石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的制備工藝研究

馬 丹，尚書游，李文琦，王勁松，阮 軍，李碩芳，馬志國，何 虹

（1.荊楚理工學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖北荊門 448000；2.湖北鐘祥聚瑞食品有限公司，湖北荊門 431900）

0 引言

中藥揮發(fā)油不僅在醫(yī)學(xué)上有很大的應(yīng)用價(jià)值，還是香料工業(yè)、日用食品工業(yè)和化學(xué)工業(yè)中的一種重要的原材料[1-3]。由于中藥揮發(fā)油的理化性質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制難度增大，使得制劑的進(jìn)一步開發(fā)和推廣受到了限制。隨著芳香類中藥揮發(fā)油的提取分離和產(chǎn)品研制的改進(jìn)，新技術(shù)、新方法的應(yīng)用對(duì)中藥揮發(fā)油相關(guān)制劑的研究與開發(fā)提供了技術(shù)支持。含揮發(fā)油的中藥材被研發(fā)成滴丸、軟膠囊、微乳、凝膠膏劑、微囊、微球、脂質(zhì)體、聚合物膠束等多種中藥揮發(fā)油新型制劑[4-7]，并建立了鼻腔給藥、經(jīng)皮給藥、結(jié)腸定位給藥等多種新型給藥系統(tǒng)。鐵皮石斛是名貴中藥，其活性成分多糖、黃酮等是研究熱點(diǎn)[8-10]，而鐵皮石斛花揮發(fā)性成分的研究較少。有研究表明，石斛花中含有豐富的揮發(fā)油，且具有抗炎、抗氧化、抗衰老等藥理作用[11-16]；有研究[17-21]從石斛花中提取出揮發(fā)油，并對(duì)石斛花揮發(fā)性化學(xué)組分進(jìn)行定性定量研究，為石斛花揮發(fā)油功能產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。對(duì)石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體進(jìn)行初步研究，旨在提高其穩(wěn)定性，為其進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

石斛花，荊楚理工學(xué)院種植；膽固醇，天津博迪化工有限公司提供；卵磷脂，天津福晨化學(xué)試劑廠提供；三氯甲烷（分析純），茂名市潤景化工有限公司提供；甲醇（分析純），無錫市晶科化工有限公司提供；磷酸鹽緩沖液（生化試劑），南通凱恒生物科技公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；XD-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；顯微鏡、數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品；GL-23M型大容量高速冷凍離心機(jī)，湘儀儀器科技有限公司產(chǎn)品；SB25-12D 型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 石斛花揮發(fā)油的提取

稱取石斛花500 g，加入無水乙醇750 mL，攪拌 3 h 后用布氏漏斗抽濾。于40 ℃條件下將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，濃縮液使用離心機(jī)以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，得到約4.0 mL 油液。裝于具塞試管中于4 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體制備

取石斛花揮發(fā)油0.45 mL，卵磷脂0.45 g，膽固醇0.15 g 置于100 mL 圓底燒瓶中，加三氯甲烷10 mL 溶解，置于40 ℃水浴中攪拌溶解。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使脂質(zhì)在器壁上形成薄膜。真空干燥2 h，加入pH 值7.2 的磷酸鹽緩沖液20 mL，通過超聲處理30 min 后得到乳白色均勻混懸液。

2.3 石斛花揮發(fā)油含量測(cè)定方法

2.3.1 UC 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

將0.02 mL 的石斛花揮發(fā)油放入50 mL 容量瓶中，加入甲醇溶液，定容至刻度。用甲醇溶液作為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)200～400 nm 處進(jìn)行紫外掃描。通過掃描圖譜來確定石斛花揮發(fā)油的最大吸收波長(zhǎng)。

2.3.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取石斛花揮發(fā)油2 mg 加甲醇稀釋至50 mL，分別吸取0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，用甲醇定容至10 mL。在石斛花揮發(fā)油的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液吸收度，平行測(cè)定3 次。通過線性回歸可得石斛花揮發(fā)油的回歸方程。

2.3.3 石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的理化性質(zhì)

（1） 外觀。參照錢雪等人[22]的試驗(yàn)方法。

（2） pH 值。參照錢雪等人[22]的試驗(yàn)方法。

2.3.4 測(cè)定脂質(zhì)體的包封率

吸取混懸液于離心管中，冰浴10 min，以轉(zhuǎn)速19 000 r/min 離心30 min，取上清液，按“線性關(guān)系考查”項(xiàng)下測(cè)定樣品的吸光度，測(cè)得游離揮發(fā)油的含量。根據(jù)下面的公式計(jì)算包封率[5]：

式中：W1——加入的石斛花揮發(fā)油的總量，mL；

W2——測(cè)得游離揮發(fā)油的含量，mL。

2.4 單因素試驗(yàn)

固定其他條件與藥物用量，制備石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的過程中，以水化溫度、卵磷脂含量、膽固醇含量、磷酸緩沖液體積為影響指標(biāo)，由以上4 個(gè)單因素來觀察石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的包封率與成型性，篩選出單因素制備石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的最佳結(jié)果。

單因素試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化制備處方

通過水化溫度、石斛花揮發(fā)油與卵磷脂配比、卵磷脂與膽固醇配比、磷酸緩沖液的單因素試驗(yàn)，選擇脂質(zhì)體包封率最高值附近的3 個(gè)水平，對(duì)石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，觀察其包封率與成型性。

正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)

3 結(jié)果與分析

3.1 最大吸收波長(zhǎng)

石斛花揮發(fā)油的紫外圖譜見圖1。

由圖1 可知，在波長(zhǎng)260 nm 處有最大吸收度，故將此波長(zhǎng)定為檢測(cè)石斛花揮發(fā)油含量的波長(zhǎng)。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)定石斛花揮發(fā)油梯度濃度溶液的吸光度，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.160 8X-0.013 6，R2=0.999 2，表明石斛花揮發(fā)油的質(zhì)量濃度為2.4～7.2 μg/mL 時(shí)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

3.3 石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的理化性質(zhì)

將脂質(zhì)體放置在顯微鏡下，可清晰地觀察到石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體呈球形，其表面包裹著磷脂，結(jié)構(gòu)完整，大小較為均一。這種球形的脂質(zhì)體表明了石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性。為了更好地了解石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的性質(zhì)，對(duì)其采用pH 計(jì)測(cè)試。在測(cè)試中，發(fā)現(xiàn)其pH 值在5～7，說明其具有良好的穩(wěn)定性和緩沖能力。

石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體顯微鏡下圖見圖2。

圖2 石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體顯微鏡下圖

3.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 水化溫度的影響

水化溫度對(duì)包封率的影響見圖3。

圖3 水化溫度對(duì)包封率的影響

由圖3 可知，在水化溫度為40℃時(shí)，脂質(zhì)體的包封率最高，為62.72%；當(dāng)水化溫度超過40 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，包封率降低。溫度過高會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體破壞或不穩(wěn)定，溫度過低則會(huì)使脂質(zhì)體難以形成水化溫度，還會(huì)影響脂質(zhì)體的質(zhì)量。在一定溫度范圍內(nèi)，隨著水化溫度的升高，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和均勻性均會(huì)增加，但超過一定溫度后，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和均勻性會(huì)減弱。水化溫度還會(huì)影響石斛花揮發(fā)油的釋放速率。研究表明，在一定溫度范圍內(nèi)，水化溫度的升高會(huì)加快石斛花揮發(fā)油的釋放速率，但超過一定溫度后，石斛花揮發(fā)油的釋放速率反而會(huì)降低。在制備石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體時(shí)，選擇合適的水化溫度，以保證脂質(zhì)體的穩(wěn)定性、均勻性和石斛花揮發(fā)油的釋放速率。

3.4.2 卵磷脂與膽固醇配比的影響

卵磷脂與膽固醇的配比的影響見圖4。

圖4 卵磷脂與膽固醇配比的影響

由圖4 可知，隨著卵磷脂與膽固醇配比的增大，脂質(zhì)體的包封率逐漸升高后降低。當(dāng)卵磷脂與膽固醇配比為3∶1 時(shí)，脂質(zhì)體的包封率達(dá)到最高，為69.5%。試驗(yàn)表明，膽固醇和卵磷脂具有較好的協(xié)同作用，膽固醇可穩(wěn)定雙層膜結(jié)構(gòu)。當(dāng)卵磷脂與膽固醇的配比增加時(shí)，構(gòu)成脂質(zhì)體的磷脂含量減少，而高膽固醇會(huì)增加脂質(zhì)體的親水性，使得磷脂膜不結(jié)實(shí)，容易被破壞、滲漏，不利于脂質(zhì)體的形成，從而造成包封率降低。

3.4.3 石斛花揮發(fā)油與卵磷脂配比的影響

石斛花揮發(fā)油與卵磷脂配比的影響見圖5。

圖5 石斛花揮發(fā)油與卵磷脂配比的影響

由圖5 可知，石斛花揮發(fā)油與卵磷脂配比為3∶1時(shí)，脂質(zhì)體包封率達(dá)到69.37%；石斛花揮發(fā)油具有較強(qiáng)的揮發(fā)性和生物活性，其含量的增加可以增強(qiáng)脂質(zhì)體內(nèi)藥物的包封率，也會(huì)影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，可能導(dǎo)致藥物的泄漏。卵磷脂則可以增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，但其含量過高也會(huì)降低藥物的包封率。

3.4.4 磷酸緩沖液體積的影響

磷酸緩沖液用量對(duì)包封率的影響見圖6。

圖6 磷酸緩沖液用量對(duì)包封率的影響

由圖6 可知，在磷酸緩沖液用量為10 mL 時(shí)，脂質(zhì)體的包封率最高，為47.54%，包封率隨磷酸緩沖液增加而降低。當(dāng)磷酸緩沖液的體積過大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致溶液中石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的濃度過低，從而影響提取效率。當(dāng)磷酸緩沖液的體積過小時(shí)，溶劑的濃度過高，可能導(dǎo)致石斛花中的油脂質(zhì)體不能完全溶解，同樣影響提取效率。磷酸緩沖液的用量越高，可提高溶劑的溶解能力，使得石斛花中的油脂質(zhì)體更容易溶解，有利于提取。

3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

以脂質(zhì)體的包封率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)2，4，5，7 的包封效果較好，分別為51.92%，56.45%，43.55%，52.07%。正交試驗(yàn)的最佳水平為A2B1C2D2，即水化溫度為40 ℃，卵磷脂與膽固醇配比為1∶2，揮發(fā)油與膽固醇配比為3∶1，磷酸鹽緩沖溶液pH 值為7.2，用量為10 mL 時(shí)，石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的成型性最好，包封率最佳，為56.45%。試驗(yàn)結(jié)果表明，卵磷脂的含量對(duì)石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的包封率和成型性均具有顯著影響。

根據(jù)上述篩選得到的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，制備3 批脂質(zhì)體樣品，測(cè)得石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體包封率平均值為57.37%。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

通過薄膜分散法研究石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體配方中不同成分的比例和外在影響因素可知，石斛花揮發(fā)油與卵磷脂的配比對(duì)脂質(zhì)體的制備、包封率和成型性的影響較大。當(dāng)水化溫度為40 ℃，卵磷脂與膽固醇配比為1∶2，揮發(fā)油與膽固醇配比為3∶1，磷酸鹽緩沖溶液pH 值為7.2，用量為10 mL 時(shí)，石斛花揮發(fā)油脂質(zhì)體的成型性最好，包封率最佳為56.45%。