Mfn2、miRNA-101調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β1參與肝泡型包蟲病肝纖維化的研究*

楊德武 馬福財(cái) 蓋志剛 王錚 朱海宏

(1.青海大學(xué)研究生院,青海 西寧 810000;2.青海省人民醫(yī)院普外科,青海 西寧 810000)

棘球蚴病是一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病,由棘球蚴幼蟲引起。目前研究表明,棘球蚴主要侵犯肝臟,并且在泡型包蟲病(Alveolar Echinococcosis,AE)病例中,多首先發(fā)現(xiàn)于肝臟[1]。AE被公認(rèn)為世界上最致命的慢性寄生蟲病,嚴(yán)重威脅患者生命健康[2-5]。TGF-β/smad通路是導(dǎo)致肝纖維化的重要通路之一,在TGF-β亞分型中,TGF-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)能導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞,經(jīng)過一系列病理變化最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[6]。α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)是一種高度收縮的蛋白質(zhì),由肌成纖維細(xì)胞分泌,在肝纖維化中具有標(biāo)志性作用。有研究報(bào)道在糖尿病腎病模型中,Mfn2表達(dá)增高時,膠原4的表達(dá)降低,可抑制腎間質(zhì)纖維化[7],研究進(jìn)一步表明敲除Mfn2后,對小鼠的肝纖維化有促進(jìn)作用[8]。也有研究表明肝纖維化組織中,miRNA-101的表達(dá)顯著降低[9],由此可知Mfn2、miRNA-101在纖維化疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。本課題旨在研究Mfn2、miRNA-101在肝泡型包蟲病中的表達(dá)與纖維化以及與TGF-β1信號通路的關(guān)系,完善肝泡型包蟲病導(dǎo)致肝纖維化的理論基礎(chǔ),希望能為肝泡型包蟲病的治療提供新的治療途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2020年7月-2020年10月在青海省人民醫(yī)院確診的20例肝泡型包蟲病患者作為研究對象,其中男性11例,女性9例,年齡20～50歲,均為青海藏族居民,均知情同意并簽署知情同意書。本研究通過倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前血清學(xué)包蟲抗體陽性,肝臟CT及術(shù)后病理均診斷為肝泡型包蟲病。②首次行肝泡型包蟲病病灶根治術(shù)。③術(shù)前未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移。④無肝炎、黃疸等慢性肝功能受損史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝囊性包蟲病及其它原因占位性疾病(寄生蟲、良惡性腫瘤、肝膿腫等)。②有上腹部尤其是肝膽系統(tǒng)手術(shù)史及介入治療史。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 Mfn2兔抗人Ι抗、TGF-β1兔抗人Ι抗、α-SMA兔抗人Ι抗、HRP標(biāo)記的鼠二抗、HRP標(biāo)記的兔二抗,RNAsimple總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑、SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑、miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強(qiáng)型miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒均購自于天根生化科技有限公司(北京),石蠟切片機(jī),光學(xué)顯微鏡,羅氏LC480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀。

1.3 標(biāo)本采集 各例患者術(shù)中取材,分為對照組A組(距病灶邊緣2 cm以外的正常肝組織)、實(shí)驗(yàn)組B組(距病灶邊緣2cm以內(nèi)肝組織)。1份組織經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋、切片(5片)后,分別行HE染色、Masson染色和免疫組化(dako試劑盒,兩步法)。切片由資深病理專家讀片,依據(jù)肝纖維化分期半定量評分系統(tǒng)METAVIR進(jìn)行分級。免疫組化結(jié)果由兩位病理醫(yī)師采用盲法獨(dú)立檢測,在高倍鏡(400×)下讀片, 每張切片隨機(jī)觀察5個組織豐富的視野,按照陽性細(xì)胞所占百分比及細(xì)胞染色強(qiáng)度兩評分相加,兩位醫(yī)師的檢測數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值綜合判定,評定標(biāo)準(zhǔn),見表1。3份組織放入液氮后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存,以備RT-qPCR使用。

表1 免疫組化計(jì)分判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4 提取總RNA及miRNA 標(biāo)本在液氮中充分研磨至粉末狀態(tài),取適量粉末標(biāo)本放入無酶管中,按照RNAsimple 總RNA提取試劑盒及miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書提取總RNA及miRNA。

1.5 反轉(zhuǎn)錄 Mfn2、TGF-β1、α-SMA體系由5×FastKing-RT SuperMix 4ul、TotalRNA 1.5 ul、RNase-Free ddH2O 14.5ul組成20ul體系,程序：42℃、15 min,95 ℃、3 min ;miRNA-101由miRNA 5ul、2×miRNA RT Reaction Buffer 10ul、miRNA RT Enzyme Mix 2ul、RNase-Free ddH2O 3ul組成20 ul體系,程序：42 ℃、60 min,95 ℃、3 min。

1.6 實(shí)時熒光定量法(RT-qPCR) Mfn2、TGF-β1、α-SMA引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)、合成,miRNA-101序列由天根生化科技有限責(zé)任公司引物庫查詢得到并由上海生工生物有限公司合成,GAPDH內(nèi)參基因于生工生物工程(上海)股份有限公司購買,U6內(nèi)參基因于天根生化科技有限責(zé)任公司購買。具體引物序列,見表2。反應(yīng)體系20 uL,設(shè)立3個復(fù)孔。Mfn2、TGF-β1、α-SMA的RT-qPCR程序：預(yù)變性95 ℃ 15 min,然后95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s,40個循環(huán);miRNA-101的RT-qPCR程序：預(yù)變性95 ℃ 15 min,然后94 ℃變性20 s、60 ℃退火/延伸34 s,45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線。以GAPDH為內(nèi)參照,計(jì)算目的基因Mfn2、TGF-β1、α-SMA的mRNA相對水平;以U6為內(nèi)參照,計(jì)算目的基因miRNA-101的相對水平;計(jì)算結(jié)果用2-ΔΔCt表示。

表2 Mfn2、TGF-β1、α-SMA、GAPDH、miRNA-101、U6引物序列

2 結(jié)果

2.1 HE、Masson染色及免疫組化檢測 依據(jù)HE、Masson染色,距病灶邊緣2 cm以外基本為正常肝組織,距病灶邊緣2 cm以內(nèi)存在不同程度的纖維化,見圖1、2。 Mfn2、TGF-β1、α-SMA免疫組化檢測在肝組織內(nèi)的表達(dá)呈黃色、棕黃色及棕褐色,見圖3～5。

圖1 肝組織HE染色(200×)

圖2 肝組織Masson染色(200×)

圖3 Mfn2在正常肝組織及肝纖維化組織中的表達(dá)(400×)

圖4 TGF-β1在正常肝組織及肝纖維化組織中的表達(dá)(400×)

圖5 α-SMA在正常肝組織及肝纖維化組織中的表達(dá)(400×)

2.2 Mfn2、TGF-β1、α-SMA蛋白和mRNA表達(dá)量 Mfn2、TGF-β1、α-SMA蛋白和mRNA在A、B組表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);Mfn2蛋白和mRNA表達(dá)量在B組比A組顯著降低(P<0.001);TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)量在B組比A組顯著升高(P<0.001);α-SMA蛋白和mRNA表達(dá)量在B組比A組顯著升高(P<0.001),見表3、4。

表3 正常肝組織及病灶旁組織中的Mfn2、TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)結(jié)果

表4 正常肝組織及病灶旁組織中的Mfn2、TGF-β1和α-SMA的mRNA表達(dá)結(jié)果

2.3 Mfn2、TGF-β1、α-SMA蛋白和mRNA在不同等級肝纖維化中的表達(dá) Mfn2蛋白(r=-0.739,P<0.001)和mRNA(r=-0.652,P<0.001)的表達(dá)量與肝纖維化程度均成負(fù)相關(guān),并且隨著肝纖維化級別增加,Mfn2蛋白和mRNA的表達(dá)量逐漸降低;TGF-β1蛋白(r=0.790,P<0.001)和mRNA(r=0.867,P<0.001)的表達(dá)量與肝纖維化程度均成正相關(guān),并且隨著肝纖維化級別增加,TGF-β1蛋白和mRNA的表達(dá)量逐漸升高;α-SMA蛋白(r=0.882,P<0.001)和mRNA(r=0.758,P<0.001)的表達(dá)量與肝纖維化程度均成正相關(guān),并且隨著肝纖維化級別增加,α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)量逐漸升高。見表5、6。

表5 Mfn2、TGF-β1和α-SMA蛋白在不同等級纖維化中的表達(dá)

表6 Mfn2、TGF-β1和α-SMA的mRNA在不同等級纖維化中的表達(dá)

2.4 Mfn2、TGF-β1、α-SMA蛋白和mRNA表達(dá)量兩兩之間相關(guān)性 Mfn2蛋白與TGF-β1蛋白、α-SMA蛋白表達(dá)均呈顯著性負(fù)相關(guān)(r=-0.768,P<0.001;r=-0.796,P<0.001),TGF-β1蛋白與α-SMA蛋白呈顯著性正相關(guān)(r=0.844,P<0.001)。Mfn2 mRNA與TGF-β1 mRNA、α-SMA mRNA表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.750,P<0.001;r=-0.622,P<0.01); TGF-β1 mRNA 與α-SMA mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.753,P<0.001)。

2.5 miRNA-101在肝泡型包蟲病中的表達(dá) miRNA-101在A、B組的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),miRNA-101在A組的表達(dá)量明顯高于B組,隨著肝纖維化程度加重,miRNA-101表達(dá)量逐漸減少,見圖6。miRNA-101的表達(dá)量與Mfn2、TGF-β1、α-SMA的 mRNA表達(dá)量相關(guān)性分析： miRNA-101與TGF-β1 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.508,P<0.05);miRNA-101與α-SMA mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.709,P<0.001);miRNA-101與Mfn2 mRNA的表達(dá)無顯著相關(guān)性(r=0.402,P>0.05)。

圖6 miRNA-101在正常肝組織、病灶旁組織以及不同等級纖維化中的表達(dá)

3 討論

研究表明,肝纖維化的發(fā)展特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)過度沉積。ECM的過度產(chǎn)生會導(dǎo)致組織實(shí)質(zhì)的破壞,進(jìn)而導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)框架的改變[10]。目前研究顯示,肝星狀細(xì)胞(HSC)的轉(zhuǎn)分化、激活和增殖是促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展的主要驅(qū)動力[11],病毒、寄生蟲等導(dǎo)致肝細(xì)胞受損和免疫細(xì)胞浸潤,激活HSC轉(zhuǎn)分化成肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞通過合成和分泌膠原纖維促進(jìn)肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的積累。肝泡型包蟲病病灶旁組織出現(xiàn)局部纖維化改變,考慮與泡球蚴入侵肝臟后的增值和彌漫性浸潤生長方式有關(guān)。泡球蚴感染入侵肝臟后以出芽和浸潤式的方式增殖,會在肝臟形成很多囊泡,這些囊泡外壁角質(zhì)層很薄,且與周圍組織沒有明顯的纖維膜界限,并且在肝臟內(nèi)長期存在,不斷刺激周圍肝組織,長期持續(xù)刺激使肝星狀細(xì)胞活化轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞,從而導(dǎo)致ECM的過度產(chǎn)生,導(dǎo)致肝纖維化。

TGF-β的多效性在肝臟疾病進(jìn)展的幾乎每個階段都發(fā)揮著作用,且TGF-β為現(xiàn)知作用最強(qiáng)的促肝纖維化因子[12-13]。TGF-β1被認(rèn)為是可使HSC激活的主要信號傳導(dǎo)途徑之一,和肝臟中最有效的纖維細(xì)胞因子[14-15]。四氯化碳或血吸蟲病引起的中毒導(dǎo)致肝纖維化動物模型中TGF-β1水平升高,并且在肝纖維化患者中,也觀察到TGF-β1 mRNA水平升高[16-17]。此外,α-SMA,被認(rèn)為是肝纖維化的標(biāo)記物,本研究發(fā)現(xiàn),在肝泡型包蟲病患者肝臟病灶旁組織局部肝纖維化中,TGF-β1、α-SMA的 mRNA和蛋白水平較正常肝組織明顯升高,并且隨著肝纖維化程度的增加,TGF-β1、α-SMA的 mRNA和蛋白表達(dá)水平也逐漸增加,并且TGF-β1與α-SMA相關(guān)性分析結(jié)果呈正相關(guān),進(jìn)一步證明了TGF-β1對肝纖維化有促進(jìn)作用。

Mfn2在許多細(xì)胞過程中發(fā)揮著各種作用,包括細(xì)胞增殖和死亡[18-19]。有研究報(bào)道,在小鼠肝纖維化過程中,隨著纖維化程度的進(jìn)展,Mfn2表達(dá)量逐漸下降;高表達(dá)Mfn2后,小鼠肝纖維化進(jìn)程得到一定緩解,并且很有可能是通過TGF-β/Smad通路起作用[20]。另有研究報(bào)道慢病毒載體CV072介導(dǎo)的Mfn2過表達(dá)抑制肝星狀細(xì)胞活化,從而抑制肝纖維化[21]。本研究發(fā)現(xiàn)病灶旁纖維化組織中Mfn2的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著低于正常肝組織,隨著纖維化程度的增加,Mfn2的mRNA和蛋白表達(dá)量逐漸降低,并且與TGF-β1、α-SMA分別行相關(guān)性分析,顯示Mfn2與TGF-β1、α-SMA呈負(fù)相關(guān),表明Mfn2可能通過抑制TGF-β1抑制肝泡型包蟲病肝纖維化的進(jìn)展。

miRNA是一種非編碼單鏈小RNA,可調(diào)節(jié)纖維化疾病的生理和病理過程[22]。本研究中,miRNA-101在肝泡型包蟲病病灶旁纖維化組織中的表達(dá)量顯著低于正常肝組織,隨著纖維化程度的增加,miRNA-101表達(dá)量逐漸降低,并且與TGF-β1、α-SMA分別行相關(guān)性分析,顯示miRNA-101與TGF-β1、α-SMA呈負(fù)相關(guān),提示miRNA-101可能通過抑制TGF-β1抑制肝泡型包蟲病肝纖維化的進(jìn)展。有研究報(bào)道一些miRNAs已被鑒定通過直接靶向Mfn2參與纖維化和平滑肌細(xì)胞增殖[23],但在本實(shí)驗(yàn)中miRNA-101與Mfn2行相關(guān)性分析,未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究表明,肝泡型包蟲病病灶旁存在不同程度的局部肝纖維化,纖維化范圍基本局限在病灶旁2 cm以內(nèi),病灶旁2 cm以外基本上是正常肝組織;在肝泡型包蟲病肝纖維化中,進(jìn)一步證明了TGF-β1對纖維化有促進(jìn)作用;Mfn2、miRNA-101可能抑制肝泡型包蟲病肝纖維化,并且可能通過抑制TGF-β1發(fā)揮抗纖維化作用。