MTHFD2過表達(dá)通過糖酵解促進(jìn)慢性阻塞性肺疾病的中性粒細(xì)胞胞外陷阱

劉曉輝 郝世柱 吳曉瑭

(1.唐山市人民醫(yī)院胸外科,河北 唐山 063000;2.唐山工人醫(yī)院腫瘤外一科,河北 唐山 063000;3.桂林理工大學(xué),廣西 桂林 310000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是常見的呼吸道疾病[1],其產(chǎn)生與持續(xù)性的氣流阻塞和呼吸道炎癥有關(guān),由于患者呼氣后不能完全排空肺臟,導(dǎo)致二氧化碳在體內(nèi)積聚,由此產(chǎn)生的二氧化碳潴留導(dǎo)致呼吸功能下降、缺氧和高碳酸血癥[2-3]。COPD具有病程長(zhǎng)、易反復(fù)發(fā)作等臨床特點(diǎn),可進(jìn)一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭,嚴(yán)重影響人體健康[4-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年有300多萬人死于COPD[6]。因此,探究有效的生物標(biāo)志物對(duì)COPD的治療具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn),亞甲基四氫葉酸脫氫酶2(Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase(NADP+Dependent)2,MTHFD2)是COPD可靠的生物標(biāo)志物,其在COPD的預(yù)后和診斷治療中發(fā)揮重要的作用[7]。COPD患者病情的加重與中性粒細(xì)胞(Neutrophil,NEU)及其胞外陷阱(Neutrophil extracellular trap,NET)的活化關(guān)聯(lián)甚密[8-9]。當(dāng)NEU被活化時(shí),會(huì)釋放顆粒蛋白和染色質(zhì),在細(xì)胞外與胞外纖維結(jié)合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的NET[8,10-11]。隨著COPD患者病情的加重,其痰液和氣道中NETs含量會(huì)增多,炎癥反應(yīng)和肺功能的受損程度均加大[8-9,12]。有研究發(fā)現(xiàn),MTHFD2與糖酵解具有協(xié)同表達(dá)效果,表現(xiàn)為高M(jìn)THFD2促進(jìn)高糖酵解[13]。糖酵解是機(jī)體內(nèi)除有氧線粒體呼吸外第二種獲取能量的方式。在低氧或缺氧條件下,大多數(shù)真核細(xì)胞為維持一定的ATP水平會(huì)將主要代謝策略從線粒體呼吸轉(zhuǎn)向糖酵解[14]。因此,本研究將從COPD中MTHFD2基因的表達(dá)水平對(duì)NET的形成和糖酵解代謝的影響出發(fā),探究MTHFD2對(duì)COPD的作用機(jī)制,以期對(duì)COPD的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 生物信息分析 從GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載COPD相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)GSE38974(normal：9,COPD：23)。利用“l(fā)imma”包對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析(logFC=0.585,adjust P-value=0.05),發(fā)現(xiàn)MTHFD2基因顯著上調(diào)。利用The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(http：//www.proteinatlas.org/)分析MTHFD2在人體中的表達(dá)模式。

1.2 痰液的采集與痰液DNA的定量測(cè)定 收集2022年7月就診于唐山市人民醫(yī)院的COPD患者痰液30份為COPD組(符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)),肺功能檢查正常的健康人群的痰液30份為對(duì)照組。兩組取樣時(shí)間一致,且確保兩組采樣前1 h不進(jìn)食,不吸煙、不刷牙,未劇烈運(yùn)動(dòng)。清水漱口5 min后統(tǒng)一收集痰液于采樣管中。4 ℃條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室[15]。為了確定不同處理組獲得的細(xì)胞痰液上清液中NET豐度,按照制造商的說明,使用PicoGreen?dsDNA定量試劑(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)在480 /520 nm的濾光片設(shè)置下進(jìn)行熒光光譜定量,根據(jù)試劑盒說明書的要求測(cè)定并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線方程。測(cè)定待測(cè)樣品的熒光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品的DNA濃度[16]。

1.3 中性粒細(xì)胞的分離和NET的誘導(dǎo) 本研究從DSMZ(德國(guó)布倫瑞克公司)獲得中性粒細(xì)胞表型功能的常用替代細(xì)胞系HL-60細(xì)胞[17],按照開發(fā)商說明書的要求進(jìn)行HL-60細(xì)胞的培養(yǎng)。為了評(píng)估健康組和COPD組中性粒細(xì)胞的NET形成能力,采用脂多糖(LPS)刺激HL-60體外分化獲得的中性粒細(xì)胞。利用非細(xì)胞膜通透的染料Sytox green和Hoechst染料對(duì)胞外DNA進(jìn)行染色,在熒光顯微鏡下觀察DNA結(jié)構(gòu),以此表征NETs形成[18];采用免疫熒光染色檢測(cè)NET標(biāo)志物MPO和cit-H3的表達(dá)水平[19]。通過Trizol法進(jìn)行總RNA提取,PrimeScript RT Reagent Kit(日本Takara公司)用于cDNA合成。隨后,使用TB Green PCR Kit(日本Takara公司)進(jìn)行qRT-PCR分析檢測(cè)基因表達(dá),β-肌動(dòng)蛋白作為檢測(cè)基因表達(dá)量的內(nèi)參。使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列,見表1。

表1 qRT-PCR引物表

1.4 MTHFD2過表達(dá)的中性粒細(xì)胞的糖酵解測(cè)定和NET形成評(píng)估 將從中國(guó)GenePharma公司購買的pcDNA3.1-MTHFD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HL-60分化形成的中性粒細(xì)胞中,構(gòu)建過表達(dá)MTHFD2的中性粒細(xì)胞HL-60/oe-MTHFD2[20]。用LPS刺激HL-60/oe-MTHFD2,誘導(dǎo)NET的生成。用SYTOX染料對(duì)

胞外DNA進(jìn)行染色,用免疫熒光染色檢測(cè)NET標(biāo)志物MPO和cit-H3的表達(dá)水平。根據(jù)制造商的說明,乳酸測(cè)定試劑盒(3MAK064-1KT)和葡萄糖試劑盒(3GAGO20)重復(fù)測(cè)定待測(cè)樣品中性粒細(xì)胞中的乳酸和葡萄糖含量[21]。用qRT-PCR分析HL-60/oe-MTHFD2中MTHFD2、糖酵解相關(guān)基因(HK1、PDK1、SLC2A1和MYC)的表達(dá)水平。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MTHFD2與糖酵解通路相關(guān)基因、中性粒細(xì)胞標(biāo)志物之間呈正相關(guān)關(guān)系。為了探究MTHFD2基因、糖酵解和NET三者的關(guān)系,本研究構(gòu)建HL-60/oe-NC組、HL-60/oe-MTHFD2組、HL-60/oe-MTHFD2+2-DG組,并用LPS分別處理各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,誘導(dǎo)NET的生成。測(cè)定各處理組中MTHFD2基因表達(dá)量、糖酵解信號(hào)及NET形成情況。

2 結(jié)果

2.1 MTHFD2與COPD中性粒細(xì)胞胞外陷阱相關(guān) 通過GEO數(shù)據(jù)的差異分析,發(fā)現(xiàn)MTHFD2在COPD中高表達(dá)(圖1A)。與此相符的是,picogreen染料染色結(jié)果顯示COPD痰液中DNA含量顯著高于健康對(duì)照組,表明慢性阻塞性肺疾病中形成了較多的NET(圖1B)。進(jìn)一步使用免疫熒光染色分析了健康對(duì)照組(未用LPS處理的HL-60細(xì)胞)和COPD組(用LPS處理的HL-60細(xì)胞)樣本中NET標(biāo)志蛋白MPO和cit-H3的含量,COPD組中MPO和cit-H3的表達(dá)均顯著高于健康對(duì)照組(圖1C)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示MTHFD2與中性粒細(xì)胞標(biāo)志物(ICAM1,ICOSLG,ITGAM,CR1)[22-23]的表達(dá)呈正相關(guān)(圖1D)。qRT-PCR的結(jié)果表明,COPD組NEU中MTHFD2的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(圖1E)。結(jié)合以上結(jié)果表明,MTHFD2的表達(dá)水平的提高與COPD患者體內(nèi)NET的形成有關(guān)。

圖1 MTHFD2與COPD中性粒細(xì)胞胞外陷阱相關(guān)性分析

2.2 MTHFD2過表達(dá)激活糖酵解信號(hào)通路并增加了中性粒細(xì)胞NET的形成 過往研究表明,MTHFD2可以促進(jìn)糖酵解代謝,而NET的形成需要糖酵解代謝提供能量。本研究通過Pearson分析探究了MTHFD2與糖酵解代謝的相互作用關(guān)系,發(fā)現(xiàn)MTHFD2與糖酵解代謝通路多個(gè)酶基因(MYC,SLC2A1,HK1,PDK1)的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(圖2A),表明MTHFD2基因可能與糖酵解信號(hào)有關(guān)。為了進(jìn)一步探究MTHFD2與糖酵解和NET之間的相互作用關(guān)系,本研究構(gòu)建了過表達(dá)MTHFD2的中性粒細(xì)胞,并用LPS刺激NEU以促進(jìn)NET的形成。免疫熒光染色和SytoxGreen染色的結(jié)果顯示(圖2B、圖2C),MTHFD2的過表達(dá)使中性粒細(xì)胞向胞外空間釋放更多的DNA、MPO和cit-H3。這些數(shù)據(jù)表明,MTHFD2過表達(dá)可能促進(jìn)COPD中NET的形成。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示(圖2D-H),MTHFD2的過表達(dá)使得中性粒細(xì)胞中MTHFD2基因以及糖酵解相關(guān)基因(HK1、PDK1、SLC2A1、MYC)的表達(dá)量顯著提高(P<0.05),表明MTHFD2的過表達(dá)可以激活糖酵解信號(hào)通路。通過對(duì)葡萄糖和乳酸含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)MTHFD2過表達(dá)的中性粒細(xì)胞中葡萄糖含量顯著下調(diào),而乳酸的含量顯著提高(圖2I、圖2J)。上述研究證實(shí)了過表達(dá)MTHFD2可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的糖酵解代謝和COPD中NET的形成。

圖2 MTHFD2與糖酵解信號(hào)通路和NET的形成密切相關(guān)

2.3 MTHFD2過表達(dá)可以誘導(dǎo)糖酵解信號(hào)通路影響COPD中性粒細(xì)胞胞外陷阱的產(chǎn)生 之前的研究發(fā)現(xiàn),MTHFD2的過表達(dá)可以促進(jìn)糖酵解代謝,促進(jìn)NET的形成。但是MTHFD2過表達(dá)是否可以通過調(diào)節(jié)糖酵解信號(hào)通路來誘導(dǎo)NET的形成尚不明確。因此,使用糖酵解抑制劑(2-DG)處理過表達(dá)MTHFD2的中性粒細(xì)胞來進(jìn)一步探究MTHFD2、糖酵解、NET三者之間的相互作用關(guān)系。結(jié)果顯示,與HL-60/oe-MTHFD2相比,2-DG處理的HL-60/oe-MTHFD2向胞外空間釋放的DNA減少(圖3A),表明2-DG處理可以抑制NET的形成。此外本研究發(fā)現(xiàn),2-DG處理可以顯著抑制葡萄糖的消耗和乳酸的生成(圖3B、圖3C);而與HL-60/oe-NC相比,無論是否添加2-DG,MTHFD2的過表達(dá)均使中性粒細(xì)胞中NET形成能力顯著提高。表明MTHFD2可能通過糖酵解信號(hào)通路刺激COPD中的糖酵解代謝和NET的形成。關(guān)于糖酵解信號(hào)通路,qRT-PCR的結(jié)果顯示,過表達(dá)MTHFD2的中性粒細(xì)胞中MTHFD2基因的表達(dá)量(圖3D)以及糖酵解相關(guān)基因(HK1、PDK1、SLC2A1、MYC)的表達(dá)量顯著提高(P<0.05);2-DG加入使HL-60/oe-MTHFD2的MTHFD2、HK1、PDK1、SLC2A1、MYC的表達(dá)量顯著降低(圖3E-H)。表明過表達(dá)MTHFD2可以激活糖酵解信號(hào)通路,加入2-DG可抑制糖酵解水平。結(jié)合以上結(jié)果表明,過表達(dá)MTHFD2可以顯著誘導(dǎo)COPD中的糖酵解代謝,進(jìn)而促進(jìn)NET的形成。

圖3 過表達(dá)MTHFD2誘導(dǎo)糖酵解信號(hào)通路促進(jìn)COPD中NET的產(chǎn)生

3 討論

MTHFD2是線粒體中一碳葉酸代謝中的關(guān)鍵酶,可為細(xì)胞增殖提供所需要的NAD(P)H和ATP,參與多種炎癥相關(guān)的反應(yīng)。MTHFD2基因在多種炎癥性疾病中過表達(dá),MTHFD2在體內(nèi)以及體外炎癥部位的活化CD4 T細(xì)胞中的過表達(dá),可以影響CD4 T細(xì)胞亞群(TH1、TH17、Treg)的活化、增殖、存活,促進(jìn)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,進(jìn)而調(diào)控免疫相關(guān)反應(yīng)。Sugiura等[24]研究發(fā)現(xiàn),抑制MTHFD2基因的表達(dá),可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的分化,進(jìn)而緩解多種炎癥性疾病的病情。Yu等[7]研究發(fā)現(xiàn),MTHFD2的高表達(dá)可作為COPD的預(yù)后指標(biāo)。本研究通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫COPD相關(guān)的數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn),MTHFD2在COPD患者中呈顯著上調(diào)表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)了這一現(xiàn)象,即MTHFD2的表達(dá)程度與COPD的嚴(yán)重程度有關(guān)。

中性粒細(xì)胞是免疫防御的第一道防線[25],在炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[19]。研究表明COPD患者病情的加重與NEU及其NET的活化關(guān)聯(lián)甚密[8-9]。NEU是一種特殊的白細(xì)胞,是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分[26],NET是中性粒細(xì)胞響應(yīng)免疫反應(yīng)的產(chǎn)物,具有殺菌的作用[10,27]。當(dāng)NEU被活化時(shí),會(huì)釋放顆粒蛋白和染色質(zhì),在細(xì)胞外與胞外纖維結(jié)合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的NET[8,10-11]。其中的組蛋白H1、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶NE、髓過氧化物酶MPO和DNA是組成NET的重要成分,也是表征NET形成水平的重要指標(biāo)[11,28]。研究發(fā)現(xiàn)NET中的NE可以降解毒力因子并殺死細(xì)菌,NET中的組蛋白也被證明是最有效的抗菌劑[27,29]。Alison J.Dicker的研究表明,NET標(biāo)志物(cfDNA、DNA-彈性蛋白、組蛋白彈性蛋白等)與COPD嚴(yán)重指數(shù)(預(yù)測(cè)FEV百分比和CAT評(píng)分)之間具有顯著的相關(guān)關(guān)系;此外研究發(fā)現(xiàn)與穩(wěn)定型COPD患者相比,加重型COPD患者痰液和血清中NET濃度顯著高于穩(wěn)定COPD痰液和血清中NET濃度,這表明NET的形成與COPD患者疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)[8,9,12]。本研究中,通過測(cè)定兩組受試者痰液中的MPO、cit-H3和DNA含量以及MTH-FD2的基因表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)COPD患者痰液中性粒細(xì)胞中這些物質(zhì)的含量以及MTHFD2的基因表達(dá)量均顯著高于健康對(duì)照組;相關(guān)性分析的結(jié)果顯示,MTHFD2與中性粒細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。這些表明COPD患者中有較多的NET形成,且與MTHFD2的表達(dá)有關(guān)。

糖酵解是低氧條件下細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝的關(guān)鍵途徑,為能量的產(chǎn)生提供中間體[30]。有研究認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞即使在有氧的情況下也傾向于優(yōu)先進(jìn)行糖酵解[31]。COPD導(dǎo)致呼吸功能下降,進(jìn)而可能導(dǎo)致缺氧[2],本研究通過生物信息學(xué)分析和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)研究發(fā)現(xiàn),糖酵解代謝水平可以顯著影響COPD中NET的形成。過往研究發(fā)現(xiàn)表明,當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí),機(jī)體可以通過激活糖酵解代謝,促進(jìn)葡萄糖分解成乳酸為中性粒細(xì)胞的吞噬活動(dòng)、活性氧的產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞胞外陷阱的形成提供能量[32]。Wang等[33]研究發(fā)現(xiàn),抑制COPD患病小鼠中的糖酵解代謝,可以抑制炎癥因子的產(chǎn)生,進(jìn)而提高COPD患者的存活率。Pranvera等[32]研究發(fā)現(xiàn),NEU可以通過糖酵解和糖異生促進(jìn)有效的免疫反應(yīng)。糖酵解也是健康NEU中NET形成所必須的。微管排列的重組以及由此產(chǎn)生的NET已被證明依賴于糖酵解釋放的ATP;同時(shí),糖酵解抑制劑2-脫氧-d-葡萄糖(2-DG)可以通過抑制糖酵解和PPP來阻斷NET的形成[34]。有研究發(fā)現(xiàn),使用糖酵解抑制劑(2-DG)抑制糖酵解,可以防止慢加急性肝衰竭(ACLF)患者中NET的過度生成[35]。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)MTHFD2與糖酵解具有協(xié)同表達(dá)效果,表現(xiàn)為高M(jìn)THFD2促進(jìn)高糖酵解[13],這與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明,MTHFD2可以促進(jìn)糖酵解代謝,進(jìn)而誘導(dǎo)COPD中NET的形成。

4 結(jié)論

MTHFD2可以通過誘導(dǎo)糖酵解促進(jìn)COPD的中性粒細(xì)胞胞外陷阱的形成。這為使用MTHFD2作為COPD治療的潛在藥物靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)。當(dāng)然,缺乏體內(nèi)驗(yàn)證MTHFD2誘導(dǎo)糖酵解信號(hào)調(diào)控NET形成的數(shù)據(jù)是本研究的主要局限性。在未來應(yīng)進(jìn)一步確定MTHFD2在COPD患者中的作用。