胞逐漸出現(xiàn)皺縮,數(shù)量減少,以GK-H組變化較為明顯;GK-H+Compound C組較GK-H組細(xì)胞貼壁性增強(qiáng),數(shù)量增多。見圖1。

圖1 光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)(200×)

2.2 細(xì)胞增殖率、凋亡率比較 GK-L組、GK-M組、GK-H組增殖率較對照組降低,但凋亡率增加(P<0.05);GK-H+Compound C組增殖率較GK-H組升高,但凋亡率降低(P<0.05),見圖2、表2。

圖2 觀察各組細(xì)胞凋亡變化

表2 細(xì)胞增殖率、凋亡率的影響

2.3 細(xì)胞自噬狀況 對照組未見自噬泡產(chǎn)生;GK-L組、GK-M組、GK-H組自噬泡數(shù)量較對照組逐漸增多;但GK-H+Compound C組較GK-H組自噬泡數(shù)量減少。見圖3。

圖3 觀察各組細(xì)胞自噬情況(200×)

2.4 細(xì)胞LC3、P62、Beclin1 mRNA表達(dá)水平比較 GK-L組、GK-M組、GK-H組LC3、Beclin1 mRNA較對照組增加,但P62 mRNA降低(P<0.05);GK-H+Compound C組LC3 Beclin1較GK-H組降低,但P62 mRNA升高(P<0.05)。見表3。

表3 LC3、P62、Beclin1 mRNA表達(dá)水平比較

2.5 AMPK/mTOR/ULK1通路蛋白表達(dá)比較 GK-L組、GK-M組、GK-H組AMPK、LC3、Beclin1表達(dá)較對照組增加,但P62、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1降低(P<0.05);GK-H+Compound C組AMPK、LC3、Beclin1表達(dá)較GK-H組降低,而P62、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1升高(P<0.05),見表4、圖4。

圖4 AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、LC3、P62、Beclin1表達(dá)

表4 AMPK、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、LC3、P62、Beclin1比較

3 討論

乳腺癌是女性癌癥死亡的第二大原因,探索治療乳腺癌的新方案已成為乳腺癌研究的重點(diǎn)[11-13]。而化療是治療乳腺惡性腫瘤的可靠方法,但其副作用在一定程度上縮小了化療藥物的臨床應(yīng)用范圍[14]。研究MCF-7細(xì)胞對乳腺癌患者的預(yù)后影響較大,因此成為乳腺癌細(xì)胞系研究最多的腫瘤細(xì)胞[15]。本實(shí)驗(yàn)以MCF-7細(xì)胞為研究對象,探索GK對MCF-7細(xì)胞生物學(xué)影響及作用機(jī)制。

GK是一種銀杏內(nèi)酯和二萜內(nèi)酯化合物,是銀杏葉提取物的主要活性成分,具有多種藥理特性包括神經(jīng)保護(hù)、抗氧化應(yīng)激以及炎癥調(diào)節(jié)等[16-17]。如在缺血性中風(fēng)研究中,GK表現(xiàn)出保護(hù)心臟和神經(jīng)元損作的潛力[18-19]。然而GK在腫瘤方面的作用鮮有報(bào)道,但研究發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細(xì)胞癌中,GB可增強(qiáng)順鉑敏感性及細(xì)胞凋亡[20]。GC可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路減少結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,可作為治療結(jié)腸癌的有效治療藥物[21]。本研究結(jié)果顯示不同濃度GK可以抑制MCF-7細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡,提示GK可以阻止MCF-7細(xì)胞惡性行為,但其作用機(jī)制尚不明確。

自噬性細(xì)胞死亡是癌癥治療的重要機(jī)制,其中AMPK/mTOR/ULK是一條經(jīng)典自噬通路,AMPK作為自噬的中樞負(fù)調(diào)節(jié)劑,調(diào)節(jié)mTOR級聯(lián)反應(yīng),共同參與癌癥的進(jìn)展[22]。GK通過激活A(yù)MPK/mTOR/ULK1信號通路誘導(dǎo)自噬,促進(jìn)缺氧葡萄糖后的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移[23-24]。此外,研究證明通過調(diào)節(jié)AMPK、mTORC和ULK1參與自噬,可促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)展[25]。因此推測GK可能通過AMPK/mTOR/ULK1信號通路參與自噬發(fā)揮抗癌作用。研究結(jié)果顯示,經(jīng)GK處理MCF-7細(xì)胞后,自噬泡數(shù)量增多,p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1表達(dá)下調(diào),AMPK蛋白表達(dá)上調(diào),自噬基因-LC3、Beclin1表達(dá)上調(diào),p62表達(dá)下調(diào),推測GK可激活A(yù)MPK/mTOR/ULK1信號通路,誘發(fā)自噬,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,其中以GK-H處理MCF-7細(xì)胞后,抑制其惡性行為最為顯著,可能是AMPK/mTOR/ULK1信號通路可能受GK濃度的影響,GK濃度越高,AMPK/mTOR/ULK1通路中相關(guān)蛋白表達(dá)越為顯著,對MCF-7細(xì)胞惡性行為影響也越大。為驗(yàn)證上述猜想,以AMPK抑制劑(Compound C)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)回復(fù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Compound C逆轉(zhuǎn)了GK對MCF-7細(xì)胞的抑制作用,提示GK可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞惡性行為,可能與激活A(yù)MPK/mTOR/ULK1信號通路有關(guān)。本研究不足之處在于缺乏陽性對照及激活劑,后續(xù)將進(jìn)一步完善該結(jié)論。

4 結(jié)論

綜上所述,GK通過激活A(yù)MPK/mTOR/ULK1信號通路誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬和凋亡、抑制其增殖,可能是乳腺癌治療的潛在藥物。