番茄素通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子EB減輕脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷*

張衛(wèi)鋼，汪 磊，毛嘉玥，張 杰，陳雨晴，董明慧，李 曙，王 林

（皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是常見的癡呆類型，其主要臨床表現(xiàn)是學(xué)習(xí)和記憶等能力進(jìn)行性喪失。AD 的典型病理性特征是老年斑（由淀粉樣蛋白Aβ 沉積形成）和神經(jīng)原纖維纏結(jié)（由過(guò)度磷酸化的τ 蛋白聚集形成）［1］。除此之外，神經(jīng)炎癥在AD 的發(fā)展進(jìn)程中有著重要的作用［2］。在AD 患者腦組織中可觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活、老年斑周圍聚集大量促炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等；同時(shí)AD患者的血漿中促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平也升高［3］。AD病程的進(jìn)展會(huì)隨著炎癥反應(yīng)而加快，及時(shí)防治炎癥可作為AD 的一種前瞻性治療方法［4］。

異常聚集的Aβ和τ蛋白可促進(jìn)神經(jīng)炎癥。自噬的主要功能是清除異常聚集的蛋白質(zhì)［5］；在AD 患者、AD 轉(zhuǎn)基因鼠和細(xì)胞模型中均觀察到自噬水平的降低可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、Aβ和τ蛋白異常聚集；自噬途徑和自噬相關(guān)蛋白在炎癥的調(diào)節(jié)中起著核心作用［6］。轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）在自噬進(jìn)程中有著重要的作用，它可調(diào)節(jié)自噬體的形成、自噬體和溶酶體的融合以及溶酶體的生成和功能的正常發(fā)揮［7］。TFEB 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中普遍表達(dá)，在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中都有活性。在AD 患者的腦部中檢測(cè)到細(xì)胞核中的TFEB 蛋白水平表達(dá)下降；在AD 模型鼠中，TFEB 激活后通過(guò)自噬溶酶體系統(tǒng)加速淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的降解和減少Aβ 的產(chǎn)生［8］。TFEB 還可通過(guò)自噬溶酶體途徑降解腦組織中的炎癥小體和促炎細(xì)胞因子從而改善神經(jīng)炎癥。因此，TFEB 有望成為調(diào)控自噬和神經(jīng)炎癥的治療靶標(biāo)。

在不同AD 轉(zhuǎn)基因鼠中，TFEB 的基因修飾已顯示出神經(jīng)保護(hù)作用，研究TFEB 激動(dòng)劑在AD 中的作用將為新藥開發(fā)提供依據(jù)［9］。番茄素（tomatidine，TA）是一種來(lái)源于茄科的甾體生物堿。番茄素通過(guò)增加抗氧化酶活性和減少細(xì)胞凋亡來(lái)消除氧化應(yīng)激［10］。有研究報(bào)道番茄素可促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或線蟲中的自噬體的降解［11］；N2a 細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后，給予番茄素處理后TFEB 的活性增加，可促進(jìn)溶酶體降解并減輕細(xì)胞損傷［12］。但是番茄素在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，本研究采用LPS 處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y 細(xì)胞），模擬細(xì)胞水平的神經(jīng)炎癥模型，探究番茄素神經(jīng)保護(hù)的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

SH-SY5Y 細(xì)胞購(gòu)買于武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)為CL-0208。

2 主要試劑和儀器

LPS 和番茄素購(gòu)自MedChemExpress；兔抗TFEB多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗Ser142 位點(diǎn)磷酸化TFEB（p-TFEB）多克隆抗體購(gòu)自Affinity；兔抗P62、LC3 和cleaved caspase-3 多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔抗β-actin 單克隆抗體、CCK-8 試劑盒等試劑均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購(gòu)自Vazyme；TNF-α 和IL-1β 引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。SDS-PAGE 電泳儀及成像分析儀購(gòu)自Bio-Rad （型號(hào)：ChemiDoc）；流式分析儀購(gòu)自BD（型號(hào)：Accuri）；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自Leica（型號(hào)為SP8）。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y 細(xì)胞復(fù)蘇后用含有100 U/mL 青霉素、10 μg/mL 鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO?培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖至融合度約80%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代至另一培養(yǎng)瓶中，通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，待細(xì)胞狀況穩(wěn)定后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 細(xì)胞分組及給藥 先觀察不同濃度（1.25、2.5、5 和10 μg/mL）的LPS 對(duì)細(xì)胞活力和TFEB 活性的影響，并確定本研究的LPS 濃度為5 μg/mL。再觀察不同濃度（1、5 和10 μmol/L）的番茄素對(duì)細(xì)胞活力和TFEB 活性的影響，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確定用于本研究的番茄素濃度為5 μmol/L［13］。將SH-SY5Y 細(xì)胞分為對(duì)照（control，CON）組、LPS 組和LPS+TA 組。參考相關(guān)文獻(xiàn)在LPS 組中加入5 μg/mL LPS 處理24 h，建立炎癥模型［14］，LPS+TA 組先加入5 μmol/L 番茄素處理24 h后再加入5 μg/mL LPS共培養(yǎng)24 h。

3.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將SH-SY5Y 細(xì)胞懸浮液以適當(dāng)密度種入96 孔板，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和正常對(duì)照組，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相應(yīng)處理，LPS 處理24 h，番茄素處理48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 波長(zhǎng)下不同組別的吸光度（A）并算出細(xì)胞活力。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按凋亡試劑盒說(shuō)明書，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，將SH-SY5Y細(xì)胞處理完成后用不含EDTA的胰酶消化，停止消化后用PBS溫和清洗細(xì)胞2 次，離心5 min，收集1×105～5×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μL 試劑盒內(nèi)緩沖液輕輕吹打混勻成單細(xì)胞懸液，再依序加入annexin V-FITC 試劑和PI 試劑各5 μL，吹打混勻，室溫、避光反應(yīng)5～10 min，隨后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，時(shí)間控制在1 h內(nèi)。

3.5 Western blot 檢測(cè)蛋白水平 根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求，細(xì)胞處理完成后，去掉培養(yǎng)上清液，PBS 溫和清洗細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，靜置20 min，使細(xì)胞充分裂解，收集細(xì)胞至EP 管，4 ℃、10 000×g離心20 min，棄沉淀留上清液，用BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)不同目的蛋白分子量配制10%或12%聚丙烯酰胺凝膠，上樣蛋白量為30 μg，電泳分離蛋白質(zhì)后，采用濕式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到NC 膜。5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別加入1∶1 000 稀釋的兔抗TFEB、p-TFEB、P62、LC3 和β-actin 單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，次日TBST清洗3次，每次10 min，清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 或羊抗鼠IgG（1∶1 000），室溫?fù)u床孵育1 h，再用TBST 清洗3次，每次10 min。洗膜后用ECL 化學(xué)發(fā)光液和凝膠成像分析儀曝光條帶，ImageJ 軟件定量分析蛋白灰度值，目的蛋白與內(nèi)參照β-actin 之比代表蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3.6 RT-qPCR 法檢測(cè)mRNA 表達(dá)水平 使用Trizol試劑提取預(yù)處理后的細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為轉(zhuǎn)錄模板，每孔取2 μL 加入八聯(lián)管中，再加上、下游引物（序列見表1）各0.4 μL，SYBR qPCR Master Mix 10 μL，DEPC 水7.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)產(chǎn)物的熔解曲線得到Ct 值，計(jì)算炎癥因子mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.7 免疫熒光檢測(cè) 各組細(xì)胞干預(yù)完成后，吸出培養(yǎng)基，沿著孔壁緩慢注入PBS 清洗，加入4%多聚甲醛，室溫固定30 min，1% Triton-PBS清洗3次；免疫染色通透液破膜30 min，1% Triton-PBS清洗3次；5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入免疫染色稀釋液配制的Ⅰ抗（TFEB抗體，1∶200；cleaved caspase-3抗體，1∶250），4 ℃孵育過(guò)夜；1% Triton-PBS 清洗3 次，清洗后用3%牛血清白蛋白配制的Ⅱ抗（1∶500）室溫避光孵育1 h，1% Triton-PBS 清洗后加入DAPI 染色液37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗后滴加適量抗熒光淬滅封片液于載玻片，采用激光共聚焦顯微鏡拍照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯性差異法（LSD 法）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的影響

不同濃度的LPS（1.25、2.5、5 和10 μg/mL）處理細(xì)胞24 h。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與CON 組相比，5 μg/mL 和10 μg/mL 的LPS 使細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05），見圖1A。分別采用2.5 和5 μg/mL 的LPS 孵育細(xì)胞24 h，RT-qPCR 結(jié)果顯示，與CON 組相比，IL-1β mRNA 水平在LPS 濃度為2.5 和5 μg/mL 組中均顯著上升（P＜0.05），TNF-α mRNA 水平只在LPS 濃度為5 μg/mL 組中表達(dá)顯著上升（P＜0.05），見圖1B。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，2.5 和5 μg/mL 的LPS 引起細(xì)胞凋亡的數(shù)量顯著增加（P＜0.01），見圖1C。免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果表明，與CON 組相比較，cleaved caspase-3 表達(dá)水平在2.5 和5 μg/mL LPS 組中顯著上升（P＜0.05），見圖1D。

Figure 1. Effects of LPS on the inflammatory response and apoptosis of cells. A： the CCK-8 assay was used to measure the viability of SH-SY5Y cells after LPS treatment； B： RT-qPCR was conducted to detect TNF-α and IL-1β mRNA levels in SH-SY5Y cells after LPS treatment； C： flow cytometry was performed to measure the apoptosis of SH-SY5Y cells after LPS treatment；D： representative cleaved caspase-3 fluorescence staining images of SH-SY5Y cells in each group （green represents cleaved caspase-3，and blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖1 LPS對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的影響

2 LPS對(duì)細(xì)胞自噬和TFEB活性的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON 組相比，5 μg/mL LPS 處理組P62、LC3-II/LC3-I 和TFEB 表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05），但是p-TFEB 表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）；2.5 μg/mL LPS 雖引起P62、LC3-II/I和TFEB 表達(dá)水平下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2A。免疫熒光染色結(jié)果顯示，TFEB 在5 μg/mL LPS 處理組只定位在胞質(zhì)中（圖2B）。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇5 μg/mL的LPS濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

Figure 2. Effects of LPS on the autophagy and TFEB activity of SH-SY5Y cells. A： Western blot was performed to detect P62，LC3，TFEB and p-TFEB protein levels； B： representative TFEB fluorescence staining images of SH-SY5Y cells in each group（green represents TFEB，and blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=25 μm）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖2 LPS對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬和TFEB活性的影響

3 番茄素對(duì)TFEB的表達(dá)和定位的影響

分別用1、5 和10 μmol/L 的番茄素處理細(xì)胞48 h。CCK-8 結(jié)果表明，1、5 和10 μmol/L 的番茄素對(duì)細(xì)胞的活力無(wú)顯著影響（圖3A）。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON 組相比，5 μmol/L 番茄素處理組，TFEB 表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01），但p-TFEB 的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），見圖3B。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與CON 組相比，5 μmol/L 番茄素處理后TFEB主要定位于細(xì)胞核中（圖3C）。

Figure 3. Effect of tomatidine （TA） on the expression and localization of TFEB. A： the CCK-8 assay was used to measure the viability of SH-SY5Y cells after tomatidine treatment； B： Western blot was used to detect TFEB and p-TFEB protein levels； C：representative TFEB fluorescence staining images of SH-SY5Y cells in each group （green represents TFEB，and blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=25 μm）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖3 番茄素對(duì)TFEB的表達(dá)和定位的影響

4 番茄素對(duì)LPS 處理的細(xì)胞TFEB 和自噬功能的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與CON 組比，LPS 組中P62 表達(dá)水平下降但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.19），LC3-II/LC3-I 和TFEB 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），而p-TFEB 表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）；與LPS 組相比，LPS+TA 組中P62 有下降趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.08），p-TFEB 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），而LC3-II/LC3-I 和TFEB 表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），見圖4A。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與CON 組相比，TFEB 在LPS 組中主要定位于胞質(zhì)，而在LPS+TA組中則易位到細(xì)胞核中，見圖4B。

Figure 4. Effects of tomatidine（TA） on TFEB and autophagy in LPS-treated SH-SY5Y cells. A： Western blot was used to detect P62，LC3，TFEB and p-TFEB protein levels； B： representative TFEB fluorescence staining images of SH-SY5Y cells in each group （green represents TFEB，and blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs CON group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.圖4 番茄素對(duì)LPS處理的SH-SY5Y細(xì)胞TFEB表達(dá)和自噬功能的影響

5 番茄素對(duì)LPS 處理的細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響

RT-qPCR 結(jié)果表明，與CON 組相比，IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平在LPS 組中顯著上升（P＜0.01）；與LPS 組相比，LPS+TA 組中IL-1β mRNA 表達(dá)有下降趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.16），TNFα mRNA 表達(dá)顯著下降（P＜0.01），見圖5A。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與CON 組相比，LPS 組細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.01）；與LPS 組相比，LPS+TA 組細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜0.01），見圖5B。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與CON組相比，LPS組cleaved caspase-3表達(dá)顯著上升（P＜0.01）；與LPS 組相比，LPS+TA 組cleaved caspase-3表達(dá)顯著下降（P＜0.01），見圖5C。

Figure 5. Effects of tomatidine （TA） on inflammatory response and apoptosis in LPS-treated SH-SY5Y cells. A： RT-qPCR was used to detect TNF-α and IL-1β mRNA levels in SH-SY5Y cells； B： flow cytometry was used to measure the apoptosis of SHSY5Y cells； C： representative cleaved caspase-3 fluorescence staining images of SH-SY5Y cells in each group （green represents cleaved caspase-3，and blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs CON group； ##P＜0.01 vs LPS group.圖5 番茄素對(duì)LPS處理的SH-SY5Y細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響

討 論

神經(jīng)炎癥可通過(guò)不同的方式誘導(dǎo)，其中LPS 誘導(dǎo)是常見的。LPS存在于革蘭氏陰性菌外膜中，其主要受體是Toll 樣受體，從而促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展。本研究同樣利用LPS處理SH-SY5Y 細(xì)胞模擬細(xì)胞神經(jīng)炎癥的微環(huán)境，探討在細(xì)胞水平上番茄素能否發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，本研究結(jié)果也顯示LPS 可引起炎癥因子IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)水平和促凋亡蛋白cleaved caspase-3 的表達(dá)水平顯著上升，凋亡細(xì)胞的數(shù)量也顯著增多。番茄素主要存在于未成熟的綠色番茄的皮中，已被證明是耐藥腫瘤細(xì)胞的化學(xué)增敏劑，可抑制肺癌、肝癌、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲；番茄素還有抗炎、抗氧化、抑制病毒傳播和保護(hù)心臟等功能［15］。有研究報(bào)道，在谷氨酸、雙氧水處理的SH-SY5Y 細(xì)胞中，番茄素具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用［16］，但番茄素能否在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示給予番茄素處理后，SHSY5Y 細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)水平顯著降低，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少；該結(jié)果初步證明在LPS 處理的SHSY5Y 細(xì)胞中，番茄素具有一定神經(jīng)保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚不明確。

TFEB 包含基本的螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（bHLHZip），通過(guò)與靶基因E-box （CANNTG）啟動(dòng)子元件緊密結(jié)合來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而參與溶酶體生物發(fā)生、自噬調(diào)節(jié)和應(yīng)激適應(yīng)等細(xì)胞過(guò)程［17］。在TFEB敲除小鼠腦組織中觀察到Aβ沉積和磷酸化τ 蛋白的積累；在AD 小鼠模型中，TFEB 的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞脂滴和受損線粒體的降解［18］。但目前關(guān)于TFEB 在神經(jīng)炎癥中的作用尚無(wú)報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，在SH-SY5Y 細(xì)胞中，LPS 誘導(dǎo)TFEB 的表達(dá)水平顯著降低，該結(jié)果表明細(xì)胞的神經(jīng)炎癥可降低TFEB 的表達(dá)。在缺血缺氧損傷的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2A 細(xì)胞中，番茄素促進(jìn)TFEB 入核和TFEB表達(dá)水平增加。與其結(jié)果一致，本研究中給予番茄素處理后，TFEB 的表達(dá)水平顯著增加。生理情況下TFEB 主要位于胞質(zhì)中，當(dāng)饑餓或受刺激時(shí)TFEB 快速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并增強(qiáng)其有關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和靶蛋白的表達(dá)水平［19］。翻譯后修飾調(diào)控TFEB 的亞細(xì)胞定位，磷酸化是調(diào)控TFEB 活性的中心驅(qū)動(dòng)因素，去磷酸化后TFEB 從胞質(zhì)易位至胞核［20］。本研究中，SH-SY5Y 細(xì)胞給予LPS 處理后p-TFEB 表達(dá)水平顯著上升，TFEB 主要定位于胞質(zhì)中；而番茄素處理后，p-TFEB 表達(dá)水平顯著降低，TFEB 從胞質(zhì)易位至胞核增強(qiáng)自噬功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在LPS 處理的SH-SY5Y 細(xì)胞中，番茄素可促進(jìn)TFEB 的表達(dá)和核移位。

TFEB 可參與自噬體形成和自噬溶酶體降解，TFEB 表達(dá)水平降低雖引起自噬功能障礙［21］，但是要明確具體哪一過(guò)程異常須結(jié)合自噬其他指標(biāo)的變化來(lái)判定。LC3 是目前認(rèn)可度最高的自噬標(biāo)志物，貫穿于自噬體從形成到成熟的各個(gè)階段；自噬初始階段受到抑制，可降低自噬體的形成和LC3-II 分子的表達(dá)水平［22］。本研究的結(jié)果顯示，給予LPS 處理后，LC3-II/LC3-I 表達(dá)水平顯著下降，初步證實(shí)LPS 抑制自噬體的形成。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，單檢測(cè)LC3-II/LC3-I 的表達(dá)水平無(wú)法完全充分反映細(xì)胞內(nèi)的自噬狀態(tài)。P62 是另一個(gè)常用的自噬標(biāo)志物，P62和LC3-II/LC3-I 表達(dá)水平的變化可反映自噬通量的改變。在自噬過(guò)程中，P62與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合后與LC3-Ⅱ相互作用，靶向自噬體最終在自噬溶酶體內(nèi)降解；當(dāng)自噬體形成受抑制或溶酶體功能受損時(shí)，P62 會(huì)在胞質(zhì)中逐漸累積［23］。P62 的活性受到磷酸化、乙?；刃揎椀恼{(diào)節(jié)［24］。在AD 患者腦中檢測(cè)出P62蛋白水平的低表達(dá)，敲除P62抑制自噬功能會(huì)導(dǎo)致Aβ 積累、τ 蛋白過(guò)度磷酸化和神經(jīng)退行性變［25］。本研究中初步證實(shí)LPS 抑制自噬體的形成，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示LPS處理后的P62的表達(dá)水平顯著下降。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道LPS 會(huì)導(dǎo)致腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的活性下降，而AMPK 可通過(guò)磷酸化水平調(diào)控P62 的表達(dá)［26］。本課題組其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，在細(xì)胞水平上LPS 降低AMPK 的活性；因此，我們猜測(cè)在LPS 處理SHSY5Y 細(xì)胞中，P62 的表達(dá)水平顯著下降是可能由于AMPK 活性降低引起，具體機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。在LPS 處理的SH-SY5Y 細(xì)胞中，給予番茄素處理后LC3-II/LC3-I 表達(dá)水平顯著上升，而P62 表達(dá)水平雖降低但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明在SH-SY5Y細(xì)胞中番茄素可促進(jìn)自噬體的形成。

在AD 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，自噬、神經(jīng)炎癥和蛋白質(zhì)異常聚集相互影響［27］。有研究報(bào)道AD 患者顳葉皮質(zhì)中自噬蛋白P62和LC3陽(yáng)性囊泡增加，與炎癥小體、Aβ和過(guò)度磷酸化τ蛋白共定位，這可能是因?yàn)檠装Y小體的產(chǎn)生促進(jìn)神經(jīng)炎癥，從而降低自噬功能，導(dǎo)致AD 患者顳葉處蛋白異常聚集［28］。自噬功能的增強(qiáng)可促進(jìn)炎癥因子的降解，抑制神經(jīng)炎癥和發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。在本研究中，LPS引起炎癥因子表達(dá)水平增加，自噬體形成受到抑制；給予番茄素處理后增強(qiáng)自噬體的形成，促進(jìn)炎癥因子的降解。番茄素促進(jìn)炎癥因子的降解能否改善神經(jīng)炎癥引起細(xì)胞凋亡，本研究中檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白cleaved caspase-3 的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡數(shù)量的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示番茄素處理后cleaved caspase-3 表達(dá)水平和凋亡細(xì)胞數(shù)量均減少。以上結(jié)果可表明番茄素可增強(qiáng)自噬功能，促進(jìn)炎癥因子的降解，從而減少SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示，在細(xì)胞水平上，番茄素增強(qiáng)TFEB 表達(dá)并促進(jìn)其入核，改善LPS引起的細(xì)胞自噬功能障礙和凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但是本研究結(jié)果僅在細(xì)胞水平上有驗(yàn)證，該機(jī)制是否在動(dòng)物水平有效仍需進(jìn)一步研究。