基于SSR 標記構建江西杉木核心種質及其分子身份證

婁永峰，朱柯帆，宋曉琛，冷春暉，陳興彬，肖復明＊

(1.江西省林業(yè)科學院，江西省植物生物技術重點實驗室，江西 南昌 330032；2.信豐縣林木良種場，江西 信豐 341602)

林以種為本，種以質為先。林木種質資源是林業(yè)種業(yè)發(fā)展的基礎，是林業(yè)生產力發(fā)展的基礎性資源和國家戰(zhàn)略性資源，隨著中國林業(yè)種業(yè)創(chuàng)新力度的不斷加大，愈發(fā)重視各類林木種質資源的保護和利用[1]。然而數量龐大的種質資源會影響種質的保存、評價和利用，特別是多年生林木種質，其樹體高大、個體占地面積廣、管理成本高，不便于種質資源的有效管理和深入研究[2-4]。因此，Frankel 和Brown 等提出并逐步發(fā)展了核心種質的概念，即運用一定的策略選取最小的種質資源數量以最大程度地代表種質資源的遺傳多樣性[5-6]。核心種質的構建主要基于表型性狀[7-8]或基于分子標記[9-11]。對于樹體高大、多年生林木來說，以DNA 多態(tài)性為基礎的分子標記不易受林木生長期和環(huán)境的影響，較表型性狀更適合其核心種質的構建[3,12]。目前利用分子標記的方法已在杜仲(Eucommia ulmoidesOliv.)[2]、核桃(Juglans sigillataDote)[3]、杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook)[4,13]、毛白楊(Populus tomentosaCarr.)[10]、美洲黑楊(P.deltoidesMarsh.)[14]、板栗(Castanea mollissimaBl.)[15]、 木 荷(Schima superbaGardn.et Champ.)[16]、紅錐(Castanopsis hystrixMiq.)[17]、刺槐(Robinia pseudoacaciaL.)[18]等林木上建立了核心種質。

杉木是我國重要的鄉(xiāng)土針葉用材樹種，主要分布于我國長江流域、秦嶺以南地區(qū)。20 世紀70 年代起，江西省開始收集保存杉木優(yōu)樹種質，建立來源豐富的種質資源庫，進行遺傳改良工作[19]。持續(xù)的種質資源收集為杉木種質創(chuàng)新和遺傳改良提供了豐富的材料，但日益劇增的種質資源數量不利于種質資源的保存、評價、創(chuàng)新研究及開發(fā)利用[4,19]。因此江西杉木核心種質的構建對充分利用現有江西杉木種質資源具有重要意義。同時目前的杉木種質資源收集、保存中由于缺乏統一、規(guī)范的編目工作等，導致存在本底不清，重復收集保存等問題[20]，故開展種質鑒定、分子身份證構建等工作對杉木種質資源的收集、保存和利用十分重要。本研究通過SSR 標記分析現有的江西杉木種質資源遺傳多樣性，構建核心種質，并根據SSR 分子指紋圖譜、種質資源信息等繪制核心種質分子身份證，為今后江西杉木種質資源的研究與利用提供理論依據和核心材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自江西省安?？h陳山林場和信豐縣林木良種場國家級杉木良種基地種質資源庫，包括江西地方特色杉木優(yōu)良種源-安福陳山紅心杉優(yōu)樹種質群體(安福群體，AF)、贛南地區(qū)杉木優(yōu)樹種質群體(贛州群體，GZ)和江西本省其他地區(qū)杉木優(yōu)樹種質群體(其他群體，QT)。其中安福陳山紅心杉種質群體165 份，其主要來自羅霄山脈陳山林區(qū)；贛南地區(qū)杉木優(yōu)樹種質群體224 份，其主要來自江西南部贛州全南、龍南、信豐等地；江西本省其他地區(qū)杉木優(yōu)樹種質群體106 份，其主要來自江西銅鼓、吉安、上饒、景德鎮(zhèn)等地。參試495 份材料均為優(yōu)樹無性系材料。

2021 年4 月，采集健康且無病蟲害的新葉，冰袋保存帶回實驗室放置-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA 提取與SSR 分析

采用改良CTAB 法提取杉木新葉DNA，在完成質量及濃度檢測后，定量至約30.0 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基于文獻檢索及課題組前期的杉木SSR 引物開發(fā)，最終篩選了20 對SSR 引物用于后續(xù)分析[19]。SSR 引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成，在每對引物的正向引物5′端進行M13 (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′) 修飾，然后合成3′端具有熒光的M13 接頭(FAM、HEX)，通過序列互補進行標記。SSR-PCR 體系(20.0 μL)：DNA 模板2.0 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，2 × Taq plus PCR Master Mix 10.0 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR 反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。熒光引物擴增產物送北京睿博興科生物技術有限公司進行分析。

1.3 數據分析

1.3.1 遺傳多樣性評價 運用PopGene 32 軟件開展遺傳多樣性分析，主要參數包括等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s 遺傳多樣性指數(H) 和Shannon’s 信息指數(I) 等，利用PICCalc 軟件計算SSR 標記的多態(tài)信息含量(PIC)。通過Ntsys 軟件采用UPGMA 進行聚類分析，構建樹狀圖。

1.3.2 核心種質構建及評價 利用Core finder 軟件[21]，以等位基因數最大化(M 策略) 為原則對SSR 數據進行分析，從供試江西杉木材料中抽取核心種質。核心種質構建完成后，對構建的核心種質的相關遺傳參數進行t檢驗來評價核心種質的代表性。同時通過主坐標分析(PCoA)對構建的核心種質進行確認。

1.3.3 核心種質分子身份證構建 依據SSR 標記PIC值的高低，依次增加標記數量進行核心種質的UPGMA 聚類分析，篩選能實現所有核心種質有效區(qū)分所需的最少SSR 標記組合，以這組SSR 標記作為高效標記組，用于后續(xù)核心種質SSR 分子指紋圖譜和分子身份證的構建。將高效SSR 標記組在核心種質中檢測到等位基因，按小到大的順序排序，然后用數字1～9 進行編碼，若等位基因數大于9 時，則用A～Z 編碼，缺失位點用0 表示，構建每個核心種質的SSR 分子指紋圖譜。將種質信息和SSR 分子指紋圖譜相結合，分別利用條碼生成器和二維碼生成器構建江西杉木核心種質的分子身份證。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

利用SSR 標記對江西杉木種質進行分析以探究其遺傳多樣性，結果發(fā)現(表1)：20 個SSR 標記在495 份江西杉木種質中共檢測到等位基因數(Na)122 個，平均為6.1 個位點，其中CLSSR33標記最少，僅有2 個，CLSSR9 標記最多，達15 個。所選擇的20 個標記中，獲得等位基因數(Na)在5 個以上的標記有16 個，表明本研究選擇的SSR 標記位點多態(tài)性較好，可用于江西杉木種質的遺傳多樣性分析。此外，20 個標記位點的有效等位基因數(Ne) 變化范圍在1.014～3.405 之間，平均值為1.836；Shannon’s 信息指數(I)變化范圍為0.045～1.428，平均值為0.762；Nei’s遺傳多樣性指數(H) 變化范圍在0.014～0.706 之間，平均值為0.400；觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He) 均值分別為0.394 和0.400，Ho＜He；位點多態(tài)性信息含量(PIC) 的變化范圍為0.014～0.657，平均值為0.357，其中低度多態(tài)性位點6 個(PIC≤0.25)；中度多態(tài)性位點11 個(0.25＜PIC＜0.5)；高度多態(tài)性位點3 個(PIC≥0.5)。以上結果表明495 份江西杉木種質的遺傳多樣性較豐富。

表1 江西杉木495 份種質遺傳多樣性參數Table 1 The genetic diversity parameters of C.lanceolata germplasms from Jiangxi

2.2 核心種質構建與評價

利用Core Finder 軟件，采用M 策略進行抽樣構建核心種質，結果表明當抽取種質數量為52 份時，等位基因保留比例接近100%。因此，基于SSR 基因型數據從495 份江西杉木種質中抽取52 份核心種質，抽樣比例為10.5%，其中安福陳山紅心杉種質10 份，贛南地區(qū)種質20 份，江西其他地區(qū)的種質22 份。

通過遺傳多樣性參數分析對構建的江西杉木52 份核心種質的代表性進行評價，結果表明(表2)，與原種質比較，核心種質的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Shannon’s 信息指數(I)、Nei’s 遺傳多樣性指數(H)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He) 和多態(tài)信息含量(PIC) 的保留比例依次為100.0%、107.4%、115.1%、109.0%、104.1%、110.0% 和111.2%，且t檢驗顯示核心種質與原種質間各遺傳多樣性參數差異不顯著，說明構建的核心種質很好的保留了原種質的遺傳多樣性，因此初步認為52 份核心種質能夠代表495 份原種質。PCoA 對核心種質作進一步確認，結果顯示，江西杉木52 份核心種質較為均勻地分布在495 份原種質中(圖1)，說明構建的核心種質具有較好的代表性。

圖1 江西杉木核心種質PCoA 分析Fig.1 The principal coordinates analysis of core collection of C.lanceolata germplasms from Jiangxi

基于聚類分析52 份核心種質可分為6 大類。其中，核心種質QT065、QT099 和GZ012 均單獨形成一類；核心種質GZ051 和GZ209 則形成一類，QT059 和QT063 組成一類；其余45 份核心種質則形成一大類。

2.3 核心種質分子身份證構建

由于杉木為二倍體，每個SSR 位點應由2 個相同或不同的等位基因組成。SSR 標記的等位基因數、基因型越多，PIC值越高，能區(qū)分種質的能力也越強，在繪制指紋圖譜中價值也越高。基于最少標記區(qū)分最多種質的原則，依據SSR 標記的PIC值的高低，依次增加標記數量對核心種質進行區(qū)分，結合UPGMA 聚類，結果發(fā)現H97 標記與H286、CLSSR9 和CLSSR37 相結合，就可將52 份江西杉木核心種質完全鑒別區(qū)分(圖2)。

圖2 基于UPGMA 聚類的江西杉木核心種質鑒別分析Fig.2 The identification of core collection of the C.lanceolata germplasms from Jiangxi by UPGMA

通過H97、H286、CLSSR9 和CLSSR37 這4 個高效SSR 標記在52 份核心種質中檢測到的等位基因，構建每份核心種質的SSR 分子指紋圖譜(圖3)。將獲得SSR 分子指紋圖譜數據與種質信息編碼一同構建核心種質特異的分子身份證碼。參考王華緘等[20]，種質信息編碼共有6 位數字組成，分為3 個部分，第1～3 位表示種質原產地信息，如001 為江西省安福縣；第4 位是種質資源類別，1 表示一代優(yōu)樹，2 表示二代優(yōu)樹、3 表示三代優(yōu)樹等；第5～6 位表示收集、保存時間，如79 表示1979 年。若上述信息未知或不清楚則用X 表示。以AF047 為例（圖4），其分子身份證號碼為00110668444B34，表示該種質原產地江西省安?？h，收集、保存的為1 代優(yōu)樹，時間為2006年，4 個核心標記（H97、H286、CLSSR9 和CLSSR37）的指紋圖譜依次為68/44/4B/34。最后利用每份種質的14 位分子身份證編號，分別制作條形碼和二維碼（圖4）。

圖3 江西杉木核心種質的SSR 分子指紋圖譜Fig.3 The DNA fingerprint of the core collection of the C.lanceolata germplasms from Jiangxi

圖4 部分江西杉木核心種質的DNA 分子身份證Fig.4 The DNA molecular IDs of some core collection of the C.lanceolata germplasms from Jiangxi

3 討論

進行遺傳多樣性評價是開展種質資源評價工作的重要組成部分。開展杉木種質資源的遺傳多樣性研究對收集、保存、評價和利用杉木種質材料的意義重大。江西是我國杉木的主要的分布和中心產區(qū)之一，栽培歷史悠久，在長期的自然選擇和人工選擇作用下形成一些頗具特色的優(yōu)良種質資源，如安?！瓣惿郊t心杉”、武寧“瓜源木”、遂川“龍泉木”、全南“黃田江杉木”等[22]，使得江西擁有豐富的杉木種質資源。本研究采用20 個SSR 標記在495 份江西杉木種質中共檢測到122 個等位基因(Na)，平均Shannon’s 信息指數(I)、平均Nei’s 遺傳多樣性指數(H)、平均觀測雜合度(Ho)和平均期望雜合度(He)分別為0.762、0.400、0.394 和0.400，與其他采用相同技術進行的杉木相關研究結果比較[4,13,23-24]，江西杉木種質資源具有較豐富的遺傳多樣性。

在林木育種中，核心種質在親本選擇、雜交育種、種質保存和利用等方面發(fā)揮著重要作用。核心種質是通過從整個種質資源中選擇出少量且具有代表性的種質材料，可以最大程度的代表原種質的遺傳多樣性水平。因此，在構建核心種質中應優(yōu)先考慮選擇稀有位點，最大限度保留原種質的等位基因多樣性[4,25]。M 策略基于等位基因的最大化，同時兼顧遺傳多樣性，是目前最具優(yōu)勢的一種方法。通過Core Finder 軟件以M 策略構建核心種質已在杜仲、杉木、木荷等林木上成功應用[2,4,16]。因此，本研究選擇基于M 策略利用Core Finder 軟件構建江西杉木種質資源的核心種質，結果從495 份江西杉木原種質中得到52 份核心種質，同時通過t檢驗和PCoA 分析，顯示獲得的核心種質具有更豐富的遺傳多樣性，且均勻分布于原種質資源中，表明構建的核心種質可靠有效，具有代表性。

核心種質構建的宗旨是以最小的資源數量和遺傳重復包含原種質中最大的遺傳多樣性。因此，確定合理取樣比例是關鍵[9]。目前研究表明林木種質資源的核心種質取樣比例一般在10%～30%之間。方樂成等[26]分析了192 份楸樹(Catalpa bungeiC.)種質的遺傳多樣性，獲得了46 份核心種質，抽樣比例23.96%；劉松等[15]利用SSR 標記建立了占原種質24.85%的中國板栗核心種質；楊漢波等[16]基于SSR 標記從754 份木荷種質資源中獲得了115 份核心種質，占原種質的15.3%；李洪果等[2]則從887 份杜仲種質中得到189 份核心種質和698 份保留種質，核心種質占原種質的21.3%。在本研究中，根據SSR 標記分析結果，基于M 策略從495 份原種質中抽取了52 份核心種質，經過遺傳多樣性評價和顯著性t檢驗，確定江西杉木核心種質合適的取樣比例為10.5%。這個比例與已報道的同樣基于SSR 標記獲得的廣西杉木核心種質占比9.3%接近[4]；低于Duan 等[13]從南方6 個省份700 份杉木基礎群體中構建300 份核心種質的比例，也低于在SNP 標記基礎上獲得杉木核心育種群體占比(64.7%)以及速生優(yōu)質杉木核心種質占比(50%)[27-28]。本研究的杉木種質均來源江西省，李魁鵬等[4]杉木種質則主要來源廣西境內，兩者的遺傳結構較Duan 等[13]700 份杉木材料來源南方6 省市相對簡單。這符合核心種質的取樣比例應根據原種質資源的遺傳結構和數量規(guī)模來決定[29]。江西杉木52 份核心種質中安福陳山紅心杉種質10 份(6.1%)、贛南地區(qū)種質20 份(8.9%)、江西其他地區(qū)的種質22 份(20.8%)，安福陳山紅心杉種質資源較多，但抽取的核心種質反而較少，這可能與陳山紅心杉種質資源遺傳多樣性水平偏低有關[19]。

本研究中，52 份核心種質的等位基因數(Na)的保留比例為100%，而有效等位基因數(Ne)、Shannon’s 信息指數(I)、Nei’s 遺傳多樣性指數(H)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC) 6 個參數的保留比例大于100%，這主要是由群體中的樣本量和等位基因頻率改變引起。這些遺傳參數都是根據等位基因頻率按不同的方法估算獲得，用于度量不同群體在多樣性上的遺傳冗余情況，而核心種質的構建是一個減少頻率高等位基因、增加稀有等位基因比例的過程，在去除遺傳冗余的過程中，各等位基因頻率的不規(guī)律增減會導致相應遺傳多樣性參數保留比例大于100%，這一現象在杜仲[2]、毛白楊[10]、木荷[16]和新疆野杏(Armeniaca vulgarisLam.)[25]等的核心種質構建中均存在。

隨著DNA 分子指紋圖譜的快速發(fā)展，SSR 等分子標記的檢測結果可進一步轉化為字符串、條形碼或二維碼，即DNA 分子身份證[30]。種質鑒定是種質資源收集、評價、保存和利用的基石，DNA分子身份證是種質鑒定的重要工具，目前已被廣泛應用在作物、菌類、果樹、花卉等種質鑒定[30-32]，近年來，這一技術也逐步應用于林木種質資源的鑒定[33]。胡春龍等[34]構建了46 份白蠟(Fraxinussp.)種質資源的分子身份證，為白蠟新品種的審定、DUS測試等奠定了理論基礎。張成才等[35]對36 個薄殼山核桃(Carya illinoinensis(Wangenh.) K.Koch)國外引種品種建立分子身份證，為區(qū)分和鑒別薄殼山核桃品種提供參考。本研究在運用SSR 標記分析江西杉木遺傳多樣性的基礎上，構建了其核心種質的DNA 指紋圖譜，繪制了相應的分子身份證。不同于已報道的杉木分子身份證，本研究構建的分子身份證不僅包含了杉木種質的DNA 指紋圖譜信息，同時借鑒作物、果樹等種質的分子身份證構建方法，設定了包含種質原產地、種質資源類別、收集保存時間的補充碼，進一步增加所繪制的種質分子身份證的可靠性和特異性。

4 結論

本研究利用前期篩選的20 個杉木SSR 標記，分析了495 份江西杉木種質的遺傳多樣性，并利用M 策略構建了含有52 份材料的江西杉木核心種質，核心種質保留了原種質10.5%，等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Shannon’s 信息指數(I)、Nei’s 遺傳多樣性指數(H)的保留比例依次為100.0%、107.4%、115.1%、109.0%，表明本研究建立的核心種質是有效的。同時根據標記的多態(tài)性信息含量(PIC) 和鑒別能力，確定了H97、H286、CLSSR9 和CLSSR37 等4 個標記能夠實現52 份核心種質的有效區(qū)分，并構建了52 份核心種質的分子指紋圖譜和分子身份證，為杉木種質資源的收集、保存和利用提供了理論基礎。