UPF1影響AU565乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移及EMT的機(jī)制*

張金標(biāo) 蘇軻 徐睿 張?zhí)靷?陳冰

(淄博一四八醫(yī)院,山東 淄博 255300)

信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid,mRNA)是攜帶遺傳信息,并能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類單鏈RNA分子。近年隨著對(duì)其研究的深入,發(fā)現(xiàn)無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay,NMD)參與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié),可能是參與多種惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展[1]。上游移碼蛋白1(Up-frameshift 1,UPF1)是NMD途徑的關(guān)鍵因子,其過(guò)度磷酸化可促進(jìn)mRNA降解[2]。既往相關(guān)報(bào)道顯示,UPF1在乳腺癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)[3],但其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物行為以及機(jī)制尚未完全明確。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有重要作用,是腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志性事件[4]。近年研究發(fā)現(xiàn),阻斷NMD途徑有可能成為腫瘤治療的新方向[5]。乳腺癌作為威脅女性健康的主要惡性腫瘤,雖早期篩查和治療手段均不斷提高,但死亡率居高不下[6-7]。故進(jìn)一步明確乳腺癌發(fā)病機(jī)制,尋求更多的治療靶點(diǎn),對(duì)患者預(yù)后以及疾病認(rèn)識(shí)具有重要價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與組織 人乳腺癌細(xì)胞系A(chǔ)U565及人乳腺上皮細(xì)胞系DU4475購(gòu)于上海賓穗生物科技有限公司。新鮮冰凍乳腺癌組織及正常乳腺組織取自2021年9月—2022年3月本院乳腺切除術(shù)43例乳腺癌患者,術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療或免疫治療等。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基：北京伊塔生物科技有限公司。山羊抗人UPF1多克隆抗體：美國(guó)Santa Cruz。生物素化山羊抗兔IgG：上海延慕實(shí)業(yè)有限公司。DAB顯色試劑盒(20×)、BCA試劑盒：上海吉至生化科技有限公司。FITC熒光標(biāo)記二抗：北京博爾西科技有限公司。緩沖甘油封片劑：上海撫生實(shí)業(yè)有限公司。siRNA-UPF1：上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。E-candherin抗體、Vimentin抗體、N-cadherin抗體：美國(guó)Abcam公司。Akt抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。mTOR抗體、β-actin抗體、GAPDH抗體：上海愛(ài)必信生物科技有限公司。p-Akt抗體：上海晅科生物科技有限公司。p-mTOR抗體：上海翌圣生物科技股份有限公司。2.5%結(jié)晶紫甲醇溶液：北京百奧萊博科技有限公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：上海源葉生物科技有限公司。無(wú)菌PBS溶液、10×TBST溶液(pH8.0)：上海恒斐生物科技有限公司。激光共聚焦掃描顯微鏡：德國(guó)Leica公司。凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司。StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)：美國(guó)ABI公司。倒置顯微鏡：日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemical,IHC) 新鮮冰凍乳腺癌組織及正常乳腺組織制備石蠟塊后,置于二甲苯中脫蠟,梯度乙醇脫水,PBS溶液清洗3次;H2O2溶液室溫滅活內(nèi)源性酶10 min,蒸餾水沖洗3次;切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液中,高壓反應(yīng)3 min,冷卻20 min后,PBS溶液沖洗3次;滴加5%BSA封閉液,室溫反應(yīng)10 min,甩去多余液體;滴加山羊抗人UPF1多克隆抗體(1∶300),4 ℃過(guò)夜;PBS溶液沖洗3次,每次2 min;滴加生物素化山羊抗兔IgG(1∶100),37 ℃反應(yīng)30 min;PBS溶液沖洗3次,每次2 min;滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素(1∶100),37 ℃水浴30 min;PBS溶液沖洗3次,每次2 min;DAB法顯色,鏡下觀察顯色情況;蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染2 min,依次經(jīng)梯度脫水、透明、封片后,鏡下觀察,細(xì)胞質(zhì)和/或核上出現(xiàn)棕黃色、棕褐色顆粒即為陽(yáng)性細(xì)胞;Image Pro Plus 6.0軟件分析圖像,每個(gè)切片隨機(jī)選取3個(gè)不重疊視野,測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞吸光度(Absorbance,A)值。

1.2.2 激光共聚焦掃描顯微鏡法(Laser scanning confocal microscope,LSCM) 制備細(xì)胞玻片,放入蓋片染缸中,PBS溶液振蕩洗滌5 min;吹干,滴加山羊抗人UPF1多克隆抗體,濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜孵育;PBS溶液沖洗3次,每次5 min;吹干,滴加FITC熒光標(biāo)記二抗,37 ℃反應(yīng)40 min;PBS溶液沖洗3次,每次3 min;緩沖甘油封片劑封片,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察熒光信號(hào),Confocal Sofware軟件分析圖像,黃綠色熒光為陽(yáng)性信號(hào),隨機(jī)選取10個(gè)視野,視野中隨機(jī)再選取10個(gè)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,計(jì)算單個(gè)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞中10個(gè)光學(xué)切片熒光強(qiáng)度(Fluorescence intensity,FI)。

1.2.3 UPF1小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染 胰酶消化細(xì)胞,將AU565細(xì)胞分為siRNA-NC組和siRNA-UPF1組;轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi),37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí),參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,分別將siRNA-NC和siRNA-UPF1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,置于不含血清及抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)4～6 h;棄去舊培養(yǎng)基,更換含血清及抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h,收集細(xì)胞懸液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western boltting,WB) 轉(zhuǎn)染48h后,RIPA法裂解細(xì)胞提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度;取蛋白樣品進(jìn)行8%SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜;5%脫脂牛奶封閉2h,TBST溶液沖洗2次;滴加UPF1抗體、E-鈣黏蛋白(E-candherin)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體、磷酸化-Akt(p-Akt)抗體、p-mTOR抗體、Akt抗體、mTOR抗體(1∶1000),4 ℃過(guò)夜孵育;TBST溶液沖洗3次,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶5000),室溫反應(yīng)1 h;TBST溶液沖洗3次,ECL劑發(fā)光,凝膠成像系統(tǒng)顯影,Image J軟件分析蛋白條帶。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR) 轉(zhuǎn)染48 h后,TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,測(cè)定濃度和純度;以總RNA為模板將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng),每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,以2-△△Ct法計(jì)算轉(zhuǎn)錄物相對(duì)表達(dá)水平。UPF1上游引物5＇-CTGCAACGGACGTGGAAATAC-3＇,下游引物5＇-ACAGCCGCAGTTGTAGCAC-3＇,GAPDH上游引物5＇-ATATGTCAAAAATTGGAAT-3＇,下游引物5＇-GCTTAATCTTTAGATTGAAT-3＇。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 提前1 d配置基質(zhì)膠,均勻鋪于Transwell下室;轉(zhuǎn)染48 h后,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,胰酶消化,置于無(wú)血清的DMEM完全培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL;取200 μL細(xì)胞懸液于Transwell上室,700 μL的DMEM完全培養(yǎng)基置于Transwell下室;24 h后,結(jié)晶紫甲醇溶液染色10 min,PBS溶液洗去殘留液體;倒置顯微鏡下(20×)觀察拍照,每個(gè)室取上、下、左、右、中5個(gè)視野計(jì)數(shù)侵入細(xì)胞數(shù),取平均值,計(jì)算細(xì)胞穿膜率。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞;Marker筆在6孔板底部畫(huà)橫線,每孔至少穿過(guò)5條線,每條線間距保持一致;以4×105個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi),待細(xì)胞鋪滿板底后,使用20 μL槍頭垂直于板底直線劃痕,PBS溶液沖洗細(xì)胞2～3次,去除劃下細(xì)胞;更換新的無(wú)血清培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);分別于0 h、24 h取出細(xì)胞,顯微鏡下觀察并拍照,隨機(jī)選取5個(gè)視野,20×下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù),取平均值,計(jì)算細(xì)胞遷移率。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及正常乳腺組織中UPF1表達(dá) UPF1在乳腺癌組織細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá),呈棕黃色或棕褐色顆粒。乳腺癌組織UPF1的A值顯著高于正常乳腺組織(P<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 乳腺癌組織及正常乳腺組織中UPF1表達(dá)(IHC,×200)

2.2 AU565細(xì)胞及DU4475細(xì)胞中UPF1表達(dá) UPF1在AU565細(xì)胞中有綠色熒光表達(dá)。AU565細(xì)胞UPF1熒光強(qiáng)度顯著大于DU4475細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 AU565細(xì)胞及DU4475細(xì)胞中UPF1表達(dá)(LSCM,×200)

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1對(duì)AU565細(xì)胞中UPF1表達(dá)的影響 與siRNA-NC組比較,轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1后AU565細(xì)胞中UPF1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1對(duì)AU565細(xì)胞中UPF1表達(dá)的影響

2.4 沉默UPF1對(duì)AU565細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與siRNA-NC組比較,轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1后AU565細(xì)胞穿膜率顯著增加(P<0.05),見(jiàn)圖4。

圖4 沉默UPF1對(duì)AU565細(xì)胞侵襲能力的影響(200×)

2.5 沉默UPF1對(duì)AU565細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與siRNA-NC組比較,轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1后AU565細(xì)胞遷移率顯著增加(P<0.05),見(jiàn)圖5。

圖5 沉默UPF1對(duì)AU565細(xì)胞遷移能力的影響(200×)

2.6 沉默UPF1對(duì)AU565細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1后AU565細(xì)胞E-candherin蛋白表達(dá)水平顯著降低,Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖6。

圖6 沉默UPF1對(duì)AU565細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.7 沉默UPF1對(duì)AU565細(xì)胞Akt/mTOR信號(hào)通路的影響 與siRNA-NC組比較,轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1后AU565細(xì)胞p-Akt和p-mTOR水平顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖7。

圖7 沉默UPF1對(duì)AU565細(xì)胞Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

3 討論

2022年最新全國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,乳腺癌發(fā)病率和死亡率均位居女性惡性腫瘤首位[8-9]。轉(zhuǎn)錄因子的異常改變是惡性腫瘤最常見(jiàn)驅(qū)動(dòng)因素之一[10],其中mRNA的加工在調(diào)控基因表達(dá)中具有重要作用[11]。NMD是真核細(xì)胞中監(jiān)控RNA的重要機(jī)制,可通過(guò)識(shí)別并降解提前終止密碼子,進(jìn)而減少因截短型蛋白累積對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用[12]。有研究認(rèn)為,抑制NMD可能會(huì)使腫瘤中某些基因表達(dá)上調(diào),而上調(diào)的基因或許在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因作用[13]。報(bào)道顯示,某些基因突變導(dǎo)致的翻譯提前終止可引發(fā)NMD,NMD途徑降解了提前終止翻譯密碼子的mRNA,產(chǎn)生的有害蛋白質(zhì)可參與乳腺癌的發(fā)生[14]。

UPF1具有RNA依賴性解旋酶和ATP酶活性的蛋白分子,是目前研究較為清楚的NMD途徑依賴因子,同時(shí)還參與了多種RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的功能多樣mRNA衰變途徑[15-16]。研究發(fā)現(xiàn),UPF1在不同惡性腫瘤中可分別發(fā)揮抑癌作用和促癌作用[17-18]。本研究分別采用IHC法和LSCM法檢測(cè)乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞中UPF1表達(dá)發(fā)現(xiàn),UPF1在乳腺癌組織及乳腺癌AU565細(xì)胞中表達(dá)均顯著上調(diào),符合以往研究結(jié)果[19],提示乳腺癌中NMD過(guò)程可能被激活。由此本研究考慮沉默UPF1是否可對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展起到抑癌作用。采用siRNA技術(shù)構(gòu)建UPF1低表達(dá)的重組AU565細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1后AU565細(xì)胞中UPF1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低,提示UPF1低表達(dá)模型構(gòu)建成功。觀察沉默UPF1對(duì)AU565細(xì)胞侵襲和遷移能力影響發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1后AU565細(xì)胞穿膜率和細(xì)胞遷移率均顯著增加,UPF1表達(dá)的下調(diào)并沒(méi)有起到預(yù)想的抑癌作用,那么上調(diào)UPF1表達(dá)發(fā)揮抑癌還是促癌作用,還待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。EMT是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[20],其中E-candherin為抑EMT的分子標(biāo)志物,Vimentin和N-cadherin為促EMT的分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1后AU565細(xì)胞E-candherin蛋白表達(dá)水平顯著降低,Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高,提示沉默UPF1可誘導(dǎo)EMT發(fā)生,表明UPF1可能通過(guò)調(diào)控EMT參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移,與以往研究報(bào)道基本一致[21]。蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Protein kinase B/ mammalian target of rapamycin,Akt/mTOR)通路是腫瘤發(fā)生發(fā)展中傳統(tǒng)途徑之一。研究顯示,Akt/mTOR通路的異常激活,促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移,并誘導(dǎo)EMT的發(fā)生,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[22]。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染siRNA-UPF1后AU565細(xì)胞p-Akt和p-mTOR水平顯著升高,提示下調(diào)UPF1后,促進(jìn)了Akt和mTOR磷酸化,激活A(yù)kt/mTOR通路,進(jìn)而參與乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移以及EMT過(guò)程,抑制NMD途徑,符合以往研究結(jié)果[23-24]。

4 結(jié)論

UPF1在乳腺癌中表達(dá)上調(diào),但沉默UPF1可能通過(guò)激活A(yù)kt/mTOR通路傳導(dǎo),促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞AU565的侵襲和遷移,并誘導(dǎo)EMT發(fā)生。后續(xù)還將探討上調(diào)UPF1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響,以進(jìn)一步探討UPF1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為臨床治療提供更多可靠依據(jù)。