褪黑素對小鼠抑郁樣行為和BDNF-ERK-CREB信號通路的作用*

嚴(yán) 赫，李 雄，丁佳萌，張冬先△

（1昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2國家衛(wèi)健委毒品依賴和戒治重點實驗室，云南 昆明 650500）

抑郁癥是以持續(xù)心境低落為特征的精神障礙性疾病，患者常伴認(rèn)知功能下降和生理功能紊亂，嚴(yán)重者會出現(xiàn)自殺傾向［1］。據(jù)2018 年世界衛(wèi)生組織報道，抑郁癥是最常見的致殘原因之一，全球有超過3億的患者［2］。在我國，抑郁癥患者達(dá)到9 500 萬人以上，且終生患病率為6.8%［3］。由于COVID-19的大流行，也導(dǎo)致世界范圍內(nèi)的抑郁癥病例增加了25%以上［4］。因此迫切需要有效的臨床治療干預(yù)靶點，但抑郁癥的發(fā)病機(jī)理尚不明確。

近年來研究認(rèn)為，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用［5］。BDNF 通過與其特異性受體——原肌球蛋白相關(guān)激酶B（tropomyosin-related kinase B，TrkB）結(jié)合，可啟動下游的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路，包括ERK1 和ERK2 兩個部分［6］。磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）參與信號傳導(dǎo)并激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長發(fā)育、突觸可塑性和神經(jīng)再生，并參與學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知行為［7］。研究報道，抑郁患者前額葉皮層及海馬中ERK 表達(dá)水平較低［8］。在小鼠抑郁癥模型中，氟西汀（fluoxetine，F(xiàn)LX）和帕羅西汀等抗抑郁藥可提高大腦p-ERK水平，并激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）來緩解小鼠抑郁樣行為［9］。在慢性應(yīng)激中，大鼠海馬和額葉組織中亦觀察到CREB 表達(dá)降低［10］，而腦區(qū)內(nèi)降低p-CREB 水平可導(dǎo)致動物出現(xiàn)抑郁樣行為［11］。因此，BDNF-ERK-CREB信號通路極有可能參與抑郁癥的形成，但目前其作用尚未明確。

褪黑素（melatonin，MEL）是一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，因其具有強(qiáng)烈的抗炎、抗氧化作用而受到了諸多研究的關(guān)注［12］。據(jù)報道，MEL可以促進(jìn)BDNF 表達(dá)［13］，可能具有緩解抑郁的功效［14］。然而，目前尚無MEL 是否通過作用于BDNF-ERK-CREB 信號通路來緩解抑郁樣行為的研究。

本研究擬采用慢性束縛應(yīng)激（chronic restraint stress，CRS）來構(gòu)建小鼠抑郁癥模型，以FLX 作為陽性對照，MEL 作為干預(yù)藥物，探討MEL 對小鼠抑郁樣行為的影響以及BDNF-ERK-CREB 信號通路在此過程中發(fā)揮的作用。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和試劑

本實驗采用10～12 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠（22～25 g）共48 只，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司［許可證號：SCXK（湘）2019-0004］，飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部。飼養(yǎng)條件為晝夜12 h節(jié)律，室溫（22±2） ℃，濕度（50±5）%，自由攝水?dāng)z食。實驗經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理審查委員會審查批準(zhǔn)（No. kmmu20221288）。

MEL（HY-B0075）和FLX（HY-B0102）均購自MedChemExpress；分析純蔗糖（10021418）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（AG11705）和SYBR Green kit（AG11701）購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；目的引物購自湖南擎科生物技術(shù)有限公司；尼氏染色試劑（G1430）購自北京索萊寶生物科技有限公司；c-Fos 抗體（ab222699）購自Abcam；BDNF 抗體（28205-1-AP）、p-ERK1/2 抗體（28733-1-AP）、CREB 抗體（12208-1-AP）和β-tubulin抗體（10068-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

2 主要方法

2.1 動物模型建立 根據(jù)以往研究報道［15］，采用經(jīng)典的CRS 法建立小鼠抑郁癥模型。將48 只小鼠隨機(jī)分為對照組（n=12）和CRS 組（n=36），再將CRS 組小鼠分為CRS+vehicle、CRS+FLX 和CRS+MEL 三個亞組（n=12）。CRS 組小鼠給予每天5 h、連續(xù)14 d 的CRS，即將小鼠置于圓形桶狀透明聚乙烯器內(nèi)限制自由活動，不影響正常呼吸。于第15 天進(jìn)行行為學(xué)實驗來確定模型構(gòu)建是否成功。CRS組小鼠第16天至第29天繼續(xù)進(jìn)行CRS，參照預(yù)實驗及文獻(xiàn)結(jié)果［16］，在每次刺激前30 min進(jìn)行一次腹腔注射FLX（10 mg/kg）或MEL（10 mg/kg），CRS+vehicle 組小鼠則給予等體積的溶劑。14 d后再次進(jìn)行行為學(xué)檢測。隨后24 h內(nèi)處死小鼠，各組半數(shù)腦組織進(jìn)行多聚甲醛固定用于尼氏染色和免疫熒光觀察，其余半數(shù)腦組織用于RT-qPCR 和Western blot 等檢測。行為學(xué)及藥物干預(yù)流程見圖1。

Figure 1. Chronic restraint stress （CRS） model construction and drug intervention process.圖1 建立CRS抑郁癥模型及藥物干預(yù)時間軸

2.2 強(qiáng)迫游泳實驗（forced swimming test，F(xiàn)ST） 在長寬高各為40 cm的塑料容器內(nèi)加入適量水，將小鼠放入水中，軟件記錄5 min內(nèi)每只小鼠不動時間［1，5］。

2.3 懸尾實驗（tail suspension test，TST） 將小鼠固定在懸尾箱內(nèi)，頭部正對攝像頭，軟件分析5 min中內(nèi)小鼠不動時間［1，5，9］。

2.4 糖水偏好實驗（sucrose preference test，SPT）實驗第1 天給予每只小鼠1%蔗糖溶液，第2 天換為自來水，后禁水1 d，在第4天同時放置蔗糖溶液和自來水，第2 天后計算蔗糖溶液和自來水的消耗體積。糖水消耗率=蔗糖溶液消耗體積（mL）/蔗糖溶液消耗體積（mL）+自來水消耗體積（mL）［10］。

2.5 曠場實驗（open-field test，OFT） 在第22 天和第37 天進(jìn)行OFT。反應(yīng)箱大小為40 cm×40 cm×35 cm，將小鼠置入曠場后，通過軟件計算中央運動時間和距離［5，10-11］。

2.6 體重測量 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后記錄小鼠初次體重（g）；經(jīng)14 d 的CRS 后再次測量體重（g），計算體重增幅；在藥物干預(yù)14 d后第3次測量小鼠體重（g），再次計算體重增幅。

2.7 RT-qPCR 根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄及qPCR 實驗。內(nèi)參照為GAPDH，mRNA 相對表達(dá)水平用2-ΔΔCt法計算。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1. Primer sequence

2.8 Western blot 取小鼠額葉皮層和海馬組織。提取定量蛋白后，4%～20% MOPS 凝膠電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜。5%牛血清白蛋白于37 ℃封閉1 h。TBST 洗膜。加入BDNF 抗體（1∶1 000）、p-ERK 抗體（1∶1 000）、CREB 抗體（1∶1 000）和β-tubulin抗體（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜。加入相應(yīng)的Ⅱ抗（1∶5 000）37 ℃孵育1 h 后顯影。使用ImageJ 軟件計算灰度值。

2.9 尼氏染色 根據(jù)試劑盒說明，將腦組織樣本用4%多聚甲醛固定后脫水、石蠟包埋并切片，脫蠟、水化后使用尼氏染料染色；洗色、分化；中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.10 免疫熒光染色 制備腦組織冰凍切片，穿孔液穿孔30 分鐘，PBS 漂洗。封閉液室溫封閉2 h。c-Fos 抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜。PBS 漂洗，加入相應(yīng)的Ⅱ抗（1∶200）室溫避光孵育1 h，PBS漂洗?？篃晒馑p封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組樣本組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或兩因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CRS對小鼠體重增長和行為學(xué)的影響

經(jīng)過14 d 的CRS 刺激，與對照組相比，CRS 組小鼠的體重增長顯著降低（P＜0.01），F(xiàn)ST 和TST 的不動時間均顯著延長（P＜0.01），糖水消耗率顯著降低（P＜0.01），OFT 的中央停留時間和運動距離均顯著縮短（P＜0.01），見圖2。

Figure 2. Effects of chronic restraint stress （CRS） on body weight and depression-like behaviors of the mice. A： the weight change；B： the immobility time in forced swimming test（FST）； C： the immobility time in tail suspension test（TST）； D： the sucrose consumption rate in sucrose preference test； E： the central time in open-field test （OFT）； F： the central distance in OFT. Mean±SD. n=12. **P＜0.01 vs control group.圖2 CRS對小鼠體重及抑郁樣行為的影響

2 MEL 和FLX 治療對CRS 誘導(dǎo)的抑郁癥小鼠體重和行為學(xué)的影響

CRS+vehicle 組小鼠的體重變化與對照組比較無顯著差異；與CRS+vehicle 組比較，CRS+FLX 組和CRS+MEL 組小鼠的體重增長速率均顯著增加（P＜0.01）；CRS+FLX 組 與CRS+MEL 組之間 無顯著差異，見圖3A。在FST 和TST 中，與對照組相比，CRS+vehicle組小鼠的不動時間均顯著延長（P＜0.01）；經(jīng)2周藥物治療后，與CRS+vehicle 組比較，CRS+FLX 組和CRS+MEL 組小鼠的不動時間均顯著縮短（P＜0.01）；CRS+FLX 組 與CRS+MEL 組之間 無顯著差異，見圖3B、C。在SPT 中，與對照組相比，CRS+vehicle 組小鼠的糖水消耗率顯著降低（P＜0.01）；經(jīng)2周藥物治療后，與CRS+vehicle 組比較，CRS+FLX 組和CRS+MEL 組小鼠的糖水消耗率均顯著增加（P＜0.01）；CRS+FLX 組 與CRS+MEL 組之間 無顯著差異，見圖3D。在OFT 中，與對照組相比，CRS+vehicle組小鼠的中央運動時間和距離均顯著縮短（P＜0.01）；經(jīng)2 周藥物治療后，與CRS+vehicle 組比較，CRS+FLX 組和CRS+MEL 組小鼠的中央運動時間和距離均顯著增加（P＜0.01）；CRS+FLX 組與CRS+MEL組小鼠無顯著差異，見圖3E、F。

Figure 3. Effects of melatonin （MEL） and fluoxetine （FLX） on body weight and depression-like behaviors in chronic restraint stress（CRS） mice. A： the weight change； B： the immobility time in forced swimming test （FST）； C： the immobility time in tail suspension test （TST）； D： the sucrose consumption rate in sucrose preference test； E： the central time in open-field test（OFT）； F： the central distance in OFT. Mean±SD. n=12. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs CRS+vehicle group.圖3 褪黑素與氟西汀治療對CRS小鼠體重及抑郁樣行為的作用

3 MEL 和FLX 對CRS 小鼠額葉皮層和海馬中BDNF-ERK-CREB信號通路的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，CRS+vehicle 組小鼠額葉皮層和海馬中BDNF、ERK 和CREB 的mRNA 水平均顯著下降（P＜0.01）；與CRS+vehicle 組比較，經(jīng)2 周的藥物治療后，CRS+FLX 組和CRS+MEL 組小鼠額葉皮層和海馬中BDNF、ERK 和CREB 的mRNA 水平均顯著上升（P＜0.01）；CRS+FLX 組與CRS+MEL 組之間無顯著差異，見圖4。

Figure 4. Effects of melatonin （MEL） and fluoxetine （FLX） on the mRNA levels of brain-derived neurotrophic factor （BDNF），extracellular signal-regulated kinase （ERK） and cAMP response element-binding protein （CREB） in the frontal cortex （A） and hippocampus （B） of chronic restraint stress （CRS） mice. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs CRS+vehicle group.圖4 褪黑素和氟西汀對CRS小鼠額葉皮層和海馬BDNF、ERK和CREB mRNA水平的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，CRS+vehicle 組小鼠額葉皮層和海馬中BDNF、p-ERK1/2 和CREB 蛋白水平均顯著下降（P＜0.01）；經(jīng)2 周的藥物治療后，與CRS+vehicle 組對比，CRS+FLX 組和CRS+MEL 組小鼠額葉皮層和海馬中BDNF、p-ERK1/2 和CREB 蛋白水平均顯著上升（P＜0.01）；CRS+FLX 組與CRS+MEL組之間無顯著差異，見圖5。

Figure 5. Effects of melatonin （MEL） and fluoxetine （FLX） on the protein levels of brain-derived neurotrophic factor （BDNF），phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2 （p-ERK1/2） and cAMP response element-binding protein（CREB） in the frontal cortex （A） and hippocampus （B） of chronic restraint stress （CRS） mice. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs CRS+vehicle group.圖5 褪黑素與氟西汀對CRS小鼠額葉皮層和海馬BDNF、p-ERK1/2和CREB蛋白水平的影響

4 MEL 和FLX 對CRS 小鼠額葉皮層和海馬中神經(jīng)元的影響

尼氏染色結(jié)果顯示，對照組小鼠額葉皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列規(guī)則，尼氏小體數(shù)量豐富；與對照組相比，CRS+vehicle 組小鼠額葉皮層和海馬CA1區(qū)部分神經(jīng)元排列不規(guī)則，尼氏小體數(shù)量減少（P＜0.01）；與CRS+vehicle 組相比，CRS+FLX 組和CRS+MEL組小鼠額葉皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)顯著改善，接近對照組正常神經(jīng)元的形態(tài)（P＜0.01）；小鼠神經(jīng)元形態(tài)在CRS+FLX 組與CRS+MEL 組之間無顯著差異，見圖6。

Figure 6. Effects of melatonin（MEL） and fluoxetine（FLX） on the morphological changes of neurons in the frontal cortex （A） and hippocampal CA1 region （B） of chronic restraint stress （CRS） mice （Nissl staining，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs CRS+vehicle group.圖6 褪黑素與氟西汀對CRS小鼠額葉皮層和海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響

5 MEL 和FLX 對CRS 小鼠額葉皮層和海馬中c-Fos表達(dá)的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，CRS+vehicle 組小鼠額葉皮層和海馬CA1 區(qū)中的c-Fos 陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著增加（P＜0.01）；經(jīng)2 周的藥物治療后，與CRS+vehicle 組對比，CRS+FLX 組和CRS+MEL 組小鼠額葉皮層和海馬CA1 區(qū)中的c-Fos 陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著下降（P＜0.01）；CRS+FLX 組與CRS+MEL組小鼠之間無顯著差異，見圖7。

Figure 7. Effects of melatonin （MEL） and fluoxetine （FLX） on c-Fos expression in the frontal cortex （A） and hippocampal CA1 region （B） of chronic restraint stress （CRS） mice were detected by immunofluorescence staining （scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs CRS+vehicle group.圖7 褪黑素與氟西汀對CRS小鼠額葉皮層和海馬c-Fos表達(dá)的影響

討 論

抑郁癥目前缺乏有效的治療手段，探究其發(fā)病機(jī)理并尋找特異性的藥物干預(yù)靶點是亟待解決的重要公共衛(wèi)生問題［17］。動物模型是進(jìn)行發(fā)病機(jī)制探索和藥物開發(fā)的重要輔助工具，而穩(wěn)定的抑郁癥模型構(gòu)建是本研究的基礎(chǔ)。在本實驗中，采用對機(jī)體無損傷性刺激，且與人類身心性疾病的致病過程有形似性的CRS模型［18］。通過FST、TST、OFT和SPT等行為學(xué)檢測證實成功誘導(dǎo)小鼠抑郁癥模型。有研究表明，MEL 能夠緩解藥物脂多糖誘導(dǎo)的大鼠抑郁樣行為［19］。而本研究證實，MEL 治療增加了CRS 小鼠在FST和TST中的不動時間、在OFT中的中央運動時間和距離，以及糖水消耗率，表明MEL顯著緩解了CRS小鼠的抑郁樣行為。

BDNF 缺乏是抑郁發(fā)病的重要機(jī)制［16］。研究顯示，BDNF 具有維持神經(jīng)突觸生長、分化和存活的神經(jīng)生物功能［20］。在胞內(nèi)BDNF 可與TrkB 結(jié)合并激活下游ERK 分子，從而促進(jìn)CREB 磷酸化，CREB 作為細(xì)胞內(nèi)與抑郁癥相關(guān)信號通路中的一個交匯點，可進(jìn)一步調(diào)節(jié)BDNF 的活性，并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［21］。在嚙齒動物抑郁模型中，大腦海馬和前額葉皮層中BDNF 水平顯著降低［22］。有研究顯示，長期外周BDNF給藥可以促進(jìn)小鼠海馬中p-ERK和p-CREB的表達(dá)，并緩解小鼠的焦慮及抑郁癥狀［23］。在本研究中，CRS 小鼠的大腦海馬和前額葉皮層中BDNF、ERK 和CREB 表達(dá)也均受到抑制，與已報道的慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠模型具有一致的表現(xiàn)［22］，而這種抑制同樣可被MEL 治療所逆轉(zhuǎn)。因此，我們認(rèn)為MEL 顯著緩解抑郁樣行為的機(jī)制可能涉及BDNF-ERK-CREB信號通路。

FLX 作為經(jīng)典的抗抑郁藥，可通過抑制5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再攝取，增加大腦5-HT 的供給來緩解抑郁癥狀。研究認(rèn)為，BDNF 是FLX發(fā)揮抗抑郁作用的重要靶點，通過增強(qiáng)BDNF的表達(dá)，其與TrkB 結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)下游信號通路關(guān)鍵因子，如ERK、CREB等，可修復(fù)神經(jīng)元損傷從而發(fā)揮抗抑郁作用［24］。而敲減小鼠海馬BDNF表達(dá)可抑制FLX、阿戈美拉汀等抗抑郁藥的藥理作用［25］；有報道稱齊墩果酸也可依賴BDNF-ERK-CREB 信號通路來發(fā)揮抗抑郁作用［26］。本實驗中使用FLX 作為陽性對照，結(jié)果顯示FLX 治療顯著緩解了小鼠抑郁樣行為，且BDNF-ERK-CREB 的分子表達(dá)也出現(xiàn)同MEL 一致的改變。該結(jié)果提示此信號通路可能是抑郁癥發(fā)病以及抗抑郁藥作用的共同分子機(jī)制，可為未來開發(fā)藥物提供重要干預(yù)靶點。

海馬和前額葉皮層具有調(diào)節(jié)情緒認(rèn)知和工作記憶的功能，是抑郁癥發(fā)病相關(guān)的重要腦區(qū)。影像學(xué)證據(jù)表明，抑郁癥患者額葉皮層、海馬等腦區(qū)萎縮顯著，且伴有神經(jīng)元變性［27］。此外，抑郁小鼠的額葉及海馬腦區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，數(shù)量減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞［28］。我們的結(jié)果顯示，CRS 小鼠額葉皮層和海馬CA1 區(qū)的神經(jīng)元排列欠規(guī)則，尼氏小體數(shù)量減少，而FLX 和MEL干預(yù)均減輕了CRS小鼠上述腦區(qū)的神經(jīng)元損傷。c-Fos 是胞內(nèi)信號通路傳導(dǎo)的第三信使，生理性c-Fos 的表達(dá)可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的再生與修復(fù)，而過度表達(dá)則會加重神經(jīng)元的損傷，繼而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡或凋亡發(fā)生［29］。研究顯示，抑郁癥動物模型中c-Fos 過度表達(dá)在與情感活動關(guān)系密切的額葉皮層及海馬區(qū)［30］。已證實，F(xiàn)LX 可以通過激活單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放來下調(diào)c-Fos 蛋白的表達(dá)，從而減輕抑郁樣行為［31］。本實驗觀察到，CRS 小鼠的c-Fos 陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增多，經(jīng)MEL 治療后，降低了c-Fos陽性細(xì)胞表達(dá)，提示MEL 的抗抑郁機(jī)制可能與降低額葉皮層及海馬中神經(jīng)元c-Fos 的表達(dá)有關(guān)，但具體的分子機(jī)制以及與BDNF-ERK-CREB 信號通路的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MEL 通過激活額葉皮層和海馬中的BDNF-ERK-CREB 信號通路，減輕神經(jīng)元損傷，減少神經(jīng)元內(nèi)c-Fos 蛋白表達(dá)，從而緩解小鼠抑郁樣行為（圖8）。

本研究觀察到MEL 抗抑郁樣行為的作用，并提出了可能與BDNF-ERK-CREB 信號通路相關(guān)的機(jī)制，這一基礎(chǔ)研究可能對揭示抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和促進(jìn)有效臨床藥物靶點的開發(fā)具有重要意義。