西南樺節(jié)間莖段植株再生體系的建立

王 歡，郭俊杰，王春勝，尹海鋒，曾 杰

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，熱帶林業(yè)研究國家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東 廣州 510520；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037)

西南樺（Betula alnoidesBuch.-Ham.ex D.Don）是中國南方造林面積較大的鄉(xiāng)土珍貴闊葉樹種之一，其木材材質(zhì)優(yōu)良，是制作木地板、高檔家具、樂器等的優(yōu)良材料[1]；其樹皮可用于治療感冒、產(chǎn)后疼痛以及消化系統(tǒng)和骨科疾病等[2]，樹皮提取物具有抗HIV-1 整合酶，并具有抗炎、降血脂、減肥之功效[3-5]。西南樺在生物多樣性和地力維持、水源涵養(yǎng)以及碳素固定等方面亦發(fā)揮著重要作用，被廣泛應(yīng)用于生態(tài)公益林和珍貴用材林建設(shè)。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用基因工程進(jìn)行遺傳改良已成為林木育種的重要途徑之一。遺傳轉(zhuǎn)化是開展植物遺傳改良的必要技術(shù)，同時(shí)也是驗(yàn)證基因功能、解析性狀形成機(jī)制的關(guān)鍵技術(shù)，而高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化受體再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化的必要前提。

中國西南樺的離體培養(yǎng)始于2000 年[6]，主要有直接器官發(fā)生[7-9]、間接器官發(fā)生[10]以及體胚發(fā)生[6]等構(gòu)建方式。目前能形成完整植株的主要是通過直接器官發(fā)生途徑，特別是腋芽萌發(fā)途徑，但該途徑增殖率通常較低，且只適合于西南樺優(yōu)良品種的規(guī)模擴(kuò)繁，并不適用于遺傳轉(zhuǎn)化。間接器官發(fā)生是離體培養(yǎng)中通過外植體誘導(dǎo)愈傷組織再分化的形態(tài)建成過程[11]，相比直接器官發(fā)生，其潛在繁殖系數(shù)更高，作為分子育種的平臺(tái)也更具優(yōu)勢(shì)[12-13]。目前，西南樺通過間接器官發(fā)生方式的再生體系尚未見成功報(bào)道。

關(guān)于樺木科的間接器官發(fā)生，目前以白樺（Betula platyphyllaSuk）和歐洲白樺（Betula pendulaRoth）研究較多，所用外植體一般為種子[14-16]、葉片[17-19]、根段[20]、莖段[21]等。以種子為外植體研發(fā)的再生體系，具有分化率高且再生芽多的優(yōu)勢(shì)，但是，由于該體系需要“切種子”，對(duì)于細(xì)小粒的樺木種子而言技術(shù)要求極高，且每粒種子的遺傳背景不同，嚴(yán)格地說，它并不利于開展轉(zhuǎn)基因植株的分子試驗(yàn)。利用無性系組培苗的根、莖、葉作為外植體，可使受體材料保持相對(duì)一致。有研究發(fā)現(xiàn)，利用白樺莖段、葉柄和葉片均能誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽分化，莖段的效果整體上優(yōu)于葉片和葉柄[22]；歐洲白樺根較難誘導(dǎo)愈傷組織形成，且其愈傷組織易老化，需要較長時(shí)間誘導(dǎo)才能分化出不定芽[20]。前期研究發(fā)現(xiàn)，西南樺莖段與白樺[22]一樣較易誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽分化，但因節(jié)間較短容易切到芽點(diǎn)，增加了操作難度，且材料利用率不高。因此，增加西南樺試管苗的節(jié)間長度對(duì)莖段再生的外植體取材非常重要。

本研究以西南樺無性系TC2 試管苗為材料，針對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化、生根等器官間接發(fā)生階段開展試驗(yàn)，重點(diǎn)研究激素濃度、暗培養(yǎng)時(shí)間和莖段外植體培育條件等對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響，以期建立高效穩(wěn)定、重復(fù)性良好的西南樺間接器官發(fā)生再生體系，為今后開展西南樺組織培養(yǎng)以及利用基因工程進(jìn)行其遺傳性狀改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及條件

以課題組前期培養(yǎng)的西南樺無性系TC2 試管苗為材料；如無特別注釋，其培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間16 h·d-1，溫度25 ℃ ± 2 ℃。

1.2 研究方法

1.2.1 莖段再生階段培養(yǎng)基的篩選 莖段再生階段培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)中，選取繼代培養(yǎng)30 d 的TC2 試管苗，剪取其帶頂芽莖段，接種于培養(yǎng)基WPM + 0.15 mg·L-1NAA + 20 g·L-1蔗糖 + 5.8 g·L-1瓊脂（pH5.8），培養(yǎng)30 d 后避開腋芽剪取4～7 mm 節(jié)間莖段用于愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)。

（1）愈傷組織誘導(dǎo)階段 愈傷組織誘導(dǎo)研究包括基本培養(yǎng)基篩選、外源激素的濃度篩選以及暗培養(yǎng)時(shí)間篩選3 個(gè)單因素試驗(yàn)（表1），分別含4、9 和3 個(gè)處理（水平）。所有試驗(yàn)每個(gè)處理均3 次重復(fù)，每次10 個(gè)莖段。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)階段的單因素試驗(yàn)Table 1 Single-factor experiments at callus induction stage

基本培養(yǎng)基試驗(yàn)中，各處理的激素添加均為1.0 mg·L-1TDZ 和0.1 mg·L-1NAA；外源激素濃度梯度試驗(yàn)以WPB5 為基本培養(yǎng)基，選用TDZ 和NAA 的不同濃度（表1）進(jìn)行試驗(yàn)；暗培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)按表1 中的3 個(gè)時(shí)長進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為WPB5 + 1 mg·L-1TDZ + 0.1 mg·L-1NAA +20 g·L-1蔗糖 + 5.8 g·L-1瓊脂 （pH5.8）。統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率后將表1 中所有試驗(yàn)處理的愈傷組織轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基WPM + 1 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1GA3+30 g·L-1蔗糖 + 5.8 g·L-1瓊脂 （pH5.8）中進(jìn)行后續(xù)分化培養(yǎng)，在正常光照條件下培養(yǎng)60 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)生分化的愈傷組織數(shù)與每個(gè)莖段分化的不定芽數(shù)（高度5 mm 以上），期間30 d 繼代1 次，并計(jì)算分化率、凈增殖系數(shù)和總增殖系數(shù)。

（2）愈傷組織分化不定芽階段 以WPM 為基本培養(yǎng)基，采用6-BA（A）、GA3（B）和NAA（C）3 種激素（3 因素），每因素包括2 水平，構(gòu)成完全隨機(jī)試驗(yàn)（表2），分析各激素組合的不定芽誘導(dǎo)效果，以篩選分化培養(yǎng)基。選擇在上述最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的大小相近的愈傷組織，分別接種于8 種組合處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)接種10 塊愈傷組織。每隔30 d 轉(zhuǎn)接（繼代）1 次，60 d 后觀察統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)情況，包括發(fā)生分化的愈傷組織數(shù)、每個(gè)莖段分化的不定芽數(shù)、分化率、凈增殖系數(shù)和總增殖系數(shù)。

表2 愈傷組織分化階段激素組合試驗(yàn)Table 2 Hormone combination experiment at callus differentiation stage

（3） 生根培養(yǎng)階段 待分化的不定芽長至2～3 cm，剪取單芽接種至1/2MS 或WPM 培養(yǎng)基，附加NAA（0.1 和0.2 mg·L-1）或IBA （0.1 和0.2 mg·L-1）、20 g·L-1蔗糖和 5.8 g·L-1瓊脂進(jìn)行生根誘導(dǎo)，以篩選生根培養(yǎng)基。試驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見表3。每個(gè)處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)12 株。培養(yǎng)過程中追蹤統(tǒng)計(jì)各組合生根起始時(shí)間，于12 d 和30 d 后統(tǒng)計(jì)生根率和生根條數(shù)，并測(cè)定30 d 時(shí)根長。

表3 生根誘導(dǎo)試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Experimental design for rooting induction

1.2.2 預(yù)培養(yǎng)條件的優(yōu)化 因研究過程中發(fā)現(xiàn)外植體的狀態(tài)影響各階段的試驗(yàn)效果，于是針對(duì)預(yù)培養(yǎng)條件進(jìn)行如下優(yōu)化。選取繼代培養(yǎng)30 d 的TC2 試管苗，剪取其帶頂芽莖段，接種于培養(yǎng)基WPM + 0.15 mg·L-1NAA + 20 g·L-1蔗糖 + 5.8 g·L-1瓊脂（pH5.8），于8 種條件下進(jìn)行培育（表4）。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)10 株，30 d 后統(tǒng)計(jì)株高和節(jié)間長度。分別取8 個(gè)處理的節(jié)間莖段，同時(shí)統(tǒng)計(jì)每株可取平均莖段數(shù)，然后接種于最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（WPB5 + 1.0 mg·L-1TDZ + 0.2 mg·L-1NAA + 20 g·L-1蔗糖 +5.8 g·L-1瓊脂 ）；暗培養(yǎng)15 d 后轉(zhuǎn)至最佳愈傷組織分化的培養(yǎng)基（WPM + 0.8 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1GA3+ 30 g·L-1蔗糖 + 5.8 g·L-1瓊脂）。每個(gè)處理3次重復(fù)， 每次重復(fù)24 個(gè)莖段，75 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽分化情況，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)同（2）。

表4 預(yù)培養(yǎng)條件篩選試驗(yàn)Table 4 Screening test on preculture conditions of internode

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算以下指標(biāo)：

Y=（n/N） × 100%，F(xiàn)=（m/M） × 100%，R=（q/Q） × 100%，Tt=Na/m，Tn=Na/M

Y為愈傷誘導(dǎo)率，n為愈傷組織誘導(dǎo)數(shù)，N為接種莖段數(shù)；F為愈傷分化率，m為分化愈傷組織數(shù)，M為接種愈傷組織數(shù)；R為生根率，q為生根株數(shù)，Q為接種數(shù)；Tt為總增殖系數(shù)，Tn為凈增殖系數(shù)，Na為不定芽總數(shù)。使用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用IBM SPSS Statistics13.0 軟件進(jìn)行方差分析和Duncan 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)階段各因素對(duì)后續(xù)不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響

2.1.1 基本培養(yǎng)基 方差分析結(jié)果（表5）表明：除凈增殖系數(shù)外，4 種基本培養(yǎng)基處理間產(chǎn)生的不定芽數(shù)（10 個(gè)接種莖段不定芽數(shù)量）及其分化率和總增殖系數(shù)均呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），其中，WPB5 的所有指標(biāo)均最高，WPM、1/2MS和MS 間不定芽數(shù)、分化率和總增殖系數(shù)依次顯著地降低，凈增殖系數(shù)差異不顯著，說明采用WPB5作為基本培養(yǎng)基，可顯著地促進(jìn)西南樺莖段再生不定芽的形成，提高其增殖系數(shù)，因此，WPB5 是西南樺莖段再生不定芽培養(yǎng)的優(yōu)選培養(yǎng)基。

表5 愈傷組織誘導(dǎo)階段基本培養(yǎng)基對(duì)后續(xù)西南樺不定芽分化的影響Table 5 Effect of basic medium at callus induction stage on subsequent adventitious bud differentiation of Betula alnoides

2.1.2 外源激素 由表6 可知：隨著外源激素TDZ 或NAA 濃度的增加，不定芽數(shù)、分化率和總增殖系數(shù)均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，凈增殖系數(shù)在兩種激素中表現(xiàn)不同，隨著TDZ 濃度增加呈遞增趨勢(shì)，而隨NAA 濃度增加則呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)； TDZ 或NAA 不同濃度處理間4 個(gè)指標(biāo)均存在顯著差異。TDZ 的4 個(gè)濃度處理中，不定芽數(shù)、分化率和總增殖系數(shù)以1 mg·L-1處理為最高，分別為49、83.3%和4.9，顯著地高于其它處理；凈增殖系數(shù)最高的TDZ 濃度為2 mg·L-1，但與1 mg·L-1處理差異不顯著。NAA 的5 個(gè)濃度處理中， 0.2 mg·L-1處理的不定芽數(shù)、分化率和總增殖系數(shù)均最高，分別為48.3、86.7%、4.8；凈增殖系數(shù)最高的NAA 濃度為0.1 mg·L-1；除分化率在0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-1處理間差異顯著之外，其余指標(biāo)在二者間均差異不顯著?？偟膩砜?，TDZ 或NAA 為西南樺莖段愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵外源激素，其適宜濃度分別為1 mg·L-1和0.2 mg·L-1。

表6 愈傷組織誘導(dǎo)階段外源激素及其濃度對(duì)后續(xù)西南樺不定芽分化的影響Table 6 Effects of exogenous hormones and their concentrations at callus induction stage on subsequent adventitious bud differentiation of Betula alnoides

2.1.3 暗培養(yǎng)時(shí)間 在暗培養(yǎng)時(shí)間篩選試驗(yàn)中，不定芽數(shù)、分化率、凈增殖系數(shù)和總增殖系數(shù)隨暗培養(yǎng)時(shí)間增加整體上呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)（表7）。暗培養(yǎng)15 d 和20 d 時(shí)4 個(gè)指標(biāo)均顯著高于10 d，且以15 d 暗培養(yǎng)處理效果最好；兩者的分化率均在80.00%以上，凈增殖系數(shù)和總增殖系數(shù)分別在5.5 和4.5 以上。由此可見，西南樺莖段愈傷組織誘導(dǎo)的適宜暗培養(yǎng)時(shí)間為15 d。

表7 愈傷組織誘導(dǎo)階段暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)后續(xù)西南樺不定芽分化的影響Table 7 Effect of dark culture time at callus induction stage on subsequent adventitious buds differentiation of Betula alnoides

2.2 愈傷組織分化階段不同激素組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響

GA3和NAA 兩種因素各水平間不定芽數(shù)、不定芽分化率和總增殖系數(shù)存在顯著差異，其凈增殖系數(shù)無顯著差異，6-BA 各水平間這些指標(biāo)差異不顯著；3 種因素間交互作用不顯著（表8）。從表9可以看出：各激素組合處理的不定芽數(shù)、不定芽分化率、凈增殖系數(shù)和總增殖系數(shù)分別為38.7～49.3、63.3%～86.7%、5.4 ～6.1 倍和3.9 ～4.9倍；組合處理間不定芽數(shù)、不定芽分化率、總增殖系數(shù)和凈增殖系數(shù)均存在顯著差異（P＜0.05）。組合處理間比較，處理III 的不定芽數(shù)、不定芽分化率和總增殖系數(shù)最高，其凈增殖系數(shù)也相對(duì)較高。對(duì)照表2 可知：0.8 mg·L-16-BA 和0.5 mg·L-1GA3的組合適宜應(yīng)用于西南樺愈傷組織的不定芽分化和增殖。

表8 西南樺不定芽分化指標(biāo)的F 值和顯著性分析Table 8 F-value and statistical significance of adventitious bud differentiation of Betula alnoides

表9 不同激素組合對(duì)西南樺不定芽分化的影響Table 9 Effects of different hormone combinations on adventitious bud differentiation of Betula alnoides

2.3 不定芽生根誘導(dǎo)

培養(yǎng)12 d 和30 d 時(shí)，添加NAA 的處理（Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ）與添加IBA 的處理（Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ）間生根率和平均生根數(shù)均差異顯著（表10）。處理Ⅱ和Ⅵ，基部出現(xiàn)大量致密的愈傷組織，30 d 時(shí)仍未見生根；處理Ⅰ和Ⅴ，基部出現(xiàn)較多愈傷組織，培養(yǎng)12 d 時(shí)未見生根，30 d 時(shí)雖有生根但生根率低，僅為22.2%～25.0%；其它4 種處理， 12 d 時(shí)生根率為33.3%～52.9%，平均生根數(shù)為2.4～6.7，30 d 時(shí)生根率均在90%以上，平均約10 條根，平均根長4.7 cm。對(duì)照表3 可知，無論采用1/2MS 還是WPM 作為基本培養(yǎng)基，添加0.1 mg·L-1或0.2 mg·L-1IBA 時(shí)不定芽不生根或生根率極低，而添加0.1 或者0.2 mg·L-1NAA的生根效果均較好。相對(duì)而言，適宜西南樺不定芽生根的基本培養(yǎng)基為WPM，外源激素及其濃度為0.1 mg·L-1NAA，在該條件下培養(yǎng)30 d 生根率可達(dá)100%。

表10 不同培養(yǎng)基對(duì)西南樺不定芽生根的影響Table 10 Effects of different media on rooting of Betula alnoides adventitious buds

2.4 不同預(yù)培養(yǎng)條件對(duì)莖段待取苗生長和莖段再生的影響

方差分析結(jié)果（表11）顯示：8 種預(yù)培養(yǎng)條件下，處理Ⅲ和Ⅵ的株高及每株可取平均莖段數(shù)顯著高于其它處理，處理Ⅶ和Ⅷ的凈增殖系數(shù)顯著高于其它處理，8 個(gè)處理間分化率差異不顯著。西南樺株高、節(jié)間長度以及每株可取莖段數(shù)均以處理Ⅵ表現(xiàn)最佳，其次為處理Ⅲ，兩者的株高、節(jié)間長度以及每株可取莖段數(shù)分別在8 cm、3.5 cm 和12 以上，顯著大于其它處理。分別采用各處理的莖段誘導(dǎo)愈傷組織并進(jìn)一步分化培養(yǎng)，得到的分化率亦以處理Ⅵ為最高，但各處理間差異并不顯著，均在86%以上；處理Ⅶ和Ⅷ的凈增殖系數(shù)和總增殖系數(shù)均最高，凈增殖系數(shù)在6.2 以上，總增殖系數(shù)約5.5，顯著高于絕大多數(shù)其它處理。總而言之，處理Ⅶ的再生效率最高，平均每個(gè)預(yù)培養(yǎng)植株可產(chǎn)生56.8 個(gè)不定芽，整個(gè)再生過程見圖1。因此，適宜西南樺莖段再生的預(yù)培養(yǎng)條件為處理Ⅶ，即弱光培養(yǎng)（1 000 lx）15 d 后轉(zhuǎn)至暗培養(yǎng)7 d，再正常光照（2 000 lx）培養(yǎng)8 d。

圖1 西南樺莖段再生各階段的生長狀態(tài)Fig.1 Growth status of each stage of regeneration from internodes of Betula alnoides

表11 不同預(yù)培養(yǎng)條件下西南樺植株生長表現(xiàn)和后續(xù)不定芽分化效果差異Table 11 Differences in growth performance and subsequent adventitious bud differentiation of Betula alnoides plantlets under various preculture conditions

3 討論

外植體的選擇是決定再生成效的第一步。幼態(tài)組織具有更高的形態(tài)發(fā)生能力，傳統(tǒng)培養(yǎng)選取靠近形態(tài)學(xué)上端的材料更易成功[23-26]，但每個(gè)植株可有效利用的材料較少，從而增加了取材時(shí)間和培養(yǎng)成本。對(duì)于節(jié)間莖段的取材而言，適當(dāng)?shù)暮诎蹬囵B(yǎng)可使試管苗生長加快、節(jié)間伸長、幼嫩程度增加[27]，相對(duì)于傳統(tǒng)培養(yǎng)僅能利用較短的頂端節(jié)間而言，提升其操作性的同時(shí)增加其莖段利用率。本研究通過設(shè)置8 種培養(yǎng)條件，篩選出再生效率和取材利用率均較高的組合，即弱光培養(yǎng)（1,000 lx）15 d 后，轉(zhuǎn)至暗培養(yǎng)7 d，接著正常光照（2,000 lx)）培養(yǎng)8 d。與常規(guī)培養(yǎng)（處理Ⅰ）相比，總增殖系數(shù)和凈增殖系數(shù)分別提高8.8%和12.2%，每株平均再生芽數(shù)提高83.2%。究其原因，由于植物在黑暗中節(jié)間伸長加快，而隨著光照時(shí)間的減少，光合作用變?nèi)?，光合產(chǎn)物也較少，相應(yīng)地維管束和機(jī)械組織較不發(fā)達(dá)，更容易脫分化形成愈傷組織[28]。亦有研究表明，一段時(shí)間黑暗培養(yǎng)后的黃化苗，其生長素、可溶性糖、氨基酸和蛋白質(zhì)等含量均比光培養(yǎng)苗高，即黃化培養(yǎng)后的幼莖生理代謝更活躍[29]，更有助于脫分化形成胚性愈傷組織，從而提高其再生效率。

愈傷組織的誘導(dǎo)與其基本培養(yǎng)基、外源激素濃度、培養(yǎng)時(shí)間長短等因素密切關(guān)系。木本植物通常使用MS 或WPM 培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。本研究發(fā)現(xiàn)西南樺莖段在MS 培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)率極低，在WPM 培養(yǎng)基上也并不高，而在WPB5 培養(yǎng)基上表現(xiàn)較好。與WPM 培養(yǎng)基相比，WPB5 換用了B5 培養(yǎng)基的有機(jī)物，其有機(jī)物含量更高；相比MS 培養(yǎng)基，WPB5 替換了有機(jī)成分的同時(shí)還降低了氮和鉀含量。由此可見，無機(jī)鹽濃度低且有機(jī)物濃度高的基本培養(yǎng)基更適合西南樺莖段愈傷組織誘導(dǎo)。分析其原因，西南樺屬于酚類物質(zhì)較多的物種，培養(yǎng)過程中容易氧化形成醌類物質(zhì)而產(chǎn)生褐變，從而影響外植體的脫分化和器官分化。而低鹽培養(yǎng)基可以適當(dāng)減輕此類褐變[30]，從而誘導(dǎo)出愈傷組織。此外，在愈傷組織形成的起動(dòng)期與分裂期，外植體細(xì)胞的合成代謝活動(dòng)加強(qiáng)，需要迅速且大量地進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的合成，適當(dāng)添加有機(jī)物質(zhì)可有效促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)[31]。

細(xì)胞分裂素和生長素是西南樺莖段器官發(fā)生途徑愈傷組織誘導(dǎo)的必需因子，也是提高再生效率的重要因素。TDZ 具有生長素和細(xì)胞分裂素的雙重功能，可使許多難再生的植物種實(shí)現(xiàn)高頻分化[32-34]。如蔣淑磊等[34]對(duì)照山白杜鵑的莖段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn)，最佳TDZ 濃度為1.0 mg·L-1，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)96.3%，增殖系數(shù)為4.9。本研究通過設(shè)置0.1～2.0 mg·L-1的TDZ 濃度梯度開展試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著TDZ 濃度的增加，西南樺莖段的愈傷組織分化率和總增殖系數(shù)呈現(xiàn)先上升再降低的趨勢(shì)，亦以1.0 mg·L-1濃度處理表現(xiàn)最好，過高則會(huì)導(dǎo)致愈傷組織逐漸變得疏松綿軟，不利于不定芽分化。NAA 同樣對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)至關(guān)重要[35]，本研究發(fā)現(xiàn)，NAA 濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，其愈傷組織分化出不定芽的概率與數(shù)量均比其它濃度高；濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，其再生效果明顯下降。關(guān)于暗培養(yǎng)時(shí)間，本研究結(jié)果顯示，西南樺莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳時(shí)間為15 d，培養(yǎng)20 d 效果僅次于15 d，但培養(yǎng)10 d 效果則明顯降低。這可能與暗培養(yǎng)期間從培養(yǎng)基中吸收的TDZ 量有關(guān)，TDZ 具有快速誘導(dǎo)愈傷組織的效果，同時(shí)也具有劑量效應(yīng)，因此外植體不宜長時(shí)間培養(yǎng)在該培養(yǎng)基上，但時(shí)間過短亦達(dá)不到相應(yīng)效果。

分化率和增殖系數(shù)是決定不定芽分化效果的重要指標(biāo)。本文對(duì)比研究了6-BA、GA3、NAA 3 種激素對(duì)西南樺不定芽分化的影響，發(fā)現(xiàn)GA3的影響最大，而且不同濃度對(duì)應(yīng)的分化率和總增殖系數(shù)差異較大，濃度為0.1 和0.5 mg·L-1時(shí)，其分化率相差10%以上，總增殖系數(shù)相差0.5 以上。究其原因，GA3的使用有助于細(xì)胞伸長，加快不定芽的出芽速度，使得在統(tǒng)計(jì)時(shí)間段內(nèi)出現(xiàn)較多的不定芽[36]。與之不同的是，低濃度6-BA 和NAA 更有利于不定芽分化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，愈傷組織誘導(dǎo)階段TDZ 的添加可能影響了分化階段激素的添加。如前所述，TDZ 具有生長素和細(xì)胞分裂素的雙重功能，既可以作為一種潛在的細(xì)胞分裂素物質(zhì)，又可以誘導(dǎo)形成部分生長素類物質(zhì)。愈傷組織誘導(dǎo)階段高濃度TDZ 的添加使莖段愈傷組織積累了部分生長素和細(xì)胞分裂素類物質(zhì)，從而較低濃度的添加即可滿足愈傷組織分化的需求[37]。就6-BA 而言，雖然濃度越高，愈傷組織表面芽點(diǎn)越多，但過高的細(xì)胞分裂素/生長素比值容易導(dǎo)致這些芽點(diǎn)難以成芽，最終影響再生效率。本研究還發(fā)現(xiàn)，不添加NAA 時(shí)不定芽分化效果更好，亦可能與愈傷組織誘導(dǎo)階段TDZ 和NAA 的添加積累了較多的生長素類物質(zhì)有關(guān)，若在分化階段繼續(xù)添加生長素可能會(huì)導(dǎo)致激素配比不當(dāng)，從而影響不定芽的分化。因此，綜合考慮愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化兩階段的激素使用對(duì)再生體系的建立至關(guān)重要。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究圍繞西南樺節(jié)間莖段再生各階段展開試驗(yàn)，建立了完整的西南樺間接器官發(fā)生途徑再生體系。具體而言，增殖苗經(jīng)弱光培養(yǎng)(1 000 lx) 15 d 后轉(zhuǎn)至暗培養(yǎng)7 d，再正常光照(2 000 lx) 培養(yǎng)8 d 可獲得適度黃化的植株，其平均株高和節(jié)間長度分別為6.6 cm 和3.1 cm；以其節(jié)間莖段為外植體，接種于添加1.0 mg·L-1TDZ和0.2 mg·L-1NAA 的WPB5 培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)15 d 后轉(zhuǎn)接至含0.8 mg·L-16-BA 和 0.5 mg·L-1GA3的WPM 培養(yǎng)基上，正常光照培養(yǎng)2 個(gè)月，期間繼代1 次，則可實(shí)現(xiàn)愈傷組織分化率和凈增殖系數(shù)達(dá)88.9%和6.2 以上，平均每個(gè)植株可產(chǎn)生56.8個(gè)不定芽；不定芽接種于添加0.1 mg·L-1NAA 的WPM 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d 后生根率可達(dá)100%。本研究為西南樺的遺傳改良提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持，亦為其組培快繁開辟了一條行之有效的新途徑。