金銀花黑斑病病原菌番茄匍柄霉的分離與鑒定

劉端沖，楊金庫，林若竹，姚艷霞，淮穩(wěn)霞＊，趙文霞＊

(1.國家林業(yè)和草原局森林保護學(xué)重點實驗室 中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護研究所，北京 100091；2.廊坊市農(nóng)林科學(xué)院，河北 廊坊 065000)

金銀花學(xué)名忍冬（Lonicera japonicaThunb.），是一種重要的藥用植物，具有廣泛的藥理作用，如抗菌、抗炎、抗病毒、抗內(nèi)毒素、減脂、解熱等[1-2]。金銀花在國內(nèi)分布十分廣泛，其種植區(qū)域主要集中在山東、河北和河南等省份，其中河北省巨鹿縣為全國金銀花三大主產(chǎn)地（河北巨鹿、河南封丘、山東平邑）之首，成為當(dāng)?shù)氐闹еa(chǎn)業(yè)，獲得“中國金銀花之鄉(xiāng)”的稱號[3-4]。

金銀花葉部病害是田間生產(chǎn)的巨大障礙，主要有褐斑?。–ercospora rhamniFuckel）、白粉病（Microsphaera liniceraeWint.inRabenh）等。其中，金銀花褐斑病對金銀花的產(chǎn)量與質(zhì)量有嚴重影響。此前，有報道認為金銀花褐斑病的病原菌是鼠李尾孢（C.rhamni）[5-6]，也有研究認為是多主棒孢霉（Corynespora cassiicola(Berk.& M.A.Curtis) C.T.Wei）[7-8]；2014 年，de Miranda 等人的研究表明假尾孢屬真菌（Pseudocercospora lonicerigenaU.Braun & Crous）是引起巴西金銀花褐斑病的病原菌[9]；2016 年張永信等人的研究發(fā)現(xiàn)擬莖點霉屬真菌（Phomopsissp.）也可以使金銀花產(chǎn)生褐斑病[10]。

2014 年到2018 年期間，筆者在研究河北金銀花褐斑病病原過程中，總能分離到一種產(chǎn)棕黃色或紅色色素的真菌，其分出率約為17%。利用離體葉片致病性接種時，該菌產(chǎn)生的病斑與褐斑病不符，并依據(jù)ITS 序列和形態(tài)特征將其初步鑒定為匍柄霉（Stemphyliumsp.）。針對這種金銀花新型葉斑病，本文依照科赫氏法則對其病原菌進行了致病性測定，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和多基因片段分析對其進行了分類鑒定，并將該病害命名為金銀花黑斑病，以期為該病害的有效防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及病原菌的分離純化

本項研究所用金銀花病葉樣采集自河北省巨鹿縣和廊坊市。樣本利用自封袋包裝并按野外樣本采集要求記錄采集時間、地點、采集人、環(huán)境條件等要素后，帶回實驗室用于病原菌分離鑒定。

病原菌的分離采用常規(guī)組織分離法。首先將采集的葉片用無菌水沖洗干凈，用剪刀將病葉的病健交界處剪為4 mm × 4 mm 的小組織塊，于超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 s；隨后用無菌水淋洗，再用0.1%升汞溶液浸泡2 min，無菌水洗3 次；用無菌濾紙吸去葉組織塊表面的水分后，再將其擺放至PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L）平板上進行分離培養(yǎng)。每個平板均勻擺放6 個組織塊，于25 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h 后，挑取已長出菌落的邊緣菌絲進行菌株的純化，從而獲得純菌株。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

將純化后的菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后，分別轉(zhuǎn)接到新的PDA 和PCA（馬鈴薯和胡蘿卜各100 g, 葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L）培養(yǎng)基上，于25 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，觀察并記錄菌落的形狀、顏色、光澤度、質(zhì)地等培養(yǎng)特征。分別采用番茄快速誘導(dǎo)產(chǎn)孢法和雙玻片插片誘導(dǎo)產(chǎn)孢法誘導(dǎo)該菌株產(chǎn)孢[11-12]，菌株的顯微特征主要包括菌株分生孢子的大小、形狀，分生孢子梗的形狀等特征，并拍照。

番茄快速誘導(dǎo)產(chǎn)孢法：將接種于PDA 上的匍柄霉菌在恒溫培養(yǎng)箱中按照12 h 光照12 h 黑暗光周期在溫度25 ℃下培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)皿；取菌絲生長邊緣的匍柄霉菌片接種到經(jīng)過催芽處理新長出的番茄葉片上，在溫度25 ℃、相對濕度60%～80%與12 小時光照12 小時黑暗光周期的條件下培養(yǎng)3 d，挑取匍柄霉菌片表面在顯微鏡下觀察。

雙玻片插片誘導(dǎo)產(chǎn)孢法：于25 ± 1 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3～4 d 后，取3～5 個平板于菌落邊緣1～2 cm 處以30°～45°角斜插入潔凈的雙層重疊的蓋玻片，然后放置 25 ± 1 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3～4 周左右。用鑷子取出誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4 周后的雙層玻片，并輕輕分成2 個單層玻片，單層玻片的正面載有菌體，在顯微鏡下觀察。

1.3 DNA 提取、PCR 擴增及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

所獲得的純菌株于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，刮取少量菌絲置于2 mL 離心管中，采用改良的CTAB 法提取本研究所用菌株的DNA[13]，利用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、引物gpd1（5′-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3′）/gpd2（5′-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3′）和引物EF446F（5′-TCACTTGATCTACAAGTGCGG TGG-3′）/EF1473R（5′-CGATCTTGTAGA CAT CCTGGAGG-3′）分別擴增核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、3-磷酸甘油脫氫酶（gpd）和蛋白延伸因子（EF-1α）基因片段[14-16]。ITS 基因片段反應(yīng)體系為（25 μL）：12.5 μL 2 × Taq PCR Master Mix（天根生化科技（北京）有限公司），9.5 μL ddH2O, 1 μL ITS1, 1 μL ITS4 和1 μL DNA 模板。gpd基因片段反應(yīng)體系（25 μL）：12.5 μL 2 ×Taq PCR Master Mix，9.5 μL ddH2O, 1 μLgpd1,1 μLgpd2 和1 μL DNA 模板。EF-1α 基因片段反應(yīng) 體 系 為（25 μL）：12.5 μL 2 × Taq PCR Master Mix，9 μL ddH2O, 1 μL EF446F, 1 μL EF1473R 和1.5 μL DNA 模板。ITS 序列PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35 個循環(huán)，最后72 ℃延 伸10 min，4 ℃保 存。gpd序列PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min，35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。EF-1α 序列反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 3 min，35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物于1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京擎科生物公司進行測序。

測序所獲得的拼接序列在NCBI 中進行比對，確定菌株分類地位，并從GenBank 中下載相似性高的序列或近緣物種序列作為參考序列（表1）。使用MEGA 10.2.2 軟件[17]進行序列對齊和剪切，以ITS-gpd-EF-1α 的順序進行序列串聯(lián)，并分別利用最大似然法（ML）、貝葉斯法（BI）和最大簡約法（MP）進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，外群為互隔鏈格孢菌Alternaria alternataEGS34-016。

表1 用于分子系統(tǒng)發(fā)育分析的參考菌株信息Table 1 The information of strains used for phylogenetic analysis

1.4 致病性檢測

本研究分別對金銀花和番茄的葉片進行致病性接種實驗。

金銀花葉片接種：采用刺傷接種菌絲塊的方法對健康的金銀花活體葉片進行致病性測定。首先將純菌株培養(yǎng)4～5 d 后打取菌落邊緣直徑為5 mm的菌餅；用75%酒精對葉片進行表面消毒，用接種針刺傷接種部位，菌餅接種于刺傷處，以無菌PDA 瓊脂塊接種作為對照，每組處理設(shè)10 次重復(fù)。接種后于25 ℃下恒溫放置9 d，觀察并記錄發(fā)病狀況。隨后，通過常規(guī)組織分離法，取病健交界處進行病原菌的再次分離和純化；通過菌株菌落形態(tài)結(jié)合ITS 序列，確定菌株是否與接種菌株相同。

番茄葉片接種：采用刺傷接種菌絲塊的方法對健康的番茄離體葉片進行致病性測定，具體步驟同上。接種后于25 ℃下恒溫放置48 h，觀察并記錄發(fā)病情況，并進行病原菌的再次分離、純化和復(fù)核鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

在田間調(diào)查和實驗中，該病害主要危害金銀花的葉片，發(fā)病初期（5—8 月份），通常在葉片邊緣產(chǎn)生芝麻粒大小的灰黑色小斑點。9 月份進入發(fā)病后期，黑色病斑逐漸擴大，有時多個小斑擴大后融合在一起，呈不規(guī)則狀。不同于褐斑病，該病斑能橫跨葉脈，后期數(shù)個小斑融合在一起，發(fā)病嚴重時，葉片枯黃脫落（圖1）。

圖1 金銀花黑斑病不同時期的危害癥狀Fig.1 Symptoms of the black spot disease in different periods on Lonicera japonica

2.2 病原菌的分離

對采集到的金銀花葉片樣品進行分離培養(yǎng)，分離純化后得到的純菌株在PDA 培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出相同的菌落，經(jīng)過ITS 序列比對，初步確定所分離得到的菌株屬于同一種。挑選其中1 株（YP4）作為代表菌株進行后續(xù)形態(tài)學(xué)觀察和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

供試菌株YP4 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后，形成表面為灰白色或黃白色、棉絮狀的菌落。菌落呈同心環(huán)狀，中心為灰白色，外圍白色發(fā)黃，并在PDA 培養(yǎng)基上產(chǎn)生棕黃色至深紅色色素。經(jīng)過番茄快速誘導(dǎo)產(chǎn)孢法和雙玻片插片誘導(dǎo)產(chǎn)孢法誘導(dǎo)后，在顯微鏡下未觀察到其分生孢子及分生孢子梗，僅觀察到其菌絲。該菌株的菌絲光滑，直或彎曲，有分隔，具叉狀分枝，直徑約為1.8～2.5 μm（圖2）。

圖2 菌株YP4 的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of the strain YP4

2.4 病原菌分子鑒定

本研究基于ITS、gpd和EF-1α 3 個基因片段利用最大似然法（ML）、貝葉斯法（BI）和最大簡約法（MP）分別構(gòu)建了匍柄霉屬的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3～5），3 個樹中包含1 個供試菌株YP4 和36 個從Genbank 庫中下載的參考菌株，以及1 個外類群菌株Alternaria alternata。ITS、gpd和EF-1α 3 個基因獲得擴增片段大小分別為530、533和 674 bp（GenBank 登 錄 號OQ157590、OQ186451 和OQ185385），串聯(lián)后總長度為1 737 bp， 菌株YP4 與番茄匍柄霉Stemphylium lycopersici(EGS45-036、EGS45-043) 的參考序列進行多重比對時的一致性均為100%。并在3 種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3～5）中，菌株YP4均與番茄匍柄霉S.lycopersici同源性最高，在ML樹中以86% 的支持率聚為一支，在BI 樹中以0.92 的支持率聚為一支，在MP 樹中以85%的支持率聚為一支。

圖3 基于最大似然法(ML) ITS、gpd 和EF-1α 聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.3 Maximum likelihood phylogenetic tree based on combined datasets of ITS，gpd and EF-1α

圖4 基于貝葉斯法（BI）ITS、gpd 和EF-1α 聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.4 Bayesian phylogenetic tree based on combined datasets of ITS，gpd and EF-1α

圖5 基于最大簡約法（MP）ITS、gpd 和EF-1α 聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.5 Phylogenetic tree (MP) based on combined datasets of ITS，gpd and EF-1α

2.5 致病性測定

在對金銀花活體葉片接種9 d 后，葉片上產(chǎn)生病斑，呈不規(guī)則狀，邊界不清晰，橫跨葉脈，并產(chǎn)生灰白色霉層，而對照組葉片無明顯癥狀（圖6）。根據(jù)柯赫氏法則，將接種葉片進行再分離，分離得到的菌株的形態(tài)特征與接種所用菌株相同。

圖6 致病性接種實驗金銀花葉片癥狀Fig.6 Symptoms of leaves of Lonicera japonica after inoculation of the strain YP4

在對番茄離體葉片接種48 h 后，接種葉片上產(chǎn)生黑色病斑，呈不規(guī)則狀，邊界不清晰，橫跨葉脈。而對照組葉片無明顯癥狀（圖7）。從表現(xiàn)癥狀的番茄離體葉片病斑上均能再次分離得到所接種的真菌菌株。

圖7 致病性接種實驗番茄葉片癥狀Fig.7 Symptoms of leaves of Solanum lycopersicum after inoculation of the strain YP4

3 討論

本研究中所獲得的菌株在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上與番茄匍柄霉聚為一支，在形態(tài)學(xué)上雖未能觀察到該菌株的分生孢子和分生孢子梗，但其菌落形態(tài)與番茄匍柄霉相同，并且將該菌株接種到金銀花葉片和番茄葉片上均可引起明顯癥狀。因此，本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)以及致病性分析，將引起河北省金銀花黑斑病的病原菌鑒定為番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici(Enjoji) Yamamoto）。

由番茄匍柄霉引起的金銀花黑斑病與金銀花褐斑病相比有很大的不同：褐斑病的癥狀為發(fā)病初期在葉上形成褐色小點，后擴大成褐色圓斑或不規(guī)則病斑，病斑邊緣受葉脈限制呈多棱狀[17]。而這種黑斑病初期為芝麻狀小黑斑，后期擴大為不規(guī)則狀黑斑，并且能夠橫跨葉脈。

番茄匍柄霉隸屬匍柄霉屬（StemphyliumWallr.），該屬是1883 年由Wallroth 以簇孢匍柄霉（S.botryosum）為模式種創(chuàng)立的。本屬內(nèi)大部分種類通過產(chǎn)生分生孢子進行無性繁殖，有一些種有性型為格孢腔菌屬 (PleosporaRabenh.ex Ces.&De Not.)，隸屬于格孢腔菌目 (Pleosporales)，格孢腔菌科 (Pleosporaceae)。匍柄霉屬包括多種腐生真菌及病原真菌，其中病原真菌可危害包括多種農(nóng)作物在內(nèi)的寄主植物。匍柄霉屬在形態(tài)上與其相近屬鏈格孢屬（AlternariaNees）相似，它們的分生孢子都是多隔且著色的，形成于由菌絲產(chǎn)生的分生孢子團上，而兩屬的區(qū)別在于匍柄霉屬可在菌絲頂端的分生孢子團上產(chǎn)生連續(xù)的分生孢子[16,18-19]。匍柄霉屬中的番茄匍柄霉也是一種世界性分布的重要植物病原菌，能夠引起番茄、辣椒、茄子、萵苣和人參果等多種寄主植物產(chǎn)生葉斑病，于1931 年被Enjoji 從日本的番茄葉片上被首次分離出來[20-23]。有研究表明，該種匍柄霉通過合成和釋放植物毒性次生代謝物破壞植物細胞，從而導(dǎo)致植物發(fā)病[24]。在中國，番茄匍柄霉于2001 年首次在山東省泰安市被發(fā)現(xiàn)，其寄主植物為番茄[18]；隨后，在我國多次發(fā)現(xiàn)番茄匍柄霉引起番茄產(chǎn)生灰葉斑病[25-27]；此外，在國內(nèi)番茄匍柄霉也可危害茄子、辣椒、柑橘、向日葵等經(jīng)濟作物的葉部[28-30]，還有研究發(fā)現(xiàn)甜瓜根部病害也與番茄匍柄霉有關(guān)[31]。而本研究是番茄匍柄霉在我國危害金銀花的首次報道，進一步拓寬了該病菌的寄主范圍。

4 結(jié)論

本研究對采自河北省金銀花樣品進行了分離與純化，結(jié)合形態(tài)學(xué)和多基因片段分析對其病原菌進行了分類鑒定，并依照科赫氏法則進行了致病性測定，發(fā)現(xiàn)了一種由番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）引起的金銀花新型葉斑病，并將該病害命名為金銀花黑斑病，為金銀花病害的科學(xué)防控提供了一定的理論依據(jù)。