miR-184通過TIMP-2/MMP-14促進PNX模型中代償性肺生長*

彭 靜，向旭東，王忠慧，王瓊川，邵世豪，馬維浩，朱波波，趙 力△

［1昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（云南省腫瘤醫(yī)院）麻醉科，云南 昆明 650118；2昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（云南省腫瘤醫(yī)院）胸外科，云南 昆明 650118］

代償性肺生長（compensatory lung growth，CLG）是指在某種原因?qū)е路谓M織受損時，身體通過增加肺組織的數(shù)量或改變肺組織的結(jié)構(gòu)來適應(yīng)呼吸功能的需要［1］。CLG可以通過多種途徑實現(xiàn)，包括細胞增殖、肺泡擴張和血管重塑等［2］。這些途徑可以增加肺組織的表面積，提高氣體交換效率，從而改善呼吸功能。研究顯示，成人在接受右肺切除術(shù)后發(fā)生了CLG 現(xiàn)象［3］。而且在大多數(shù)成年哺乳動物的肺切除術(shù)（pneumonectomy，PNX）模型中，手術(shù)切除肺組織也會導(dǎo)致剩下的肺快速生長［4］。在CLG 過程中，其余肺葉的肺泡上皮細胞增殖與肺重量增加和網(wǎng)絡(luò)重建有關(guān)［2］。雖然對于調(diào)節(jié)CLG 的分子機制依舊還沒有明確的解釋，但它可能為治療肺部疾病和肺組織工程提供重要線索。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是真核生物中一個由19～24個核苷酸組成的小非編碼RNA 家族，可在轉(zhuǎn)錄后水平后調(diào)節(jié)基因［5］。有研究表明，miRNAs 可以調(diào)節(jié)肺細胞增殖、分化、凋亡、肺泡化、血管生成和血管化［6-7］。探索miRNAs 在肺發(fā)育/損傷中的作用漸漸成為研究熱點。研究顯示，miRNAs 家族中的miR-184 在非小細胞肺癌中低表達，可作為非小細胞肺癌的潛在治療靶點［8］。還有研究觀察到miR-184 在EGFR 突變的非小細胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者中高表達，可用于非小細胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的新生物標志物［9］。但目前尚不清楚miR-184 在肺發(fā)育中的生理和病理功能。基質(zhì)金屬蛋白酶14（matrix metalloproteinase-14，MMP-14）是一種金屬蛋白酶，主要參與細胞外基質(zhì)的代謝和重塑過程，在發(fā)育、組織修復(fù)和炎癥等生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。研究顯示，PNX 誘導(dǎo)的肺毛細血管內(nèi)皮細胞激活VEGFR2 和FGFR1，可觸發(fā)MMP-14 的產(chǎn)生，進而刺激上皮細胞的擴張［10］。此外，MMP-14的活性還受到金屬蛋白酶組織抑制物2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）的調(diào)控，TIMP-2 作為一種天然的抑制物，其主要作用是調(diào)節(jié)金屬蛋白酶的活性，以維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)［11］。那么，miR-184在肺發(fā)育中的作用是否通過TIMP-2/MMP-14 通路來實現(xiàn)，目前尚不清楚。本研究通過切除小鼠左肺構(gòu)建PNX動物模型，以及進行體外實驗，探討miR-184 的作用及其與TIMP-2/MMP-14通路的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 實驗對象

1.1 臨床樣本 從昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院收集了16 例多原發(fā)肺癌（multiple primary lung cancer，MPLC）患者和肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好患者（CLG）的肺組織樣本，在任何與研究有關(guān)的程序之前，已獲得所有個體參與者的知情同意并獲得了云南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準（倫理號：KYCS2022141）。

1.2 動物 從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司獲得20 只8 周齡SPF 級的雄性C57BL/6J 小鼠（體重20～22 g），許可證號為SCXK（湘）2019-0004。所有動物實驗的操作獲得了昆明醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的批準（實驗動物倫理號：kmmu2020272）。

1.3 細胞 人肺泡上皮細胞從深圳豪地華拓生物科技有限公司獲得，并培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)液（HyClone）中，置于37 ℃、5% CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)。

2 實驗分組與處理

2.1 動物分組（n=5） PNX 組：在麻醉誘導(dǎo)室中用4.0%異氟烷麻醉小鼠后，用乙醇和碘溶液處理好左胸，沿左側(cè)腋前線切開皮膚；在第5 肋間隙處開胸進入左肺，并用4-0 絲縫線（Ethicon）結(jié)扎肺門；用PDS縫線縫合胸廓切口和皮膚切口，然后皮下注射3 mL溫生理鹽水進行復(fù)蘇；術(shù)后皮下注射單劑量丁丙諾啡緩釋劑（3.25 mg/kg）鎮(zhèn)痛。PNX+miR-184 mimic組：術(shù)后將miR-184 mimic 慢病毒（1.5×108TU/mL，200 μL；上海吉瑪基因公司）通過尾靜脈注射入PNX小鼠體內(nèi)。在第4 天對小鼠進行肺功能測定后，將小鼠進行脫頸處死，取肺組織進行相關(guān)指標的測定。

2.2 細胞分組（n=3） 將人肺泡上皮細胞在24孔板中培養(yǎng)過夜，待細胞密度達到60%～70%左右時，根據(jù)Lipofectamine 3000（Invitrogen）說明書將NC-mimic、miR-184 mimic、OE-NC 和OE-TIMP-2（上海吉瑪基因公司）以終濃度100 nmol/L 按分組轉(zhuǎn)染至細胞中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，并檢測轉(zhuǎn)染效率。

3 主要實驗方法

3.1 肺功能測定和肺組織病理學(xué)觀察 （1）在術(shù)后第4 天，參考前人的方法［12］，用異氟烷麻醉小鼠，從頸部中線切口切開氣管；用20 號空心針插入氣管，隨后將其連接到flexiVent 系統(tǒng)（SCIREQ）；總肺活量和肺順應(yīng)性由壓力-容積環(huán)路得出。（2）取出剩余的右肺，用10%福爾馬林在30 cmH2O 下充氣，通過水置換法測量肺容量來評估肺生長［13］。所有參數(shù)都根據(jù)體重進行歸一化處理。（3）取肺組織置于4%甲醛溶液中，固定48 h；常規(guī)脫水、石蠟包埋、制備組織切片，厚度約為5 μm；進行HE 染色；自然晾干后，于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化并拍照。

3.2 RT-qPCR 實驗 使用Trizol 試劑（Invitrogen）分別提取肺組織和人肺泡上皮細胞中的總RNA，采用First-Strand cDNA 合成試劑盒（武漢君諾德生物技術(shù)有限公司）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR Green實時熒光定量PCR 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進行實時熒光定量PCR，以GAPDH 和U6 為內(nèi)參照，結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

3.3 Western blot實驗 用含1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液（Sigma-Aldrich）提取人肺泡上皮細胞和肺組織中的蛋白；根據(jù)BCA 檢測試劑盒（Thermo Fisher）說明書測定蛋白濃度；總蛋白通過SDS-PAGE 分離，再轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Millipore）上，然后用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1.5 h；加入稀釋過的Ⅰ抗［MMP-14抗體（1∶2 000； ab51074）、TIMP-2抗體（1∶1 000； ab180630）和GAPDH 抗體（1∶1 000；ab9485）均購自Abcam］，4 ℃下過夜；將膜與Ⅱ抗（1∶4 000； ab97051，Abcam）在室溫下孵育1 h；用增強化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore）顯色；最后用ImageJ軟件對條帶進行半定量分析。

3.4 細胞增殖檢測 （1）將人肺泡上皮細胞（每孔5×103個）接種在96 孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；按分組處理各組細胞；處理結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8 試劑；用酶標儀在450 nm 處測量每孔吸光度。（2）將細胞以每孔1×103個的密度接種在6 孔板中，連續(xù)培養(yǎng)2 周以形成集落；每孔加入5 mL 4%多聚甲醛并孵育15 min；隨后用甲醇固定菌落并用Giemsa 染色試劑盒染色15 min；用自來水洗滌后，觀察各組細胞集落形成情況。

3.5 雙螢光素酶基因報告實驗 通過TargetScan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-184 和TIMP-2 的結(jié)合位點。將含有miR-184 結(jié)合位點的TIMP-2 3'-UTR 克隆至pGL3 載體（Promega），構(gòu)建野生型（wild-type，WT）TIMP-2載體。采用定點誘變試劑盒產(chǎn)生突變型（mutant，MUT）TIMP-2 載體。采用Lipofectamine 3000 將WT 或MUT 與miR-184 mimic 或NC-mimic 共 轉(zhuǎn)染 至293T細胞。48 h后采用雙螢光素酶報告分析系統(tǒng)檢測螢光素酶活性。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8 軟件分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。所有實驗至少重復(fù)3 次。采用單因素方差分析和t檢驗來進行統(tǒng)計學(xué)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-184 在肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好的患者中高表達

RT-qPCR 結(jié)果顯示，miR-184 在MPLC 患者癌組織中低表達，而在肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好的患者（CLG）肺組織中高表達（P＜0.01），見圖1。

Figure 1. miR-184 was highly expressed in multiple primary lung cancer （MPLC） patients with good recovery （compensatory lung growth，CLG） after lobectomy. RT-qPCR was used to measure the expression of miR-184 in tissues. Mean±SD. n=16. **P＜0.01 vs MPLC.圖1 miR-184在肺葉切除術(shù)后恢復(fù)較好的患者中高表達

2 過表達miR-184促進人肺泡上皮細胞增殖

miR-184 mimic 的轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果顯示，與NC-mimic 組相比，miR-184 mimic 組的miR-184 表達量顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖2A。接著檢測MMP-14的表達顯示，與NC-mimic 組相比，miR-184 mimc 組MMP-14的mRNA和蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖2B、C。最后CCK-8 和集落形成實驗結(jié)果顯示，miR-184 mimic 的轉(zhuǎn)染顯著提高人肺泡上皮細胞活力并促進其增殖（P＜0.01），見圖2D、E。

Figure 2. Overexpression of miR-184 promoted the proliferation of human alveolar epithelial cells. A： RT-qPCR was used to measure the transfection efficiency of miR-184 mimic in the cells； B： RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of MMP-14 in the cells； C： Western blot was used to determine the protein expression of MMP-14 in the cells； D： CCK-8 assay was used to measure the viability of human alveolar epithelial cells； E： the proliferation of human alveolar epithelial cells was determined by colony formation assay. NC： normal control. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs negative control mimic（NC-mimic） group.圖2 過表達miR-184促進人肺泡上皮細胞增殖

3 miR-184靶向抑制TIMP-2的表達

通過TargetScan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-184的靶向結(jié)合關(guān)系，確定TIMP-2 是miR-184 的下游靶標，見圖3A。同時，雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-184可靶向調(diào)控TIMP-2的表達，見圖3B。TIMP-2 表達的檢測結(jié)果顯示，與NC-mimic 組相比，miR-184 mimic 組人肺泡上皮細胞中TIMP-2 的表達顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖3C、D。

Figure 3. miR-184 achieved targeted inhibition of TIMP-2 expression. A： the target binding relationship of miR-184 and TIMP-2 predicted by TargetScan and miRDB； B： dual-luciferase reporter assay was used to verify whether miR-184 regulated the expression of TIMP-2； C： TIMP-2 mRNA expression was measured by RT-qPCR； D： TIMP-2 proptein expression was determined by Western blot. NC： negative control； WT： wild-type； MUT： mutant. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs NC-mimic group.圖3 miR-184靶向抑制TIMP-2的表達

4 過表達TIMP-2 減弱miR-184 mimic 對人肺泡上皮細胞增殖的促進作用

OE-TIMP-2 轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果顯示，與OE-NC組相比，OE-TIMP-2 組人肺泡上皮細胞中TIMP-2 表達量顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖4A。TIMP-2表達的檢測結(jié)果顯示，與NC 組相比，miR-184 mimic 組TIMP-2的表達顯著下調(diào)（P＜0.01），而OE-TIMP-2 組TIMP-2的表達顯著上調(diào)（P＜0.01 或P＜0.05）；與miR-184 mimic 組相比，miR-184 mimic+OE-TIMP-2 組TIMP-2的表達顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖4B、C。MMP-14 表達的檢測結(jié)果顯示，與NC 組相比，過表達miR-184顯著促進MMP-14 的表達（P＜0.01），過表達TIMP-2則是顯著抑制了MMP-14 的表達（P＜0.05），且可顯著逆轉(zhuǎn)miR-184 mimic 對MMP-14 表達的促進作用（P＜0.01 或P＜0.05），見圖4D、E。CCK-8 和集落形成實驗結(jié)果顯示，與NC 組相比，miR-184 mimic 的轉(zhuǎn)染顯著提高人肺泡上皮細胞活力并促進其增殖（P＜0.01），而OE-TIMP-2 的轉(zhuǎn)染則顯著抑制人肺泡上皮細胞活力和增殖（P＜0.05），且可顯著逆轉(zhuǎn)miR-184 mimic對細胞活力和增殖的促進作用（P＜0.01），見圖4F、G。

Figure 4. Overexpression of TIMP-2 attenuated the promotion of human alveolar epithelial cell proliferation by miR-184 overexpression. A： Western blot was used to determine the overexpression efficiency of TIMP-2 in the cells； B： RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of TIMP-2 in the cells； C： the protein expression of TIMP-2 in the cells was determine by Western blot. D： RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of MMP-14 in the cells； E： Western blot was used to determine the protein expression of MMP-14 in the cells； F： CCK-8 assay was used to determine the viability of the cells； G： the proliferation of the cells was determined by colony formation assay. NC： negative control； OE： overexpression. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs OE-NC or NC group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs miR-184 mimic group.圖4 過表達TIMP-2減弱過表達miR-184對人肺泡上皮細胞增殖的促進作用

5 miR-184促進PNX后小鼠的肺功能恢復(fù)

小鼠肺功能檢測結(jié)果顯示，與PNX 小鼠相比，miR-184 mimic 的處理顯著提高小鼠的肺容量、肺活量和肺順應(yīng)性（P＜0.01），見圖5A～C。HE 染色結(jié)果顯示，與PNX 組相比，PNX+miR-184 mimic 組小鼠肺部細胞顯著增多，見圖5D。RT-qPCR 結(jié)果顯示，與PNX 組相比，PNX+miR-184 mimic 組的miR-184 表達顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖5E。MMP-14 和TIMP-2 表達的檢測結(jié)果顯示，與PNX 組相比，PNX+miR-184 mimic 組小鼠肺組織中MMP-14 的表達量顯著上調(diào)（P＜0.01），TIMP-2 的表達量顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖5F、G。

Figure 5. miR-184 promoted the recovery of lung function in mice after pneumonectomy （PNX）. A： mouse lung volume measurement； B： mouse total vital capacity measurement； C： mouse lung compliance measurement； D： HE staining was used to observe the pathological changes of mouse lung tissues （scale bar=100 μm）； E： RT-qPCR was used to measure the expression of miR-184 in mouse lung tissues； F： Western blot was used to determine the protein expression of TIMP-2 and MMP-14 in mouse lung tissues； G： RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of TIMP-2 and MMP-14 in mouse lung tissues. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs PNX group.圖5 miR-184促進PNX后小鼠的肺功能恢復(fù)

討 論

MPLC 通常是指在肺部同時或相繼出現(xiàn)兩個或更多的獨立原發(fā)癌癥［14］。對于MPLC 患者，肺葉切除術(shù)是一種常見治療方法。動物實驗結(jié)果表明，在PNX 后，剩余的肺組織還會發(fā)生CLG，以彌補切除部分的功能［15］。CLG 可以通過肺容積的增加、肺組織的重塑和肺功能的提高來實現(xiàn)［16］。目前關(guān)于CLG 機制的研究較少，本研究確認了一種與CLG 發(fā)生的新的分子機制，即miR-184可以通過調(diào)控TIMP-2/MMP-14改善PNX后小鼠肺功能。

miRNA 是基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與多種細胞的生物功能調(diào)節(jié)［17］。目前已有很多關(guān)于miR-184 研究的報導(dǎo)。如Rao 等［18］的研究顯示，miR-184在肺腺癌中低表達，過表達miR-184 能有效抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Wu 等［19］的研究顯示，促進miR-184 表達可以抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和順鉑耐藥性。此外，還有研究顯示miR-184作為小細胞肺癌的腫瘤抑制因子，能在體外抑制小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲［20］。但并未有miR-184對CLG 影響的相關(guān)報道。本研究觀察到miR-184 在肺葉切除術(shù)后CLG 的MPLC 患者中顯著高表達。miR-184 的差異表達讓我們猜想其可能在CLG 中發(fā)揮重要作用。通過在人肺泡上皮細胞中轉(zhuǎn)染miR-184 mimic 觀察miR-184 的作用，發(fā)現(xiàn)miR-184 mimic的轉(zhuǎn)染可以有效促進人肺泡上皮細胞增殖。本研究觀察到的miR-184 對細胞增殖的作用與前人研究不同，可能是前人的研究集中在癌細胞上，而本研究集中在正常細胞中，由此可見miR-184作用廣泛。

本研究進一步探究miR-184 調(diào)控人肺泡上皮細胞增殖的下游機制。通過生物信息網(wǎng)站預(yù)測到TIMP-2 是miR-184 的下游靶標。此外，研究顯示肺損傷后細胞外基質(zhì)的重塑依賴于降解膠原的MMP及其內(nèi)源性抑制劑TIMP［21］。因此我們推測TIMP-2可能也在CLG 進程中有重要作用。Yang 等［22］報道，miR-550a-3p 可以通過下調(diào)TIMP-2 促進非小細胞肺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究觀察到miR-184 靶向負調(diào)控TIMP-2，并且miR-184 mimic對人肺泡上皮細胞增殖的促進可以被過表達TIMP-2 所逆轉(zhuǎn)。這表明miR-184 通過靶向負調(diào)控TIMP-2 促進人肺泡上皮細胞增殖，與既往研究表現(xiàn)出一致的miRNA 調(diào)控TIMP-2進而影響疾病進程的調(diào)控機制。

此外，TIMP-2 作為MMP 的內(nèi)源性抑制劑之一［23］，其抑制人肺泡上皮細胞增殖的作用可能是通過調(diào)控MMP 實現(xiàn)的。已有研究表明，下調(diào)MMP-14能抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲［24］。在Ding等［25］的研究中，在PNX 之后，抑制MMP-14 的表達干擾了肺泡的再生。而且McLaughlin 等［26］的研究表明，TIMP-2 能通過抑制MMP-14 表達，抑制乳腺癌細胞的侵襲。因此，我們同樣檢測了MMP-14在本研究中的表達情況，觀察到過表達miR-184 顯著促進MMP-14 的表達，而過表達TIMP-2 則顯著抑制MMP-14 的表達。這表明TIMP-2 對人肺泡上皮細胞增殖的抑制作用是通過抑制MMP-14實現(xiàn)的。

總之，本研究揭示了miR-184 通過抑制TIMP-2促進MMP-14的表達，進而促進人肺泡上皮細胞增殖以及PNX后小鼠肺功能的恢復(fù)。然而本研究存在一定的局限性。首先，沒有做關(guān)于MMP-14調(diào)控人肺泡上皮細胞生長的實驗，未來需要進一步驗證。其次，只在體外驗證了miR-184/TIMP-2/MMP-14 信號通路對人肺泡上皮細胞的調(diào)控作用，并沒有在動物體內(nèi)完全驗證整條信號通路，需要更多的體內(nèi)實驗來證明這一結(jié)論。