彭 靜,向旭東,王忠慧,王瓊川,邵世豪,馬維浩,朱波波,趙 力△
[1昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(云南省腫瘤醫(yī)院)麻醉科,云南 昆明 650118;2昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(云南省腫瘤醫(yī)院)胸外科,云南 昆明 650118]
代償性肺生長(compensatory lung growth,CLG)是指在某種原因?qū)е路谓M織受損時,身體通過增加肺組織的數(shù)量或改變肺組織的結(jié)構(gòu)來適應(yīng)呼吸功能的需要[1]。CLG可以通過多種途徑實現(xiàn),包括細胞增殖、肺泡擴張和血管重塑等[2]。這些途徑可以增加肺組織的表面積,提高氣體交換效率,從而改善呼吸功能。研究顯示,成人在接受右肺切除術(shù)后發(fā)生了CLG 現(xiàn)象[3]。而且在大多數(shù)成年哺乳動物的肺切除術(shù)(pneumonectomy,PNX)模型中,手術(shù)切除肺組織也會導(dǎo)致剩下的肺快速生長[4]。在CLG 過程中,其余肺葉的肺泡上皮細胞增殖與肺重量增加和網(wǎng)絡(luò)重建有關(guān)[2]。雖然對于調(diào)節(jié)CLG 的分子機制依舊還沒有明確的解釋,但它可能為治療肺部疾病和肺組織工程提供重要線索。
微小RNA(microRNA,miRNA,miR)是真核生物中一個由19~24個核苷酸組成的小非編碼RNA 家族,可在轉(zhuǎn)錄后水平后調(diào)節(jié)基因[5]。有研究表明,miRNAs 可以調(diào)節(jié)肺細胞增殖、分化、凋亡、肺泡化、血管生成和血管化[6-7]。探索miRNAs 在肺發(fā)育/損傷中的作用漸漸成為研究熱點。研究顯示,miRNAs 家族中的miR-184 在非小細胞肺癌中低表達,可作為非小細胞肺癌的潛在治療靶點[8]。還有研究觀察到miR-184 在EGFR 突變的非小細胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者中高表達,可用于非小細胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的新生物標志物[9]。但目前尚不清楚miR-184 在肺發(fā)育中的生理和病理功能。基質(zhì)金屬蛋白酶14(matrix metalloproteinase-14,MMP-14)是一種金屬蛋白酶,主要參與細胞外基質(zhì)的代謝和重塑過程,在發(fā)育、組織修復(fù)和炎癥等生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。研究顯示,PNX 誘導(dǎo)的肺毛細血管內(nèi)皮細胞激活VEGFR2 和FGFR1,可觸發(fā)MMP-14 的產(chǎn)生,進而刺激上皮細胞的擴張[10]。此外,MMP-14的活性還受到金屬蛋白酶組織抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)的調(diào)控,TIMP-2 作為一種天然的抑制物,其主要作用是調(diào)節(jié)金屬蛋白酶的活性,以維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[11]。那么,miR-184在肺發(fā)育中的作用是否通過TIMP-2/MMP-14 通路來實現(xiàn),目前尚不清楚。本研究通過切除小鼠左肺構(gòu)建PNX動物模型,以及進行體外實驗,探討miR-184 的作用及其與TIMP-2/MMP-14通路的關(guān)系。
1.1 臨床樣本 從昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院收集了16 例多原發(fā)肺癌(multiple primary lung cancer,MPLC)患者和肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好患者(CLG)的肺組織樣本,在任何與研究有關(guān)的程序之前,已獲得所有個體參與者的知情同意并獲得了云南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(倫理號:KYCS2022141)。
1.2 動物 從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司獲得20 只8 周齡SPF 級的雄性C57BL/6J 小鼠(體重20~22 g),許可證號為SCXK(湘)2019-0004。所有動物實驗的操作獲得了昆明醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的批準(實驗動物倫理號:kmmu2020272)。
1.3 細胞 人肺泡上皮細胞從深圳豪地華拓生物科技有限公司獲得,并培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)液(HyClone)中,置于37 ℃、5% CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)。
2.1 動物分組(n=5) PNX 組:在麻醉誘導(dǎo)室中用4.0%異氟烷麻醉小鼠后,用乙醇和碘溶液處理好左胸,沿左側(cè)腋前線切開皮膚;在第5 肋間隙處開胸進入左肺,并用4-0 絲縫線(Ethicon)結(jié)扎肺門;用PDS縫線縫合胸廓切口和皮膚切口,然后皮下注射3 mL溫生理鹽水進行復(fù)蘇;術(shù)后皮下注射單劑量丁丙諾啡緩釋劑(3.25 mg/kg)鎮(zhèn)痛。PNX+miR-184 mimic組:術(shù)后將miR-184 mimic 慢病毒(1.5×108TU/mL,200 μL;上海吉瑪基因公司)通過尾靜脈注射入PNX小鼠體內(nèi)。在第4 天對小鼠進行肺功能測定后,將小鼠進行脫頸處死,取肺組織進行相關(guān)指標的測定。
2.2 細胞分組(n=3) 將人肺泡上皮細胞在24孔板中培養(yǎng)過夜,待細胞密度達到60%~70%左右時,根據(jù)Lipofectamine 3000(Invitrogen)說明書將NC-mimic、miR-184 mimic、OE-NC 和OE-TIMP-2(上海吉瑪基因公司)以終濃度100 nmol/L 按分組轉(zhuǎn)染至細胞中,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,并檢測轉(zhuǎn)染效率。
3.1 肺功能測定和肺組織病理學(xué)觀察 (1)在術(shù)后第4 天,參考前人的方法[12],用異氟烷麻醉小鼠,從頸部中線切口切開氣管;用20 號空心針插入氣管,隨后將其連接到flexiVent 系統(tǒng)(SCIREQ);總肺活量和肺順應(yīng)性由壓力-容積環(huán)路得出。(2)取出剩余的右肺,用10%福爾馬林在30 cmH2O 下充氣,通過水置換法測量肺容量來評估肺生長[13]。所有參數(shù)都根據(jù)體重進行歸一化處理。(3)取肺組織置于4%甲醛溶液中,固定48 h;常規(guī)脫水、石蠟包埋、制備組織切片,厚度約為5 μm;進行HE 染色;自然晾干后,于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化并拍照。
3.2 RT-qPCR 實驗 使用Trizol 試劑(Invitrogen)分別提取肺組織和人肺泡上皮細胞中的總RNA,采用First-Strand cDNA 合成試劑盒(武漢君諾德生物技術(shù)有限公司)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用SYBR Green實時熒光定量PCR 試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)進行實時熒光定量PCR,以GAPDH 和U6 為內(nèi)參照,結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算。引物序列見表1。
表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR
3.3 Western blot實驗 用含1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液(Sigma-Aldrich)提取人肺泡上皮細胞和肺組織中的蛋白;根據(jù)BCA 檢測試劑盒(Thermo Fisher)說明書測定蛋白濃度;總蛋白通過SDS-PAGE 分離,再轉(zhuǎn)移到PVDF 膜(Millipore)上,然后用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1.5 h;加入稀釋過的Ⅰ抗[MMP-14抗體(1∶2 000; ab51074)、TIMP-2抗體(1∶1 000; ab180630)和GAPDH 抗體(1∶1 000;ab9485)均購自Abcam],4 ℃下過夜;將膜與Ⅱ抗(1∶4 000; ab97051,Abcam)在室溫下孵育1 h;用增強化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore)顯色;最后用ImageJ軟件對條帶進行半定量分析。
3.4 細胞增殖檢測 (1)將人肺泡上皮細胞(每孔5×103個)接種在96 孔板中,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;按分組處理各組細胞;處理結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8 試劑;用酶標儀在450 nm 處測量每孔吸光度。(2)將細胞以每孔1×103個的密度接種在6 孔板中,連續(xù)培養(yǎng)2 周以形成集落;每孔加入5 mL 4%多聚甲醛并孵育15 min;隨后用甲醇固定菌落并用Giemsa 染色試劑盒染色15 min;用自來水洗滌后,觀察各組細胞集落形成情況。
3.5 雙螢光素酶基因報告實驗 通過TargetScan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-184 和TIMP-2 的結(jié)合位點。將含有miR-184 結(jié)合位點的TIMP-2 3'-UTR 克隆至pGL3 載體(Promega),構(gòu)建野生型(wild-type,WT)TIMP-2載體。采用定點誘變試劑盒產(chǎn)生突變型(mutant,MUT)TIMP-2 載體。采用Lipofectamine 3000 將WT 或MUT 與miR-184 mimic 或NC-mimic 共 轉(zhuǎn)染 至293T細胞。48 h后采用雙螢光素酶報告分析系統(tǒng)檢測螢光素酶活性。
使用GraphPad Prism 8 軟件分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。所有實驗至少重復(fù)3 次。采用單因素方差分析和t檢驗來進行統(tǒng)計學(xué)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
RT-qPCR 結(jié)果顯示,miR-184 在MPLC 患者癌組織中低表達,而在肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好的患者(CLG)肺組織中高表達(P<0.01),見圖1。
Figure 1. miR-184 was highly expressed in multiple primary lung cancer (MPLC) patients with good recovery (compensatory lung growth,CLG) after lobectomy. RT-qPCR was used to measure the expression of miR-184 in tissues. Mean±SD. n=16. **P<0.01 vs MPLC.圖1 miR-184在肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好的患者中高表達
miR-184 mimic 的轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果顯示,與NC-mimic 組相比,miR-184 mimic 組的miR-184 表達量顯著上調(diào)(P<0.01),見圖2A。接著檢測MMP-14的表達顯示,與NC-mimic 組相比,miR-184 mimc 組MMP-14的mRNA和蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.01),見圖2B、C。最后CCK-8 和集落形成實驗結(jié)果顯示,miR-184 mimic 的轉(zhuǎn)染顯著提高人肺泡上皮細胞活力并促進其增殖(P<0.01),見圖2D、E。
Figure 2. Overexpression of miR-184 promoted the proliferation of human alveolar epithelial cells. A: RT-qPCR was used to measure the transfection efficiency of miR-184 mimic in the cells; B: RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of MMP-14 in the cells; C: Western blot was used to determine the protein expression of MMP-14 in the cells; D: CCK-8 assay was used to measure the viability of human alveolar epithelial cells; E: the proliferation of human alveolar epithelial cells was determined by colony formation assay. NC: normal control. Mean±SD. n=3. *P<0.05,**P<0.01 vs negative control mimic(NC-mimic) group.圖2 過表達miR-184促進人肺泡上皮細胞增殖
通過TargetScan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-184的靶向結(jié)合關(guān)系,確定TIMP-2 是miR-184 的下游靶標,見圖3A。同時,雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C實,miR-184可靶向調(diào)控TIMP-2的表達,見圖3B。TIMP-2 表達的檢測結(jié)果顯示,與NC-mimic 組相比,miR-184 mimic 組人肺泡上皮細胞中TIMP-2 的表達顯著下調(diào)(P<0.01),見圖3C、D。
Figure 3. miR-184 achieved targeted inhibition of TIMP-2 expression. A: the target binding relationship of miR-184 and TIMP-2 predicted by TargetScan and miRDB; B: dual-luciferase reporter assay was used to verify whether miR-184 regulated the expression of TIMP-2; C: TIMP-2 mRNA expression was measured by RT-qPCR; D: TIMP-2 proptein expression was determined by Western blot. NC: negative control; WT: wild-type; MUT: mutant. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC-mimic group.圖3 miR-184靶向抑制TIMP-2的表達
OE-TIMP-2 轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果顯示,與OE-NC組相比,OE-TIMP-2 組人肺泡上皮細胞中TIMP-2 表達量顯著上調(diào)(P<0.01),見圖4A。TIMP-2表達的檢測結(jié)果顯示,與NC 組相比,miR-184 mimic 組TIMP-2的表達顯著下調(diào)(P<0.01),而OE-TIMP-2 組TIMP-2的表達顯著上調(diào)(P<0.01 或P<0.05);與miR-184 mimic 組相比,miR-184 mimic+OE-TIMP-2 組TIMP-2的表達顯著上調(diào)(P<0.05),見圖4B、C。MMP-14 表達的檢測結(jié)果顯示,與NC 組相比,過表達miR-184顯著促進MMP-14 的表達(P<0.01),過表達TIMP-2則是顯著抑制了MMP-14 的表達(P<0.05),且可顯著逆轉(zhuǎn)miR-184 mimic 對MMP-14 表達的促進作用(P<0.01 或P<0.05),見圖4D、E。CCK-8 和集落形成實驗結(jié)果顯示,與NC 組相比,miR-184 mimic 的轉(zhuǎn)染顯著提高人肺泡上皮細胞活力并促進其增殖(P<0.01),而OE-TIMP-2 的轉(zhuǎn)染則顯著抑制人肺泡上皮細胞活力和增殖(P<0.05),且可顯著逆轉(zhuǎn)miR-184 mimic對細胞活力和增殖的促進作用(P<0.01),見圖4F、G。
Figure 4. Overexpression of TIMP-2 attenuated the promotion of human alveolar epithelial cell proliferation by miR-184 overexpression. A: Western blot was used to determine the overexpression efficiency of TIMP-2 in the cells; B: RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of TIMP-2 in the cells; C: the protein expression of TIMP-2 in the cells was determine by Western blot. D: RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of MMP-14 in the cells; E: Western blot was used to determine the protein expression of MMP-14 in the cells; F: CCK-8 assay was used to determine the viability of the cells; G: the proliferation of the cells was determined by colony formation assay. NC: negative control; OE: overexpression. Mean±SD. n=3. *P<0.05,**P<0.01 vs OE-NC or NC group; #P<0.05,##P<0.01 vs miR-184 mimic group.圖4 過表達TIMP-2減弱過表達miR-184對人肺泡上皮細胞增殖的促進作用
小鼠肺功能檢測結(jié)果顯示,與PNX 小鼠相比,miR-184 mimic 的處理顯著提高小鼠的肺容量、肺活量和肺順應(yīng)性(P<0.01),見圖5A~C。HE 染色結(jié)果顯示,與PNX 組相比,PNX+miR-184 mimic 組小鼠肺部細胞顯著增多,見圖5D。RT-qPCR 結(jié)果顯示,與PNX 組相比,PNX+miR-184 mimic 組的miR-184 表達顯著上調(diào)(P<0.01),見圖5E。MMP-14 和TIMP-2 表達的檢測結(jié)果顯示,與PNX 組相比,PNX+miR-184 mimic 組小鼠肺組織中MMP-14 的表達量顯著上調(diào)(P<0.01),TIMP-2 的表達量顯著下調(diào)(P<0.01),見圖5F、G。
Figure 5. miR-184 promoted the recovery of lung function in mice after pneumonectomy (PNX). A: mouse lung volume measurement; B: mouse total vital capacity measurement; C: mouse lung compliance measurement; D: HE staining was used to observe the pathological changes of mouse lung tissues (scale bar=100 μm); E: RT-qPCR was used to measure the expression of miR-184 in mouse lung tissues; F: Western blot was used to determine the protein expression of TIMP-2 and MMP-14 in mouse lung tissues; G: RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of TIMP-2 and MMP-14 in mouse lung tissues. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs PNX group.圖5 miR-184促進PNX后小鼠的肺功能恢復(fù)
MPLC 通常是指在肺部同時或相繼出現(xiàn)兩個或更多的獨立原發(fā)癌癥[14]。對于MPLC 患者,肺葉切除術(shù)是一種常見治療方法。動物實驗結(jié)果表明,在PNX 后,剩余的肺組織還會發(fā)生CLG,以彌補切除部分的功能[15]。CLG 可以通過肺容積的增加、肺組織的重塑和肺功能的提高來實現(xiàn)[16]。目前關(guān)于CLG 機制的研究較少,本研究確認了一種與CLG 發(fā)生的新的分子機制,即miR-184可以通過調(diào)控TIMP-2/MMP-14改善PNX后小鼠肺功能。
miRNA 是基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,參與多種細胞的生物功能調(diào)節(jié)[17]。目前已有很多關(guān)于miR-184 研究的報導(dǎo)。如Rao 等[18]的研究顯示,miR-184在肺腺癌中低表達,過表達miR-184 能有效抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Wu 等[19]的研究顯示,促進miR-184 表達可以抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和順鉑耐藥性。此外,還有研究顯示miR-184作為小細胞肺癌的腫瘤抑制因子,能在體外抑制小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲[20]。但并未有miR-184對CLG 影響的相關(guān)報道。本研究觀察到miR-184 在肺葉切除術(shù)后CLG 的MPLC 患者中顯著高表達。miR-184 的差異表達讓我們猜想其可能在CLG 中發(fā)揮重要作用。通過在人肺泡上皮細胞中轉(zhuǎn)染miR-184 mimic 觀察miR-184 的作用,發(fā)現(xiàn)miR-184 mimic的轉(zhuǎn)染可以有效促進人肺泡上皮細胞增殖。本研究觀察到的miR-184 對細胞增殖的作用與前人研究不同,可能是前人的研究集中在癌細胞上,而本研究集中在正常細胞中,由此可見miR-184作用廣泛。
本研究進一步探究miR-184 調(diào)控人肺泡上皮細胞增殖的下游機制。通過生物信息網(wǎng)站預(yù)測到TIMP-2 是miR-184 的下游靶標。此外,研究顯示肺損傷后細胞外基質(zhì)的重塑依賴于降解膠原的MMP及其內(nèi)源性抑制劑TIMP[21]。因此我們推測TIMP-2可能也在CLG 進程中有重要作用。Yang 等[22]報道,miR-550a-3p 可以通過下調(diào)TIMP-2 促進非小細胞肺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究觀察到miR-184 靶向負調(diào)控TIMP-2,并且miR-184 mimic對人肺泡上皮細胞增殖的促進可以被過表達TIMP-2 所逆轉(zhuǎn)。這表明miR-184 通過靶向負調(diào)控TIMP-2 促進人肺泡上皮細胞增殖,與既往研究表現(xiàn)出一致的miRNA 調(diào)控TIMP-2進而影響疾病進程的調(diào)控機制。
此外,TIMP-2 作為MMP 的內(nèi)源性抑制劑之一[23],其抑制人肺泡上皮細胞增殖的作用可能是通過調(diào)控MMP 實現(xiàn)的。已有研究表明,下調(diào)MMP-14能抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[24]。在Ding等[25]的研究中,在PNX 之后,抑制MMP-14 的表達干擾了肺泡的再生。而且McLaughlin 等[26]的研究表明,TIMP-2 能通過抑制MMP-14 表達,抑制乳腺癌細胞的侵襲。因此,我們同樣檢測了MMP-14在本研究中的表達情況,觀察到過表達miR-184 顯著促進MMP-14 的表達,而過表達TIMP-2 則顯著抑制MMP-14 的表達。這表明TIMP-2 對人肺泡上皮細胞增殖的抑制作用是通過抑制MMP-14實現(xiàn)的。
總之,本研究揭示了miR-184 通過抑制TIMP-2促進MMP-14的表達,進而促進人肺泡上皮細胞增殖以及PNX后小鼠肺功能的恢復(fù)。然而本研究存在一定的局限性。首先,沒有做關(guān)于MMP-14調(diào)控人肺泡上皮細胞生長的實驗,未來需要進一步驗證。其次,只在體外驗證了miR-184/TIMP-2/MMP-14 信號通路對人肺泡上皮細胞的調(diào)控作用,并沒有在動物體內(nèi)完全驗證整條信號通路,需要更多的體內(nèi)實驗來證明這一結(jié)論。