貴州腌魚微生物多樣性和益生特性分析

李思雨，杜賀超，包佳亮，姚宏亮，蔣加進(jìn)

（金陵科技學(xué)院動物科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇南京 210038）

腌魚是貴州省黔東南苗族侗族自治州的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。為了延長食物的食用期限、賦予食物特有風(fēng)味，常采用自然發(fā)酵的方式加工魚肉制品，形成了具有當(dāng)?shù)靥厣摹半缡澄幕盵1]。貴州腌魚風(fēng)味獨(dú)特、味道鮮美、易于貯藏，這些特點(diǎn)與發(fā)酵食品中微生物多樣性具有一定關(guān)系。

高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing，HTS） 是目前研究微生物多樣性最有效的方法。不僅能全面分析一個(gè)物種的基因組，還能處理大規(guī)模樣品。與傳統(tǒng)的平板分離純化、基因指紋圖譜技術(shù)（如變性梯度凝膠電泳DGGE 和溫度梯度凝膠電泳TGGE） 相比，高通量測序具有高靈敏度和高效性，廣泛應(yīng)用于在微生物多樣性的研究中[2]。張雙虹等人[3]的高通量測序結(jié)果顯示袋裝番茄醬中主要由乳桿菌屬、伯克式菌屬等菌屬起作用。高通量測序在腌制大頭菜、發(fā)酵大豆、臘肉、奶豆腐、甜面醬[4-7]等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究中均有應(yīng)用。此外，高通量測序技術(shù)也是研究發(fā)酵劑對風(fēng)味物質(zhì)影響和探究發(fā)酵過程中理化性質(zhì)變化規(guī)律的有效方法。例如，通過高通量測序?qū)λ拇ㄅ莶四杆M(jìn)行研究，李恒等人[8]發(fā)現(xiàn)微生物與pH 值具有緊密的相關(guān)性；單玉鑫等人[9]在酸魚的研究中發(fā)現(xiàn)不同菌屬賦予酸魚不同的風(fēng)味物質(zhì)。

益生菌進(jìn)入人體，需要經(jīng)過胃液的低pH 值和膽囊中膽汁的脅迫。因此，耐酸耐膽鹽能力對其達(dá)到腸道定植發(fā)揮益生作用具有重要意義。該研究基于Illumina MiSeq 第二代高通量測序平臺，進(jìn)行16S rRNA 序列測序，分析貴州腌魚中的細(xì)菌多樣性，在此基礎(chǔ)上對腌魚中的優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行分離，對其耐酸耐膽鹽等益生特性進(jìn)行評價(jià)，為貴州腌魚微生物資源的利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3 份腌魚樣品，購自貴州省凱里市；DNA 凝膠回收試劑盒，AXYGEN 公司提供；瓊脂糖、PBS 磷酸鹽，北京索萊寶公司提供；MRS 肉湯，青島海博生物有限公司提供；豬膽鹽、胃蛋白酶（1∶3000），上海源葉生物技術(shù)有限公司提供；革蘭氏染色試劑盒，溫州市康泰生物科技有限公司提供。

生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；PCR 儀，美國ABI 公司產(chǎn)品；DYY-6C 型電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；Illumina Miseq 測序儀，美國Illumina 公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.2 高通量測序方法

1.2.1 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

按照細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取3 個(gè)樣品的DNA，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性。采用V3-V4 區(qū)引物338F（5'-ACTCCTACGGGAG GCAGCA-3'），806R(5'-ACTCCTACGGAGGCAGCA-3')進(jìn)行16S rRNA 序列擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性95 ℃3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃持續(xù)延伸10 min。采用QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)對PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果進(jìn)行定量。提取到的DNA 樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Miseq 測序。

1.2.2 高通量測序

按照參考文獻(xiàn)[10]中的方法，采用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit 建庫試劑盒構(gòu)建Miseq 文庫：通過PCR 在靶區(qū)域外端添加接頭序列，然后切膠回收產(chǎn)物，經(jīng)NaOH 變性后產(chǎn)生DNA 單鏈片段。隨后在Illumina MiSeq 平臺進(jìn)行上機(jī)測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和分析

利用FLASH 和Trimmomatic 軟件對序列進(jìn)行優(yōu)化，提取非重復(fù)序列并且對重復(fù)單序列進(jìn)行剔除。使用USEARCH 軟件按照97%相似性對非重復(fù)序列進(jìn)行操作分類單元（Operational taxonomic units，OUT） 聚類并篩出嵌合體，在此條件下使用RDP classifier 貝葉斯算法獲取OTU 對應(yīng)的物種分類信息，并統(tǒng)計(jì)各分類學(xué)水平（如門、屬等） 下的樣品群落組成情況。

選擇97%相似度的OTU，利用Mothur 計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的多樣性指數(shù)，利用R 語言工具制作曲線圖和群落柱形圖。利用Vegan 包，繪制群落Heatmap 圖[11]。通過Qiime 平臺，以Ace、Chao、Bergerparker、Coverage 指數(shù)等進(jìn)行Alpha 多樣性分析[12]。利用SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 益生特性分析方法

1.3.1 乳酸菌的分離

取25 g 腌魚樣品，剪碎后加入含有225 mL 滅菌PBS 的錐形瓶中，振蕩培養(yǎng)30 min，使細(xì)菌均勻分散于液體。取1 mL 液體倍比稀釋，分別取200 μL 均勻涂布于MRS 平板，于37 ℃下靜置培養(yǎng)48 h。挑取乳白色單菌落，接種到MRS 液體培養(yǎng)。

1.3.2 耐膽鹽能力測定

活化的菌株按2.0%的接種量，分別接種于膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，0.2%，0.3%的MRS 培養(yǎng)液，于37 ℃下靜置培養(yǎng)4 h。于0 h 和4 h 分別取樣，測定每株菌種的OD600nm值，按公式（1） 計(jì)算菌株生長率，用MRS 液體培養(yǎng)基調(diào)零，每組3 次平行。

式中：C——生長率，%；

A0——不含膽鹽MRS 培養(yǎng)基中0 h 的OD600nm值；

A1——不含膽鹽MRS 培養(yǎng)基中4 h 的OD600nm值；

A2——含膽鹽MRS 培養(yǎng)基中0 h 的OD600nm值；

A3——含膽鹽MRS 培養(yǎng)基中4 h 的OD600nm值。

1.3.3 耐胃酸能力測定

（1） 菌懸液的制備。取0.2 mL 活化后的菌液接種至10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心15 min，棄上清液，收集菌體，用無菌PBS 緩沖溶液洗滌后重懸，重復(fù)2 次，加入10 mL 無菌PBS 緩沖溶液混勻制成菌懸液，需現(xiàn)做現(xiàn)用。

（2） 人工胃液的制備。參考熊濤等人[13]的方法制備人工胃液。取稀鹽酸1.64 mL（23.4 mL 濃鹽酸，加水稀釋至100 mL，得9.5%～10.5%稀鹽酸） 加入超純水稀釋至100 mL，121 ℃下滅菌15 min，待溫度冷卻至50 ℃以下，加入1.0 g 胃蛋白酶混勻，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至3.0。

（3） 菌株耐酸性測定。參考陳儀婷等人[14]的方法測定菌株的耐酸性。將菌懸液與人工胃液按1∶9（V∶V） 的比例混合，于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3 h，于0 h 和3 h 分別取樣，采用平板涂布計(jì)數(shù)法測定0，3 h 的活菌數(shù)，按照公式（2） 計(jì)算菌株存活率，每組3 次平行。

式中：C——存活率，%；

m1——3 h 活菌數(shù)，CFU/mL;

m2——0 h 活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 菌株的鑒定

挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，并根據(jù)以下方法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

（1） 反應(yīng)體系。2×Taq Master Mix（Dye Plus）12.5 μL；引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R；5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）各1 μL；模板DNA 1 μL；超純水9.5 μL。

（2） PCR 條件。95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物送去蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行BLAST 比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 份腌魚樣品分別標(biāo)記為Y1，Y2 和Y3。利用Illumina Miseq 高通量測序方法測得的腌魚樣品原始序列數(shù)與堿基長度。測序的3 份樣品的有效序列為98 695 條，長度區(qū)間范圍主要集中于421～460 bp，平均長度為450 bp，符合測序目標(biāo)序列（V3-V4 可變區(qū)） 特征。比對后共獲得92 個(gè)OUTs，說明貴州腌魚中細(xì)菌種類豐富。

樣品信息記錄表見表1。

表1 樣品信息記錄表

2.2 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性（單樣品的多樣性） 可以用來分析腌魚樣品中微生物群落的豐度和多樣性，常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)有豐富度指數(shù)（Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)）和群落多樣性指數(shù)（Coverage 指數(shù)） 等。

3 份腌魚樣品的Alpha 多樣性指數(shù)見表2。

表2 3 份腌魚樣品的Alpha 多樣性指數(shù)

由表2 可知，3 份樣品的Coverage 指數(shù)均在98%以上，說明測序覆蓋了腌魚樣品的絕大部分物種類別，準(zhǔn)確率較高。樣品Y1 的Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù)高于Y2、Y3，說明Y1 中物種相對豐富。這也表明，不同的制作店家，腌魚中微生物的多樣性有一定的差別，篩選某些特定性能的微生物時(shí)需要覆蓋較大的樣品量。

2.3 稀釋曲線分析

稀釋曲線也叫Shannon 曲線，是以隨機(jī)抽取的數(shù)據(jù)量（Reads） 為橫坐標(biāo)，OUT 水平的Shannon 指數(shù)為縱坐標(biāo)，構(gòu)建的曲線。Shannon 指數(shù)曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。

腌魚樣品稀釋曲線圖見圖1。

圖1 腌魚樣品稀釋曲線圖

由圖1 可知，3 個(gè)腌魚樣品的稀釋曲線逐漸趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)呈飽和狀態(tài)，測序結(jié)果涵蓋了腌魚樣品中的絕大多數(shù)微生物，樣品已經(jīng)包含足夠多的微生物多樣性信息。測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度可靠，可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

2.4 菌群多樣性分析

基于有效序列的聚類結(jié)果，利用可視化的群落直方圖進(jìn)行群落組成分析，可以清晰地看出樣品在不同分類水平上的菌落組成情況。

2.4.1 門水平群落結(jié)構(gòu)分析

門水平群落圖見圖2。

圖2 門水平群落圖

3 份腌魚均含有五大類門水平細(xì)菌，其中厚壁菌門（Firmicutes） 為絕對優(yōu)勢菌門，Y1、Y2、Y3 3 份腌魚樣品中厚壁菌門占比分別為78.52%，88.84%，91.95%。變形菌門（Proteobacteria），Y1、Y2、Y3這3 份腌魚樣品占比分別為19.36%，7.15%，6.56%。此外，還有藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria） 和擬桿菌門（Bacteroidetes）。3 份樣品中，Y2 和Y3 菌落組成的相似度較高，Y1 中變形菌門含量高于Y2 和Y3，而厚壁菌門含量略低于Y2和Y3。

厚壁菌門在腌魚樣品中具有較高的豐度，可能是厚壁菌門中的乳酸菌能夠在高酸和厭氧環(huán)境中生存，同時(shí)在發(fā)酵過程中抑制其他細(xì)菌的生長，含量較高。變形菌門通常構(gòu)成魚本身的微生物菌落，多屬于好氧菌，但在缺氧、產(chǎn)酸、產(chǎn)醇的腌魚發(fā)酵環(huán)境中難以生存。因此，發(fā)酵后存在一定比例，但豐度受到限制[15]。此外，腌魚發(fā)酵原料中的植物葉綠體可能是少量藍(lán)藻菌門細(xì)菌產(chǎn)生的原因。

2.4.2 屬水平群落結(jié)構(gòu)分析

屬水平群落圖見圖3。

圖3 屬水平群落圖

由圖3 可知，挑選3 份腌魚樣品中排名前10 位的優(yōu)勢菌屬進(jìn)行分析比較。

由圖3 可知，乳桿菌屬（Lactobacillus） 是3 份腌魚樣品共同的優(yōu)勢菌屬，占比均在50%以上，Y1，Y2，Y3 分別為52.35%，56.93%，56.87%。魏斯氏菌屬（Weissella），Y1，Y2，Y3 占比分別為15.98%，20.37%，25.47%。此外，還有鹽單胞菌屬（Halomonas）、Ignatzschineria 屬、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、藍(lán)藻菌（Cyanobacteria）、假單胞菌屬（Pseudomonas） 等。3 份腌魚樣品中，乳桿菌均為絕對優(yōu)勢菌，魏斯氏菌屬也占有一定比例，說明乳酸菌在傳統(tǒng)發(fā)酵腌魚食品的制作和貯藏中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Y1 與Y2，Y3 相比，Ignatzschineria 屬含量較高，可能是魚體來源不同，本身所含細(xì)菌有差異導(dǎo)致，也是Y1 中變形菌門含量較高的原因。

2.4.3 群落熱圖分析

群落熱圖（Heatmap 圖） 能夠呈現(xiàn)出高豐度和低豐度的物種聚類，并通過顏色變化和相似性來反映不同樣品在各分類水平上群落組成的異同點(diǎn)。

樣品群落Heatmap 圖見圖4。

圖4 樣品群落Heatmap 圖

由圖4 可知，3 份樣品中，Y2 與Y3 聚類在一個(gè)分支，說明兩者菌落組成相似性較高，與Y1 相似性較遠(yuǎn)。紅色的厚壁菌門占有較高比例，結(jié)合屬水平和門水平的群落結(jié)構(gòu)分析，3 份樣品的優(yōu)勢菌均為厚壁菌門乳桿菌屬。

2.4.4 耐膽鹽能力分析

挑選腌魚樣品中分離的11 株乳酸菌，測定其在0.2%，0.3%膽鹽中的生長率，從而評估菌株對膽鹽的耐受能力。

乳酸菌在不同膽鹽質(zhì)量濃度中的生長率見表3。

表3 乳酸菌在不同膽鹽質(zhì)量濃度中的生長率

由表3 可知，在0.2%膽鹽培養(yǎng)基中，除MM7和SS2外，其余9 株菌的生長率均在50%以上。其中，YY16，SS5，MM9 的生長率最高，分別為91.17%，87.14%，86.69%。MRS 培養(yǎng)基中膽鹽濃度增加到0.3%時(shí)，11 株菌的生長顯著下降（p＜0.05），生長率集中在20%～40%。此時(shí)生長率最高的為YY16，在0.3%膽鹽濃度MRS 培養(yǎng)基中脅迫4 h 仍能達(dá)到47.64%。由此可見，11 株乳酸菌中，膽鹽耐受性最好的是YY16。研究表明，乳酸菌在膽鹽存在環(huán)境中可以分泌膽鹽水解酶（Bile salt hydrolase，BSH），將結(jié)合型膽鹽分解為膽酸和游離氨基酸，從而降低膽鹽對自身的危害[16]。

2.4.5 耐胃酸能力分析

人體胃酸的主要成分是鹽酸，進(jìn)食后pH 值可達(dá)3.0～5.0，消化時(shí)間為2～4 h。因此，配置pH 值為3.0 的人工胃液，將作用3 h 后的菌種存活率作為耐受胃液評價(jià)的依據(jù)。

乳酸菌在人工胃液中的耐受性評價(jià)見表4。

表4 乳酸菌在人工胃液中的耐受性評價(jià)

在人工胃液中培養(yǎng)3 h 后，菌株YY4、SS4、YY16的存活率在90%以上，分別為94.64%，93.85%，91.34%，同時(shí)這幾株菌的活菌數(shù)都保持在107CFU/mL以上。說明這3 株菌具有較強(qiáng)的耐酸性。結(jié)合耐膽鹽結(jié)果，表明YY16具有較好的益生特性。

2.4.6 菌種鑒定

菌株YY16 的菌落形態(tài)（a）、菌體形態(tài)（b） 和PCR 電泳條帶（c） 見圖5。

圖5 菌株YY16 的菌落形態(tài)（a）、菌體形態(tài)（b） 和PCR 電泳條帶（c）

菌株YY16在MRS 固體培養(yǎng)基中的菌落呈圓形，白色，表面光滑濕潤，邊緣整齊，符合乳酸菌菌落形態(tài)特征（見圖5（a））。革蘭氏染色后，鏡檢曾藍(lán)紫色短桿狀（見圖5（b）），為革蘭氏陽性桿菌。16S rRNA 片段PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖5（c）），特異性條帶在1 400 bp 左右，說明擴(kuò)增成功。測序后，在美國國家生物信息技術(shù)中心（NCBI） GenBank 中進(jìn)行BLAST 比對，YY16與植物乳桿菌Lactiplantibacillus plantarum strain 2383 的覆蓋率為98%，同源性為99.8%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，判定菌株YY16是植物乳桿菌。

3 結(jié)論

微生物的生長代謝在貴州腌魚發(fā)酵、貯藏等過程中發(fā)揮重要作用。基于Illumina Miseq 高通量測序結(jié)果，Y2 與Y3 的菌落組成相似性較高，與Y1 略有差異。說明加工方式的不同、原材料來源的不同，都會對發(fā)酵過程中的菌落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)。微生物多樣性在一定程度上影響食品的貯存期限和風(fēng)味。研究微生物的多樣性及微生物的菌群結(jié)構(gòu)特征，不僅能為微生物資源的挖掘提供依據(jù)，還能指導(dǎo)發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

3 份腌魚樣品中的優(yōu)勢菌均為厚壁菌門的乳酸菌，主要包括乳桿菌和魏斯氏菌。乳桿菌具有抑制雜菌生長、延長食品保存期、改善食品風(fēng)味等作用。乳桿菌能在高酸環(huán)境中存活，并能夠通過分解糖類物質(zhì)使之生成最終產(chǎn)物乳酸等有機(jī)酸，使得環(huán)境pH值降低、酸度升高，同時(shí)還能產(chǎn)生過氧化氫、乙醇氧化物、細(xì)菌素等多種具有抑菌作用的產(chǎn)物，降低了一些雜菌的生長，從而延長食品的保質(zhì)期。此外，隨著酸度的升高，也會產(chǎn)生醛、酮等物質(zhì)，豐富發(fā)酵食品的風(fēng)味[17]。單玉鑫等人[9]發(fā)現(xiàn)乳桿菌對于酸魚中的鮮味物質(zhì)釋放起到了一定的作用，大大增加了酸魚的食用口感。陸洲[18]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌D1501發(fā)酵黃漿水具有抑菌活性，并能將干絲保鮮期延長到5 d。魏斯氏菌也是一類乳酸菌，作用與乳桿菌類似，是很好的食品發(fā)酵劑，能夠提升腌魚的風(fēng)味和口感。魏斯氏菌存在于泡菜、腐乳、酒曲等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中。接種魏斯氏菌和植物乳桿菌復(fù)合菌種能縮短麻竹筍泡菜發(fā)酵周期，提高食用安全性，改善口感[19]。

乳酸菌的最低活菌數(shù)目為106CFU/mL[20]才能發(fā)揮益生作用，試驗(yàn)中植物乳桿菌YY16 在0.2%，0.3%膽鹽中的生長率分別為91.17%和47.64%，在人工胃液中培養(yǎng)3 h 后，存活率為91.34%，可承受膽鹽和胃酸的脅迫。與熊濤等人[20]研究的副干酪乳桿菌在pH 值為2.5 的環(huán)境中作用3 h 存活率仍高達(dá)98.21%，且活菌數(shù)在107CFU/mL 以上的結(jié)果相一致，說明植物乳桿菌YY16具有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力，具有在功能食品開發(fā)中的應(yīng)用潛力。