陽和解凝膏聯(lián)合梅花針對局限性硬皮病小鼠TGF-β1/Smad3信號通路的影響

白雨 李丹 孔潔 韓慧 王紅

【摘 要】目的：觀察陽和解凝膏聯(lián)合梅花針對局限性硬皮病小鼠模型轉化生長因子-β1（TGF-β1）/Smad同源物3（Smad3）信號通路的影響。方法：將36只雌性BALB/c小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、肝素鈉組、陽和解凝膏組、梅花針組、陽和解凝膏聯(lián)合梅花針組（聯(lián)合治療組），每組6只。除空白對照組外，其余各組小鼠均皮下注射博萊霉素建立局限性硬皮病小鼠模型。治療4周后，處死小鼠取皮膚組織，采用Rodnan評分觀察皮膚受累程度，HE染色觀察皮膚組織病理學變化，偏振光皮膚鏡觀察皮膚組織表面血管和毛發(fā)的變化情況，免疫組織化學染色檢測皮膚組織中TGF-β1、白細胞介素-4（IL-4）、Smad3、Smad7的表達；Masson特殊染色檢測皮膚膠原纖維的面積。結果：陽和解凝膏組、梅花針組、聯(lián)合治療組小鼠治療后皮膚組織表面血管和毛發(fā)恢復生長；HE染色觀察真皮變??；Masson特殊染色膠原纖維面積減少；TGF-β1、IL-4、Smad3表達降低，Smad7表達升高，且以聯(lián)合治療組效果最佳，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。結論：陽和解凝膏、梅花針可以通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路的表達干預局限性硬皮病小鼠皮膚組織纖維化。陽和解凝膏聯(lián)合梅花針治療局限性硬皮病小鼠可以起到協(xié)同增效的作用。

【關鍵詞】 局限性硬皮病；陽和解凝膏；梅花針；TGF-β1/Smad3信號通路；小鼠

The Effect of Yanghe Jiening Gao（陽和解凝膏）Combined with Plum-blossom Needle on TGF-β1/Smad3 Signaling Pathway in Mice with Localized Scleroderma

BAI Yu，LI Dan，KONG Jie，HAN Hui，WANG Hong

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Yanghe Jiening Gao（陽和解凝膏）combined with

plum-blossom needle on TGF-β1/Smad3 signaling pathway in mice with localized scleroderma.Methods：

Thirty-six female BALB/c mice were randomly divided into a blank control group，a model control group，

a heparin sodium group，a Yanghe Jiening Gao group，a plum-blossom needle group，and a combination of Yanghe Jiening Gao and plum-blossom needle group（the combined treatment group），with 6 mice in each group.Except the blank control group，all other groups of mice were subcutaneously injected with Bleomycin to establish mouse models of localized scleroderma.After 4 weeks of treatment，the mice were euthanized and skin tissue was taken，and the degree of skin involvement was observed using the Rodnan skin thickness score;HE staining was used to observe pathological changes in skin tissue;changes in blood vessels and hair on the surface of skin tissue were observed using polarized light dermatoscopy;immunohistochemical staining was used for detecting the expression of

TGF-β1，IL-4，Smad3，and Smad7 in the skin tissue;Masson special staining was used to detect the area of collagen fibers in the skin.Results：After treatment，the blood vessels and hair on the surface of the skin tissue of mice in the Yanghe Jiening Gao group，the plum-blossom needle group，and the combined treatment group resumed growth;HE staining observed thinning of the dermis;Masson's special staining reduced the area of collagen fibers;the expression of TGF-β1，IL-4 and Smad3 decreased，while the expression of Smad7 increased，and the combined treatment group had the most significant therapeutic effect，with statistical significance（P < 0.05）.Conclusion：Yanghe Jiening Gao and plum-blossom needle can inhibit the expression of TGF-β1/Smad3 signaling pathway to intervene the skin tissue fibrosis in mice with localized scleroderma.The combination of them have a synergistic effect on the treatment of localized scleroderma in mice.

【Keywords】 localized scleroderma;Yanghe Jiening Gao（陽和解凝膏）;plum-blossom needle;TGF-β1/Smad3 signaling pathway;mice

硬皮病是一種以皮膚黏膜纖維化和硬化為特征的自身免疫性結締組織疾?。?］。西醫(yī)治療硬皮病多采用糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物，但效果欠佳。硬皮病屬中醫(yī)學“皮痹”范疇，病機多為風寒濕邪導致經絡氣血痹阻。陽和解凝膏有溫通經絡、化痰祛瘀等功效，與硬皮病病機相符。梅花針可以調節(jié)經絡氣血、增加外用藥的經皮滲透效率。陽和解凝膏及梅花針操作簡單、治療安全，經臨床驗證無不良反應。但中藥外用及梅花針治療硬皮病多局限于臨床病例報道［2］，缺乏實驗研究驗證。因此，本研究通過動物實驗，觀察陽和解凝膏及梅花針治療局限性硬皮病小鼠的療效，探討上述治療方法對轉化生長因子-β1（TGF-β1）/Smad同源物3（Smad3）信號通路的影響，為今后的臨床治療提供更可靠的依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雌性BALB/c小鼠36只，體質量18～22 g，購自斯貝福生物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2019-0010。

1.2 實驗藥物 陽和解凝膏藥物組成：牛蒡子1500 g，桂枝、大黃、當歸、肉桂、草烏、川烏、地龍、僵蠶、赤芍、白芷、白蘞、白及各60 g，川芎120 g，續(xù)斷、防風、荊芥、五靈脂、木香、香櫞、陳皮各30 g，乳香、沒藥各60 g，蘇合120 g，

麝香30 g。均由包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院中藥房提供。配制方法：除后4味外，其他中藥共入麻油中熬枯濾渣，后入黃丹（每500 g油中加黃丹210 g）熬煉成膏，使用前再加熱混合后4味中藥

細末。

1.3 實驗試劑 鹽酸博來霉素（日本化藥株式會社，批號600700）；梅花針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司，批號20192200580）；肝素鈉乳膏（博士倫福瑞達制藥有限公司，批號20042302）；Masson三色染色試劑盒（索萊寶科技有限公司，批號G1340）；TGF-β1、IL-4、Smad3、Smad7試劑盒（博奧森生物技術有限公司，批號bs0086R、bs2463R、bs3484R、bs0566R）。

1.4 實驗儀器 石蠟切片機（德國徠卡，型號rm2235）；光學顯微鏡（Olympus，型號CX31）；偏振光皮膚鏡（Dino-Lite，型號AM4113ZT4）。

2 方 法

2.1 分組、動物模型制備與樣本采集 將36只小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、肝素鈉組、陽和解凝膏組、梅花針組、陽和解凝膏聯(lián)合梅花針組（聯(lián)合治療組），每組6只。將所有小鼠背部剔去約1.5 cm×1.5 cm的毛發(fā)，除空白對照組外，其余小鼠均背部皮下注射博萊霉素磷酸鹽緩沖液

0.1 mL（濃度為200 μg·mL-1），每日1次；空白對照組小鼠背部皮下注射磷酸鹽緩沖液，注射方法和劑量同前。造模4周后，陽和解凝膏組小鼠給予陽和解凝膏外敷治療，藥膏在酒精燈上加溫軟化后貼于小鼠背部皮膚，每貼藥膏貼敷2 d；梅花針組小鼠給予梅花針扣刺治療，小鼠背部皮膚碘伏消毒后，拇指、食指捏住梅花針針柄末端，上下顫動針頭，利用腕部力量輕扣，扣刺速度快、幅度小，以局部皮膚有出血點為度，治療結束后再次消毒，每日1次；聯(lián)合治療組小鼠分別給予陽和解凝膏外敷及梅花針扣刺治療，藥膏貼敷2 d后予1次梅花針扣刺治療；肝素鈉組小鼠給予肝素鈉乳膏外用治療，每日1次。治療期間各組小鼠均自由飲水、飲食，治療4周后將各組小鼠通過脊椎脫臼法處死，取背部注射區(qū)皮膚組織，放入質量分數(shù)為4%的甲醛溶液固定。

2.2 整體狀態(tài)評估及Rodnan評分 治療期間觀察各組小鼠的身體狀態(tài)、活動量等情況；每周根據皮膚受累的嚴重程度進行改良Rodnan評分［3］（0分，正常皮膚；1分，輕度硬厚；2分，明顯硬厚，不能推動；3分，嚴重硬厚，不能捏起）。

2.3 HE染色 HE染色后，于光學顯微鏡下觀察皮膚組織病理變化并收集圖像。

2.4 Masson特殊染色 Masson特殊染色后，膠原纖維、細胞核呈藍色，細胞漿、紅細胞、肌肉纖維呈紅色，用ImageJ圖像分析軟件采集膠原容積分數(shù)（即藍色面積占總面積的百分比）。

2.5 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色后，于顯微鏡下觀察，棕黃色為陽性，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件采集光密度（IOD）及面積（Area），再計算出平均光密度（即光密度·面積-1）進行分析。

2.6 皮膚鏡 各組小鼠治療4周后應用偏振光皮膚鏡檢測小鼠背部皮膚組織表面血管和毛發(fā)的變化情況。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以表示，組間比較采用方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 各組小鼠一般狀態(tài)及Rodnan評分比較 空白對照組小鼠的身體狀態(tài)良好，皮膚彈性較好。模型對照組小鼠出現(xiàn)活動減少，攝食水分和食物減少，毛發(fā)明顯脫落，毛發(fā)脫落部位皮膚硬化明顯，不能捏起。陽和解凝膏組、梅花針組、聯(lián)合治療組小鼠狀態(tài)好，接近于空白對照組小鼠，皮膚彈性可，牽拉易提起。Rodnan評分結果見表1。

3.2 各組小鼠皮膚鏡下表現(xiàn) 空白對照組小鼠毛發(fā)均勻分布；模型對照組小鼠見白色無結構區(qū)，線狀血管，毛囊受損、萎縮；肝素鈉組小鼠見少量毛發(fā)及線狀、點狀出血；陽和解凝膏組、梅花針組、聯(lián)合治療組小鼠毛發(fā)恢復生長；梅花針組小鼠背部皮膚結痂愈合。見圖1。

3.3 各組小鼠皮膚組織病理學改變 空白對照組小鼠皮膚組織結構完整，表皮層及真皮層無明顯增厚，膠原纖維無明顯增生；模型對照組小鼠皮膚真皮層略增厚，膠原纖維增生，部分膠原均質化，毛囊、汗腺明顯減少；肝素鈉組小鼠皮膚組織病理變化情況與模型對照組無明顯差別；陽和解凝膏組、梅花針組、聯(lián)合治療組小鼠皮膚組織病理改變趨向于空白對照組。見圖2。

3.4 各組小鼠背部皮膚Masson特殊染色組織 模型對照組藍色（膠原纖維）面積最大，空白對照組藍色面積最小，陽和解凝膏組及梅花針組藍色面積明顯變小。與空白對照組比較，其余5組膠原纖維面積均明顯增加（P < 0.05）；與模型對照組比較，陽和解凝膏組、梅花針組、聯(lián)合治療組膠原纖維面積均明顯減少（P < 0.05）。見圖3、表2。

3.5 各組小鼠背部皮膚組織TGF-β1、IL-4、Smad3、Smad7表達比較 TGF-β1、IL-4、Smad3陽性表達主要在真皮層的炎癥細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞的細胞膜上，Smad7主要在成纖維細胞的細胞漿。與空白對照組比較，模型對照組及肝素鈉組TGF-β1、IL-4、Smad3的陽性表達顯著升高

（P < 0.05），Smad7陽性表達明顯減弱（P < 0.05）；與模型對照組比較，陽和解凝膏組、梅花針組、聯(lián)合治療組TGF-β1、IL-4、Smad3陽性表達明顯下降，Smad7陽性表達明顯升高（P < 0.05）。見表3。

4 討 論

硬皮病的發(fā)病機制尚不明確，與自身免疫異常、炎癥因子、致病通路等都有關系。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad信號通路是TGF-β發(fā)揮生物學效應的主要通路［4］。TGF-β1可以促進成纖維細胞自分泌TGF-β［5］，TGF-β與下游的Smad3結合后再與Smad4形成復合物并易位到細胞核，參與靶基因的轉錄激活［6］。Smad3為受體活化型，不僅可以增加膠原的合成，而且還可以減少金屬蛋白酶的降解和增加金屬蛋白酶的抑制劑促進纖維化的發(fā)

生［7］；Smad7為抑制型Smad，在該通路起負向調節(jié)作用［8］。IL-4不僅可以調節(jié)TGF-β細胞水平［9］，還可以刺激細胞內的膠原形成。研究發(fā)現(xiàn)，硬皮病患者的血漿、外周血單核細胞及肺臟標本均檢測到IL-4水平升高［10-11］。通過對本次實驗小鼠HE染色、Masson特殊染色及皮膚鏡觀察，除空白對照組外，各組小鼠背部皮膚均有真皮厚度增加、膠原纖維增粗、毛囊及脂肪組織萎縮，證明局限性硬皮病小鼠造模成功。

硬皮病屬中醫(yī)學“皮痹”范疇，其病因與風寒瘀三邪有密切關系［12］。氣血失和造成血液運行不暢使局部肌膚失養(yǎng)是硬皮病的主要病機。陽和解凝膏出自清代王維德的《外科全生集》，有溫經和陽、化痰通絡等功效［13］。陽和解凝膏其核心為“陽和”二字，陽為溫熱的、上升的陽氣；和為調和、協(xié)調之意。利用溫陽藥物使陽氣的溫煦作用中和陰寒之毒，對因治療；使用調理氣血、疏通經絡的藥物使人體陰陽諸氣調和理順，對癥治療。方劑中牛蒡子宣肺透疹，消腫止痛；桂枝溫經通脈；荊芥、防風解表散風；白芷散風除濕，通竅止痛；大黃逐瘀

通經；川芎活血行氣，祛風止痛；白蘞清熱解毒，消癰散癤；乳香、沒藥活血，散瘀止痛；白及入肺經，專攻收斂；草烏祛風除濕，溫經止痛；肉桂、麝香活血通經；續(xù)斷補肝腎，強筋骨，用于風濕痹痛；當歸補血活血，調經止痛，溫陽與辛散之品相配伍，使風寒瘀之毒隨津液排出體外，達到溫陽化濕、活血化瘀、消腫散結之功效［14-15］。梅花針以中醫(yī)經絡的“十二皮部”理論為依據。術者右手握住針柄，在皮膚（應刺部位）上運用一定的手法，只叩擊皮膚，不傷肌肉，以達到疏通經絡、活血祛瘀、防治疾病的功效［16］。此外，梅花針還有調節(jié)局部血液循環(huán)，改善微血管的功能［17］。梅花針對皮膚產生刺激，針感能夠伴隨刺激位置的不同驅動相應區(qū)域經脈之氣循行，促使針感傳至希望抵達的臟腑、筋肉以及關節(jié)等特定部位，進而起到定向性調節(jié)經絡氣血以及內臟功能等治療效果［18］。本次實驗運用陽和解凝膏和梅花針治療局限性硬皮病小鼠，陽和解凝膏組、梅花針組、聯(lián)合治療組小鼠的毛發(fā)恢復生長，活動量及食欲增加，皮膚彈性恢復；皮膚鏡下線狀血管及白色無結構區(qū)較模型對照組明顯減少；Masson特殊染色下膠原纖維面積減少趨向于空白對照組小鼠，皮膚硬化程度逐漸減輕，療效確切，說明陽和解凝膏及梅花針治療局限性硬皮病小鼠效果顯著。陽和解凝膏組、梅花針組、聯(lián)合治療組小鼠皮膚組織中的TGF-β1、Smad3、IL-4表達降低，Smad7表達升高，證實了陽和解凝膏及梅花針治療局限性硬皮病小鼠通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路的表達改善皮膚組織纖維化。經過治療后，陽和解凝膏組、梅花針組、聯(lián)合治療組小鼠皮膚組織的IL-4含量較模型對照組小鼠降明顯降低，說明陽和解凝膏及梅花針可以通過減輕炎癥因子的表達改善局限性硬皮病小鼠皮膚組織纖維化。本次實驗為局限性硬皮病的治療，局部外用陽和解凝膏及梅花針叩刺避免了口服中藥帶來的首過消除效應，局部應用使藥效發(fā)揮最大。梅花針扣刺還可以促進陽和解凝膏的透皮滲透吸收，使兩者聯(lián)合治療起到協(xié)同增效的作用。

綜上所述，陽和解凝膏和梅花針可以通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路的表達改善皮膚組織纖維化，且陽和解凝膏聯(lián)合梅花針的治療效果優(yōu)于單一治療方式。

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收稿日期：2023-07-15；修回日期：2023-08-22