基于UPLC-MS/MS的土壤中敵草隆殘留檢測技術(shù)

施超宇，孫曉欣，吳嶸，楊勇，王雪，肖學(xué)喜

(浙江中一檢測研究院股份有限公司，浙江 寧波 315040)

敵草隆(diuron)是取代脲類除草劑中的一類，分子式為C9H10Cl2N2O，其除草作用以光合作用抑制劑的方式實(shí)現(xiàn)。在被植物根系吸收后，敵草隆會迅速擴(kuò)散至莖和葉，從而抑制其光合作用，達(dá)到除草效果[1]。低劑量的敵草隆能夠根據(jù)位置和時間的差異進(jìn)行選擇性除草，而高劑量的敵草隆則能作為滅生性除草劑。由于其高藥效、低用量、廣譜殺草的特點(diǎn)，敵草隆被廣泛用于水稻、棉花、甘蔗等耕作區(qū)除草，也可用于非耕作區(qū)的雜草[2]。

敵草隆具有不溶于水、熔點(diǎn)高等性質(zhì)，導(dǎo)致其在施用過程中具有穩(wěn)定性好、殘留性強(qiáng)的特點(diǎn)。當(dāng)敵草隆作為除草劑被廣泛施用到田間后，未被植物根系吸收的部分會擴(kuò)散到多種環(huán)境介質(zhì)中，包括大氣、水體以及土壤環(huán)境，且能長期滯留。其中，敵草隆在土壤中的殘留問題最為顯著，且存在隨降雨作用進(jìn)一步污染地表、地下水的潛在生態(tài)風(fēng)險[3]。

目前，美國、加拿大、法國、荷蘭和日本等國家在水中相繼檢測出敵草隆，其中美國和加拿大已將敵草隆列為環(huán)境污染物重點(diǎn)監(jiān)測對象，同時，美國環(huán)保局宣布對敵草隆限量使用[4-10]。相關(guān)研究表明，敵草隆及其代謝產(chǎn)物通過水生動物-鳥類-哺乳類等食物網(wǎng)的傳遞作用產(chǎn)生生物富集，且其對食物網(wǎng)中的多種動物具有毒副作用和一定的致癌性[11]。此外，敵草隆能影響人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響人體的正常代謝，對人體具有致癌、致突變潛在危害[12-13]。

目前，敵草隆的檢測主要通過氣相色譜法[14-15]、氣相色譜-質(zhì)譜法[16]、液相色譜法[17-20]、超高效液相色譜[21]、液相色譜-質(zhì)譜法和電流分析法[22]等，而超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)用于土壤中敵草隆檢測的相關(guān)報道較少。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法能夠更加精確地檢測敵草隆，減少雜亂峰的干擾。因此，本研究綜合采用加壓溶劑萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法對土壤中殘留的敵草隆開展分析，為土壤中敵草隆殘留分析提供一種新思路。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

冷凍干燥機(jī)(新芝，SCIENTZ-50ND)；加壓流體萃取儀(賽默飛，ASE350)；超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀(島津，8045)。

敵草隆標(biāo)準(zhǔn)品溶液：稱取敵草隆標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 mg·L-1，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)0.10 g，用100 mL甲醇定容作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1 000 μg·mL-1)，4 ℃避光保存6個月。根據(jù)需要，于10 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度，稀釋為敵草隆標(biāo)準(zhǔn)使用液(10 μg·mL-1)；甲醇(色譜純)；甲酸(色譜純)；二氯甲烷(色譜純)；乙酸銨(色譜純)；乙酸銨-甲酸水溶液(0.01%甲酸水+5 mmol·L-1乙酸銨)；固相萃取柱：填料為Carb/PSA石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜工作條件

色譜柱：C18柱，(柱長100 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒徑3.0 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL，流速為0.3 mL·min-1；流動相：包括流動相A和流動相B，流動相A：0.01%甲酸+5 mmol·L-1乙酸銨；流動相B：甲醇。

1.2.2 質(zhì)譜工作條件

電離方式：正離子模式(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測MRM模式；霧化氣：3 L·min-1，霧化氣為氮?dú)?；加熱氣?0 L·min-1；接口溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；干燥器流量：10 L·min-1；碰撞氣為氬氣。

1.2.3 冷凍干燥機(jī)工作條件

真空度<10 Pa，凍干時間24 h。

1.2.4 壓力溶劑萃取儀工作條件

壓力10.34 MPa，萃取溫度100 ℃，加熱5 min，靜態(tài)萃取5 min，沖洗量45%，吹掃時間70 s，循環(huán)萃取2次。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

去除所采集的土壤樣品中含有的沙礫和植物根系等雜質(zhì)后，使用冷凍干燥機(jī)對初步處理的土壤樣品進(jìn)行冷凍干燥，將冷凍干燥后的土壤樣品進(jìn)行研磨，過篩(1 mm孔徑)，裝入棕色玻璃瓶并密封，待用。

1.3.2 敵草隆萃取

稱取20.0 g的待用土壤，裝入快速溶劑萃取儀配備的萃取池中，加入甲醇-二氯甲烷(體積比1∶2)混合溶劑(體積)，使用壓力溶劑萃取儀的加壓流體萃取模式。萃取結(jié)束后，收集萃取液。

使用5 mL體積比為1∶9的甲醇-二氯甲烷混合溶劑活化Carb/PSA石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基固相萃取柱，活化結(jié)束后，取5 mL甲醇-二氯甲烷混合溶劑洗脫萃取柱，收集洗脫液；利用水浴氮吹儀濃縮淋洗液，氮吹儀氮吹溫度35～50 ℃，濃縮至1 mL左右。將濃縮后的淋洗液加至固相萃取柱中進(jìn)行凈化提取，收集萃取液；使用體積比為1∶9的甲醇-二氯甲烷混合溶劑洗脫，再次收集洗脫液，合并兩次洗脫液；用水浴氮吹儀對洗脫液進(jìn)行濃縮，氮吹溫度為40 ℃，濃縮至1 mL以下，加入少量甲醇淋洗瓶壁，繼續(xù)濃縮至近干，用甲醇溶液定容至1 mL，振蕩混勻，上機(jī)測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件優(yōu)化

丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑常用于提取土壤中的敵草隆，在以往研究中，甲醇對不同介質(zhì)樣品中敵草隆的選擇性較強(qiáng)，是一種較為理想的提取劑[18]。為了進(jìn)一步優(yōu)化土壤中敵草隆的提取條件，本方法比較了甲醇、二氯甲烷、二氯甲烷-丙酮、二氯甲烷-甲醇等不同種類和混合比例的提取液對凍干土壤中敵草隆的提取效率(圖1)。

圖1 不同提取液對敵草隆提取效率的影響Fig.1 Effect of different extraction solutions on the extraction efficiency of diuron

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用甲醇提取時，由于提取液中含水量較高，會使得敵草隆檢測值偏低，導(dǎo)致檢測結(jié)果失真；使用二氯甲烷提取時，提取液中容易含有較多雜質(zhì)，存在基線效應(yīng)，對目標(biāo)化合物的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾；使用二氯甲烷-丙酮提取時，目標(biāo)化合物回收率較低，僅在70%左右；采用二氯甲烷-甲醇體系進(jìn)行提取，且二氯甲烷和甲醇比例為2∶1時，敵草隆提取率較高，約為75%，有機(jī)相中含水率低且提取物中所含雜質(zhì)較少。因此，最終選擇使用二氯甲烷-甲醇2∶1的混合溶液進(jìn)行2次加壓流體萃取，確保敵草隆能最大程度被提取。

2.2 梯度洗脫程序

本方法采用梯度洗脫，流動相選取0.01%甲酸+5 mmol·L-1乙酸銨和甲醇，流動相梯度洗脫參數(shù)如表1所示。在該梯度洗脫程序下得到的敵草隆樣品，在保留時間為8.513 min時出峰，出峰時間適當(dāng)，峰形尖銳，平衡時間短(圖2)，可以排除來自其他成分的干擾，目標(biāo)組分可與樣品中其他組分較好地分離，能更精確分析土壤中敵草隆的殘留量。

表1 流動相梯度洗脫參數(shù)Table 1 Parameters of mobile phase gradient elution

圖2 土壤中敵草隆譜圖Fig.2 Diuron spectrum in soil

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限

準(zhǔn)確移取100 μL敵草隆標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1 000 μg·mL-1)于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成敵草隆標(biāo)準(zhǔn)使用液(10 μg·mL-1)。分別吸取適量的敵草隆標(biāo)準(zhǔn)使用液，用甲醇配制成濃度依次為20、50、100、200、500 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。使用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照濃度由低到高進(jìn)行檢測分析，以敵草隆濃度為X，峰面積為Y建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，獲得敵草隆的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(圖3)。該方法下的敵草隆在濃度范圍20～500 μg·L-1內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(R2=0.999 5)，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1 526.21X+9 850.80。

圖3 敵草隆標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.3 Standard working curve of diuron

按照HJ 168-2020《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》檢出限的確定方法，重復(fù)7次空白試驗(yàn)測定空白加標(biāo)樣品，檢測結(jié)果平均值為12.570 μg·g-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%，計算本方法的檢出限為0.000 287 μg·g-1，以4倍檢出限計算定量限為0.001 148 μg·g-1，結(jié)果見表2。本方法分析計算所得檢出限顯著低于目前已有的其他土壤中敵草隆檢測方法，能夠更為精確地檢測環(huán)境中的敵草隆殘留。

表2 敵草隆的檢出限和定量限(n=7)Table 2 Limit of detection and limit of quantification of diuron(n=7)

2.3.2 回收率和精密度

在20 g土壤空白樣品中添加敵草隆標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中敵草隆加標(biāo)量按照40、200和400 ng分別設(shè)置6個平行樣，進(jìn)行前處理與檢測。檢測結(jié)果如表3所示，3個濃度下分別進(jìn)行6次加標(biāo)，加標(biāo)回收率在71.2%～90.3%，3個濃度平均回收率分別為79.2%、84.5%和80.5%；3個濃度的加標(biāo)回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～9.4%，平均為6.06%。該方法的回收率、精密度和準(zhǔn)確度符合土壤有機(jī)物檢測對于回收率(70%～130%)、精密度(<10%)和準(zhǔn)確度的相關(guān)要求。

3 結(jié)論

建立加壓溶劑萃取-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測土壤中敵草隆殘留量的方法，敵草隆在20～500 μg·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且靈敏度、準(zhǔn)確度均符合要求，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，且目標(biāo)峰分離效果較好；敵草隆的加標(biāo)回收率為71.2%～90.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～9.4%，檢出限為0.000 287 μg·g-1。該方法有利于對土壤中敵草隆殘留量大批量檢測的操作，提高了目標(biāo)物的萃取效率和檢測效率，降低了檢測難度，提高樣品檢測準(zhǔn)確性。