有機室溫磷光納米材料制備及其生物成像應(yīng)用

孫徵譽，俞佳鴻，趙偉軍，朱為宏

華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237

有機磷光材料源于長發(fā)光壽命激發(fā)三重態(tài)的輻射弛豫發(fā)光，在光電和生物科學(xué)技術(shù)中具有巨大的應(yīng)用潛力[1]，包括光動力療法[2]、生物成像[3]、染料敏化太陽能電池[4]和有機發(fā)光二極管[5]等。在生物應(yīng)用中，與傳統(tǒng)熒光材料相比，具有長壽命的室溫磷光材料（RTP）可以排除各種短壽命的背景熒光信號的干擾，比如激發(fā)光源的散射和生物體自發(fā)熒光，從而具有更高的信噪比。另一方面，RTP 染料分子對三重態(tài)氧氣分子具有靈敏的響應(yīng)特性，可被用于生物體內(nèi)氧環(huán)境的監(jiān)測。相比含重金屬或稀土元素[6]的磷光材料，純有機RTP 材料毒性更低、可設(shè)計性更強、生物相容性更好，因而具有更廣闊的應(yīng)用前景。然而，由于其應(yīng)用需要在苛刻的低溫和惰性條件下實現(xiàn)，長期以來其發(fā)展和應(yīng)用受到了限制。近年來，聚集發(fā)光科學(xué)的大力發(fā)展為有機RTP 材料的開發(fā)與應(yīng)用提供了更多的可能性。

目前已發(fā)展的有機RTP 聚集體可以為晶體、無定型粉末、薄膜、納米粒子等狀態(tài)，通過合理的分子設(shè)計與制備方法，在室溫條件下可實現(xiàn)高效且長壽命的發(fā)光[1]。納米尺寸的發(fā)光染料具有優(yōu)異的生物相容性及生物組織穿透性能，可被廣泛地應(yīng)用于生物診療領(lǐng)域。納米材料也可以與生物分子偶聯(lián)執(zhí)行特定的生物功能，進(jìn)行快速靈敏的生物分析檢測[7]。因此，開發(fā)新型的有機RTP 納米材料已成為近年來的一個研究重點[8]。然而，實現(xiàn)磷光納米聚集體的難點主要在于提高磷光發(fā)光效率以及穩(wěn)定納米磷光體系。由于有機分子的三重態(tài)激發(fā)態(tài)容易受到熱和碰撞等非輻射弛豫的影響，并且對空氣中三重態(tài)氧氣分子的存在也十分敏感，因此提高RTP 效率應(yīng)滿足以下要求：實現(xiàn)更多的三重態(tài)激子從最低單重態(tài)到三重態(tài)的高效系間竄躍，從最低三重態(tài)快速輻射躍遷到基態(tài)和抑制三重態(tài)激子的非輻射衰減和淬滅過程[9]。從分子設(shè)計策略方面，可以通過合理引入孤對電子、重原子效應(yīng)、分子聚集效應(yīng)等方式提升系間竄躍效率；從聚集行為調(diào)節(jié)方面，可以通過結(jié)晶、聚合、主客體絡(luò)合作用、基質(zhì)僵化、碳點等方式減少非輻射躍遷，并抑制氧氣和水對磷光的淬滅[1]。

為了開發(fā)出生物應(yīng)用中性能更優(yōu)越、更穩(wěn)定的磷光納米材料，本文重點闡述構(gòu)筑有機RTP 納米粒子穩(wěn)定體系的方式，系統(tǒng)總結(jié)RTP 納米材料的兩親性分子包裹、主客體作用、納米聚合、有機-無機納米雜化等具體策略及機制。此外，基于有機RTP 納米粒子長壽命發(fā)光與對三重態(tài)氧敏感響應(yīng)的光物理特性，展示磷光納米材料的細(xì)胞成像、組織成像、壽命成像、長余輝成像等生物應(yīng)用。

1 有機RTP 納米粒子構(gòu)筑方式

在已發(fā)展的高效、長壽命RTP 材料制備策略的基礎(chǔ)上，如何構(gòu)筑穩(wěn)定的、水溶性好的納米聚集體是一個重要的發(fā)展方向?；诓煌牧坠夥肿芋w系，有效構(gòu)筑策略主要有兩親性分子包裹的納米晶體顆粒、磷光聚合物納米顆粒、主客體體系的納米顆粒以及有機-無機納米雜化碳納米點（見圖1）。

圖1 有機RTP 納米材料體系構(gòu)筑方式Fig.1 Construction methods of organic RTP nanomaterials

現(xiàn)有報道的大部分RTP 聚集物為大顆粒晶態(tài)固體[10]，將這類大顆粒固體轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的納米晶體顆粒是制備納米磷光材料最簡單的途徑之一（見圖1a）。有機分子中產(chǎn)生的三重態(tài)激子對氧氣和溫度高度敏感，因此需要通過剛性的結(jié)晶固態(tài)結(jié)構(gòu)來限制晶體中的分子運動，延緩非輻射躍遷，從而產(chǎn)生磷光，這就是“結(jié)晶誘導(dǎo)磷光”現(xiàn)象[11]。目前報道的大多數(shù)室溫有機磷光材料為塊狀晶體，晶體的尺寸較大，限制了其在生物領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，因此需要將磷光材料的尺寸縮小到納米尺度。分散納米晶體的方法包括超聲處理和結(jié)晶誘導(dǎo)，超聲處理是將大顆粒晶體通過較大功率的超聲作用形成納米晶體顆粒，結(jié)晶誘導(dǎo)則是在納米磷光聚集體溶液中加入晶種，通過超聲誘導(dǎo)，生成納米晶體顆粒。然后通過兩親性化合物包裹納米晶體來穩(wěn)定水中的納米顆粒以增加分散性、水溶性和生物相容性，兩親性分子主要包括聚乙二醇（PEG）-聚丙二醇（PPG）-PEG(F127)[12]三嵌段共聚物、聚苯乙烯（PS）:PEG:COOH[13]、PEG2000[14]以及皂素[15]等。

除了結(jié)晶體系，非晶態(tài)RTP 體系也可以通過聚合策略使得結(jié)構(gòu)限域化。在RTP 聚合物材料中，磷光核心可位于側(cè)鏈或終端位置（見圖1b）。側(cè)鏈體系是將有機RTP 體連接在聚合物剛性主鏈（如透明質(zhì)酸、殼聚糖）上，增加磷光壽命同時提升水溶性、生物相容性和可生物降解性。終端體系則是通過將有機RTP 核心和聚合物基質(zhì)（如聚乳酸[16]）共價交聯(lián)，這種方法可使磷光量子效率急劇增加。

緊密堆積的雙組分主客體型RTP 體系也可以有效地制備磷光納米顆粒。主客體相互作用可以限制磷光體分子的運動，避免了客體磷光體被氧和水淬滅以及不必要的三重態(tài)能量耗散，同時也可以避免主體磷光分子高濃度導(dǎo)致的自猝滅過程[17-18]?？腕w分子通常具有優(yōu)異的磷光性能，主體分子可以為小分子、超分子以及聚合物（見圖1c）等。由于超分子體系中，生物相容性大環(huán)類化合物（即環(huán)糊精[19]、冠醚[20]、杯芳烴[21]、葫蘆脲[22]等）具有內(nèi)部疏水性/外部親水性的特點，可以與磷光分子相互作用，客體分子部分或完全嵌入主體分子中，產(chǎn)生限域作用，減少磷光非輻射躍遷，從而穩(wěn)定磷光發(fā)射。

有機-無機納米雜化碳納米點也是一種穩(wěn)定磷光碳納米點顆粒的有效途徑[23]。將碳納米點固定到無機基質(zhì)（例如SiO2）中以保護(hù)磷光碳納米點的三重態(tài)激子，一方面可以隔絕氧氣，另一方面可以限制碳點材料中化學(xué)鍵的旋轉(zhuǎn)和振動，從而減少非輻射躍遷，產(chǎn)生高效的磷光發(fā)射（見圖1d）。此外，無機SiO2納米顆粒的引入能增加磷光體系的水溶性和生物相容性，使得碳納米點基材料可應(yīng)用于生物傳感、光動力療法和生物成像等領(lǐng)域。

2 水溶性磷光納米粒子制備策略

2.1 兩親性分子包裹型納米晶體顆粒

兩親性分子包裹尺寸合適且穩(wěn)定的納米晶體顆粒是實現(xiàn)有機RTP 納米顆粒最為簡單有效的策略[24-25]。Nicol 等[15]提出了一種在細(xì)胞內(nèi)用皂苷遞送深紅色發(fā)光聚集誘導(dǎo)發(fā)光納米顆粒和純有機RTP納米晶體的方法。皂苷分子具有獨特的透化性和兩親性，在水溶液中自組裝形成膠束，將發(fā)光納米顆粒和純有機RTP 納米晶體包封在膠束內(nèi)（見圖2a）。1-[二苯并(b,d)呋喃-2-基]苯基甲酮（BDBF，見圖2b）因其在環(huán)境室溫條件下具有0.23 s 長壽命和36%高發(fā)射效率而被選為磷光壽命成像探針的純有機RTP 納米晶體，通過改良的納米沉淀方法得到有效直徑為476.71 nm、多分散性指數(shù)為0.158 的磷光納米晶體，見圖2c 所示的粒子粒度分布和透射電鏡（TEM）圖像，其成功地被遞送到HeLa 細(xì)胞中，并顯示出長達(dá)100 ms 的持久壽命，比傳統(tǒng)染料（HPS）和背景自發(fā)熒光長4 個數(shù)量級（圖2d）。簡單超聲制備的納米晶體尺寸相對較大不利于生物細(xì)胞成像，納米晶體顆粒均一性也待提升。

圖2 皂苷包裹納米顆粒（a）；磷光分子BDBF 的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)（b）；皂苷包裹的納米晶體的粒度分布（插圖：納米粒子的透射電鏡圖像）（c）；HeLa 細(xì)胞中皂苷包裹的磷光納米晶體和細(xì)胞自發(fā)熒光之間的歸一化發(fā)光衰變比較（d）[15]Fig.2 Saponin nanoparticles (a); chemical structure and properties for phosphor BDBF (b); particle size distribution for saponin@nanocrystals (inset: TEM images for nanoparticles) (c); normalized luminescence decay comparison between saponin@nanocrystals and cellular autofluorescence in HeLa cells (d) [15]

Zhen 等[12]也發(fā)展了一種制備磷光晶體納米粒子的方法（磷光化合物OS1 的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖3a），直接將RTP 晶體材料轉(zhuǎn)化為尺寸更?。ㄖ睆綖?0～80 nm）的水溶性納米顆粒，產(chǎn)生聚集體（見圖3b-c）。此法制備的納米顆粒具有更強的分子堆積，能作為能量陷阱來形成具有穩(wěn)定三重態(tài)激子的H-聚集體。通過兩親性分子F127 包裹后的納米晶體磷光壽命為861 ms，磷光量子產(chǎn)率為1.59%。Zhou等[26]提出了使用兩親性表面活性劑聚合物聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包裹磷光小分子化合物獲得長壽命納米晶體的策略，得到284.59 ms 的超長發(fā)射壽命和7.6%的磷光量子效率（見圖3d）。Fan 等[27]構(gòu)筑了具有大共軛骨架和支鏈結(jié)構(gòu)的電子給體-電子受體系統(tǒng)，其柔性側(cè)鏈可以提高溶解度并且穩(wěn)定三重態(tài)，再采用F127 兩親性三嵌段共聚物包覆三苯胺-苯并噻唑有機發(fā)光原獲得紅色RTP 水溶性納米顆粒，使用壽命長達(dá)344 ms，可用于手機手電筒激發(fā)的小鼠皮下和淋巴結(jié)部分的深度穿透的磷光生物成像。Cong 等[28]利用環(huán)烷基修飾吩噻嗪-5,5-二氧化物（CsO）核心開發(fā)了一種超長壽命的藍(lán)色RTP 材料，與常用的開鏈烷基修飾相比，環(huán)烷基的位阻更小，加強了分子間作用力，隨著環(huán)碳數(shù)的增加，磷光由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，壽命長達(dá)1 116.10 ms。

圖3 磷光化合物OS1 的化學(xué)結(jié)構(gòu)（a）[12]；合成納米晶體OSNs-T 方法（b）[12]；OSN1-T 透射電鏡圖像（c）[12]；納米晶體的壽命衰減曲線（d）[26]Fig.3 Chemical structure of phosphorescent compound OS1 (a) [12]; top-down route to synthesize nanocrystals OSNs-T (b) [12];TEM image for OSN1-T (c) [12]; (d) lifetime decay profiles of the emission bands at 530 nm of OSN1[26]

另一種納米結(jié)晶策略是向非發(fā)射納米聚集體中加入晶種，超聲處理促進(jìn)發(fā)光納米晶體從它們的晶種中分離（見圖4a）[29]。納米結(jié)晶法是在良溶劑/不良溶劑介質(zhì)（例如四氫呋喃/水）中對化合物的非晶態(tài)納米團聚物進(jìn)行超聲處理而發(fā)生結(jié)晶，增加不良溶劑的比例可以有效減小晶體尺寸，通過對不同混合比例的研究，獲得了最佳的溶劑配比，并用于納米結(jié)晶[30]。Zhi 等[31]發(fā)現(xiàn)，超聲一定時間后出現(xiàn)了磷光峰，磷光強度隨超聲時間增長而增強，表明更多的無定形顆粒轉(zhuǎn)化成了納米晶體。Fateminia等[32]利用這種超聲法得到了紅色發(fā)光的尺寸為180 nm 的RTP 納米晶體（見圖4）。無定型的納米顆粒表現(xiàn)出微弱的磷光，而納米晶體磷光發(fā)射與固體粉末塊狀晶體的磷光發(fā)射幾乎是相同的強紅色長壽命磷光，從而實現(xiàn)了穩(wěn)定且長波長發(fā)射的磷光納米晶體磷光體系。

圖4 超聲誘導(dǎo)結(jié)晶制備納米晶體示意（a）[29]；紅色磷光化合物分子結(jié)構(gòu)和固態(tài)發(fā)射光譜（b）；無定形納米（c）與納米晶體（d）透射電鏡圖像；不同染料和乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)的懸浮液發(fā)光照片（k）[32]Fig.4 Illustration of preparing nanocrystals of ultrasonic-induced crystallization (a) [29]; chemical structures of a red RTP compound C-C4-Br and PL spectra in the solid state (b); SEM images of amorphous nanoaggregates (c) and nanocrystals (d);images of breast cancer cells incubated with different dyes(k) [32](e) nanocrystals (UV on); (f) nanocrystals (UV off); (g) fluorescein (UV on); (h) fluorescein (UV off);(i) nanocrystals and fluorescein (UV on); (j) nanocrystals and fluorescein (UV off)

Wang 等通過簡單的良與不良溶劑混合法，開發(fā)了一種溴原子取代的氟硼類磷光納米聚集體（見圖5）。該有機納米顆粒在水溶液中可通過可見光或雙光子近紅外光激發(fā)實現(xiàn)紅色的RTP，納米顆粒中的紅色RTP 來源于化合物的二聚體，該納米聚集體的平均粒徑為85 nm，在水溶液中其磷光發(fā)射中心為636 nm，壽命為27.6 μs[33]。

圖5 化合物分子Br-NpCzBF2 結(jié)構(gòu)（a）；簡明的發(fā)光機理圖（b）；磷光納米粒子的透射電鏡圖像（c）；可見光和近紅外光激發(fā)的激發(fā)態(tài)二聚體的水中RTP 示意圖（d）[33]Fig.5 Molecular structures of compounds Br-NpCzBF2 (a); general diagram of luminescence mechanism(b); SEM image of phosphorescent nanoparticles (c); illustration of visible-and NIR-light triggered RTP from excited dimers in water (d) [33]

以上介紹的制備納米磷光體系方式主要為通過兩親性分子來包裹本身具有較好磷光性能的納米顆粒，制備的絕大多數(shù)納米顆粒為晶態(tài)或者緊密堆積的聚集體。兩親性分子的主要作用是穩(wěn)定納米顆粒，防止顆粒聚集，同時也賦予了納米磷光體系更好的水溶性和生物相容性。兩親性分子包裹可以進(jìn)一步減少氧氣的淬滅作用，穩(wěn)定磷光發(fā)射。兩親性分子包裹法是一種制備納米磷光體系較為普適性的策略。

2.2 主客體型納米顆粒

利用主客體作用調(diào)控三重態(tài)激發(fā)態(tài)來制備高性能有機熒光或者磷光的余輝材料是一種非常有效的策略。雙組分余輝體系的設(shè)計策略主要包括摻雜劑-基質(zhì)設(shè)計策略、供體-受體設(shè)計策略、敏化策略和能量轉(zhuǎn)移策略，以此實現(xiàn)發(fā)光體系的高強度、長壽命及波長調(diào)控[34-37]。

Dai 等通過集成環(huán)融合效應(yīng)和主客交互作用制備了一種紅色發(fā)射RTP 材料（見圖6a）。將兩個亞甲基引入1,2,5-三苯基-1H-吡咯（TPPy）中以鎖定其分子構(gòu)象并延長偶聯(lián)獲得磷光分子PDPy；選擇低熔點和高三重態(tài)能級的三苯胺（TPA）作為主體組分，將TPPy 和PDPy 作為訪客摻雜進(jìn)入三苯胺來實現(xiàn)磷光（見圖6b）。制備得到的磷光納米顆粒分散良好，約為200 nm 的均勻尺寸，熒光和磷光光譜與自然環(huán)境條件下的晶體非常相似，主要發(fā)射峰在約400 nm 和610 nm 處，磷光壽命達(dá)到139 ms（見圖6c～圖6e）[38]。Xiao 等通過客體-主體摻雜策略獲得了近紅外波長和長壽命（102～324 ms）的有機RTP 納米材料。選擇二苯甲酮化合物作為主體基質(zhì)，一側(cè)或兩側(cè)添加苯甲醚或N,N-二甲基苯胺基團的芘單元作為客體分子。客體分子具有足夠的共軛以降低最低的三重態(tài)能級，主體分子協(xié)助客體分子進(jìn)行激子轉(zhuǎn)移并抑制客體激子的非輻射躍遷[39]。

圖6 通過分子工程（a）和主客體體系（b）實現(xiàn)高效紅磷光材料的設(shè)計理念；主客體體系納米粒子的粒徑分布（插圖：透射電鏡圖像）（c）；水溶液中納米粒子吸收、熒光和磷光光譜（d）；納米粒子的磷光衰變曲線（e）[38]Fig.6 Design concept for highly efficient red-phosphorescence material through molecular engineering (a) and host-guest system (b); the particle size distribution for host-guest nanoparticles (inset: TEM image) (c); absorption, fluorescence, and phosphorescence spectra of nanoparticles in aqueous solution (d); phosphorescence decay curves of nanoparticles (e) [38]

由于有機近紅外RTP 材料的優(yōu)越穿透性，其在生物成像方面具有無可比擬的優(yōu)勢[39]。然而，受能隙定律的限制，近紅外（NIR，＞650 nm）有機室溫磷光材料非常罕見，且已報道的紅色磷光壽命非常短，因此一般采用主客體策略在主客體之間實現(xiàn)單重態(tài)到三重態(tài)的F?rster 共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），從而實現(xiàn)近紅外長壽命發(fā)光的多組分體系[40]。主客體長余輝體系的開發(fā)，為實現(xiàn)各種功能性長余輝材料提供了可能性。由于聚乙烯醇（PVA）具有較好的生物組織相容性，Lin 等將紅光染料和近紅外染料Cy7 摻雜到磷光主體分子的PVA 膜中，在810 nm 處實現(xiàn)了明亮的持久NIR 余輝發(fā)光，壽命為0.20 s，磷光量子產(chǎn)率為0.4%。作者還利用紅光染料作為橋梁，成功地解決了磷光小分子超長磷光發(fā)光光譜和近紅外染料吸收光譜之間重疊極少的問題，達(dá)到磷光主體分子超長磷光來激發(fā)染料的近紅外發(fā)光[41]。Dang 等設(shè)計了一種基于RTP 共振能量轉(zhuǎn)移機制的有機近紅外長余輝納米材料，可用于體內(nèi)余輝成像。這種雙組分體系由短波長的RTP 分子作為磷光供體和近紅外熒光染料作為能量受體組成，以實現(xiàn)RTP 共振能量轉(zhuǎn)移，得到了11.1%的能量轉(zhuǎn)移效率，且量子產(chǎn)率10.74%[42]。

與有機小分子和多組分RTP 材料相比，超分子RTP 材料通?？梢詾槿貞B(tài)激子提供更加穩(wěn)定和剛性的環(huán)境，從而容易獲得壽命更長的RTP 材料。與傳統(tǒng)共價相互作用不同，超分子組裝可以基于更多的分子間相互作用，例如氫鍵、π-π 堆疊、配位和電荷轉(zhuǎn)移等[43-44]。更重要的是，超分子化學(xué)方法為抑制水對磷光的淬滅并構(gòu)建水相RTP 提供了一種有效的方法[45]。超分子中葫蘆[8]脲（CB[8]）是常用的超分子聚合物的主體分子，因為它有一個比較大的空腔，可以包裹客體分子，由于其剛性結(jié)構(gòu)再加上空腔內(nèi)的疏水相互作用，具有很高的選擇性和穩(wěn)定性[31]。Ma 等報道了一種基于CB[8]和苯基吡啶衍生物之間的主體-客體識別的水溶性雙軸類輪烷，這種類輪烷（見圖7）加強了鹵素鍵并減少了非輻射躍遷，可以在水溶液中釋放出有效的磷光，磷光壽命為419 μs，磷光量子產(chǎn)率為2.73%，該類輪烷被成功用于靶向線粒體的細(xì)胞成像[46]。Ma 等制備了一系列具有烷基橋的供體-受體結(jié)構(gòu)的苯基吡啶鹽，通過與CB[8]超分子組裝促進(jìn)跨空間電荷轉(zhuǎn)移來獲得磷光紅移，再與兩親性大環(huán)磺化杯[4]芳烴的進(jìn)一步組裝形成均勻的納米顆粒，增強磷光發(fā)射強度，從而實現(xiàn)雙光子近紅外磷光[47]。

圖7 主客體分子的結(jié)構(gòu)式（a）；主客體分子的光物理性質(zhì)（b）；主客體分子磷光衰減曲線（c）[46]Fig.7 Chemical structure of host-guest molecular (a); photophysical properties of host-guest molecular (b); time-resolved photoluminescence decay curves of host-guest molecular (c) [46]

除了小分子及超分子作為客體材料，聚合物作為主體也可以與客體磷光分子形成特殊的相互作用，構(gòu)建穩(wěn)定的納米磷光體系[31]。Zeng 等成功制備一種聚合物包覆小分子磷光中心的有機RTP 納米顆粒（見圖8），可用于活兔脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜組織缺氧的縱向光學(xué)可視化。非金屬的純有機RTP 分子（Br6A）分散在具有良好剛性和透氧性的聚合物基質(zhì)聚對溴苯乙烯中，然后在納米沉淀過程中，通過在水基外相中引入兩親性陰離子磷脂（DMPA），在固體聚合物核心上實現(xiàn)了脂質(zhì)涂層（見圖8a）Br6A 的羰基氧與聚（4-溴苯乙烯）（PS4Br）的鄰近溴原子之間的鹵素鍵合，可以抑制碰撞發(fā)射猝滅，并增強Br6A的系統(tǒng)穿越效率（見圖8b）。同時，磷脂的兩親性和陰離子結(jié)構(gòu)可以通過靜電排斥或水合作用阻止納米顆粒聚集，對實現(xiàn)納米顆粒在水相中均勻分散具有重要作用。如圖8c 和圖8d 所示，納米顆粒水懸浮液延遲光譜顯示納米顆粒具有明亮的綠色磷光發(fā)射，磷光壽命為4.0 ms，量子效率為16.9%±3.0%[48]。

圖8 脂質(zhì)-聚合物雜交核殼型RTP 納米粒子Br6A-LPS4Br 納米粒子的合成方法（a）；氧氣敏感材料光物理過程示意（b）；乏氧水溶液中的納米粒子的穩(wěn)態(tài)激發(fā)、發(fā)射和延遲發(fā)射光譜（c）；RTP 納米粒子在乏氧水溶液中的磷光壽命（d）[48]Fig.8 Synthetic procedure of room-temperature phosphorescent Br6A-LPS4Br nanoparticles with lipid-polymer hybrid core-shell (a); schematic diagram of the photophysical process of oxygen-sensitive materials (b); steady-state photoluminescence excitation, emission, and delayed emission spectra of nanoparticles in anoxic aqueous solution (c);phosphorescence lifetime of RTP nanoparticles in anoxic aqueous solution (d) [48]

主客體策略以磷光分子為客體發(fā)光體，主體材料為小分子、超分子以及聚合物。主體分子的包覆作用可以限制磷光體分子的運動，避免了客體磷光體被氧和水淬滅，同時也可以減少主體磷光分子高濃度導(dǎo)致的自猝滅過程。其中，小分子類主客體體系，通過選擇主體分子的能級水平，形成三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移，從而實現(xiàn)波長的調(diào)控。

2.3 磷光聚合物型納米顆粒

無定型的RTP 聚合物是將磷光發(fā)色團以共價鍵的方式引入聚合物中，可以有效降低磷光中心的聚集淬滅，減小分子振動的能量耗散，形成穩(wěn)定強健的納米材料。引入功能性的聚合物也可以更好地提高生物相容性，拓展其在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用范圍[49-50]。

Fraser 等報道了一例水溶液中的聚合物磷光納米顆粒，該聚乳酸（PLA）磷光高分子化合物是由開環(huán)聚合反應(yīng)制得，聚合物鏈終端為磷光體二氟硼二苯甲酰甲烷，其在水溶液中自然形成的納米顆粒的粒徑較?。ㄐ∮?00 nm，見圖9e），在空氣中具有強烈的藍(lán)色熒光，且在氮氣環(huán)境下具有壽命約為200 ms 的綠色RTP[51]。Zhang 等又開發(fā)了一系列具有雙發(fā)射的磷光材料，通過控制開環(huán)聚合反應(yīng)制備了具有不同PLA 鏈長度的BF2dbm（I）化合物1～3（見圖9a）。低PLA 鏈長度分子中內(nèi)部重原子效應(yīng)使得材料磷光強度最強。材料的熒光發(fā)射峰信號基本保持不變，但是磷光發(fā)射峰的強度會隨著氧含量的增加而呈現(xiàn)線性減小的趨勢（見圖9d）。如圖9b 和圖9c 所示，磷光聚合物薄膜在空氣和氮氣中的穩(wěn)態(tài)發(fā)射光譜表現(xiàn)出不同顏色和亮度，具有可比且易于檢測的熒光和磷光強度（例如P2），有利于比率型缺氧可視化成像[16]。Chen 等基于類似開環(huán)聚合的方法制備了以N-取代的萘酰亞胺為磷光基元的PLA 聚合物RTP 體系。該磷光聚合物無需通過重原子效應(yīng)增強RTP，而是在磷光基元N-取代的萘酰亞胺中引入供體單元，形成電荷轉(zhuǎn)移的激發(fā)態(tài)，減少三重態(tài)與單重態(tài)能差，從而提升聚合物RTP強度[52]。

圖9 開環(huán)聚合制備磷光聚合物（a）[16]；聚合物薄膜在空氣（b）和氮氣（c）下穩(wěn)態(tài)發(fā)射光譜及發(fā)光照片[16]；不同氧水平與熒光/磷光強度比的線性關(guān)系（d）[16]；BF2dbmPLA 納米顆粒的透射電鏡照片和納米顆粒懸浮液的熒光（左）和磷光（右）照片（e）[51]Fig.9 Phosphorescent polymers prepared by ring-opening polymerization (a) [16]; steady-state emission spectra and luminescence images of polymer films under air (b) and nitrogen (c) [16]; linear relationship between oxygen level and the fluorescence/phosphorescence intensity ratio (d) [16]; TEM image of BF2dbmPLA nanoparticles and images showing fluorescence (left) and phosphorescence (right) of the aqueous nanoparticle suspension (e) [51]

Chen 等還利用天然生物大分子對N-取代的萘酰亞胺（NNI）進(jìn)行修飾，開發(fā)了一種殼聚糖為主鏈、NNI 磷光體為側(cè)鏈的磷光聚合物體系，在室溫下空氣中顯示出紅色RTP（磷光壽命τ為5.3 ms）（見圖10a），利用生物大分子牛血清白蛋白（BSA）修飾的NNI 聚合物也可以實現(xiàn)黃色RTP（τ為0.24 ms）（見圖10b）[52]。Zhou 等進(jìn)一步將磷光基團4-(4-溴苯基)吡啶-1-鹽（BrBP）修飾在具有腫瘤靶向的高分子聚合物透明質(zhì)酸（HA）的側(cè)鏈上，在水中向HA-BrBP 中添加CB[7]或CB[8]形成類輪烷聚合物時，其形貌由小球分別變?yōu)榫€性和大球型組裝體（見圖10c），由于BrBP 與CB[8]具有更強的主客體相互作用以及與HA 鏈上氫鍵具有協(xié)同效應(yīng)，在相同條件下CB[8]/BrBP 的磷光是CB[7]/BrBP 的33倍。使用CB[8]/HA-BrBP 類輪烷聚合物可以實現(xiàn)水溶液中的高效RTP，磷光壽命為4.33 ms，量子產(chǎn)率為7.58%。歸因于HA 的靶向特性，該超分子聚合物成功應(yīng)用于線粒體的癌細(xì)胞靶向磷光成像[44]。

圖10 殼聚糖聚合物的結(jié)構(gòu)和其在空氣（黑色）和真空（紅色）中穩(wěn)態(tài)光譜（a）[52]；BSA 修飾大分子的結(jié)構(gòu)及其懸浮液（紅色）和BSA 水溶液（黑色）的穩(wěn)態(tài)光譜（b）[52]；超分子類輪烷聚合物在水溶液中的構(gòu)建（c）[44]；水溶液中含及不含CB[7]（d）或CB[8]（e）的聚合物在空氣和氮氣下的磷光光譜[44]Fig.10 Chemical structure of chitosan polymer and steady-state spectra in the air (black) and vacuo (red) (a) [52]; chemical structure of bovine serum albumin modified macromolecule and steady-state spectra of BSA aqueous solution (black) and a suspension of bovine serum albumin modified macromolecule (red) (b) [52]; the construction of supramolecular pseudorotaxane polymers in aqueous solution (c) [44]; the phosphorescence spectra of polymers with and without CB[7] (d) and CB[8] (e) in aqueous solution under air and nitrogen [44]

納米聚合策略是選取合適的磷光單元，掛接在剛性聚合物主鏈上，或者以端基形式被聚合物鏈包裹，最終形成聚合物納米顆粒體系，也需要利用重原子、超分子主客體作用來增強磷光。利用此策略實現(xiàn)高性能的磷光納米材料的案例還較少，穩(wěn)定三重態(tài)發(fā)光的機制不是十分清晰，有待開發(fā)更多的聚合物納米磷光體系。

2.4 納米雜化碳納米點

碳納米點是一種尺寸小于10 nm 的新型發(fā)光納米顆粒[53]，其具有制備簡單、發(fā)光強度高且性能穩(wěn)定的優(yōu)點，同時還具有良好的生物安全性，具有磷光發(fā)射性能的碳納米點材料有望應(yīng)用于生物成像或治療領(lǐng)域[54-56]。碳納米點的RTP 大多是在固體基質(zhì)（如聚乙烯醇[57]，再結(jié)晶尿素/雙縮脲[54]，硫酸鋁鉀[58]和沸石[59]）中實現(xiàn)。少數(shù)碳納米點通過水熱法合成，可以有一定的水溶性[60]，而大多數(shù)碳納米點材料的水溶性較差。近年來，將磷光碳納米點引入到無機納米材料內(nèi)部相對剛性的環(huán)境中，即納米雜化碳納米點策略，可以進(jìn)一步穩(wěn)定三重態(tài)激子，同時可降低氧氣的干擾，在水溶液中實現(xiàn)明亮的RTP[61]。

最近，Wu 等采用來源于自然界的天然高分子材料制備碳納米點材料，由具有氨基的殼聚糖合成的生物質(zhì)基碳納米點材料具有低成本、高豐度和綠色環(huán)保等優(yōu)點，且無需依靠有機溶劑和鹵素元素就能獲得綠色熒光和穩(wěn)定的RTP，平均壽命為262 ms，可見光激發(fā)后余輝也能長達(dá)2 s 左右[62]。此外，Shi 等也從生物質(zhì)小麥秸稈中制備了綠色RTP 碳納米點材料，并且通過硼摻雜和間苯二甲酸（IPA）涂層的方法提供一個剛性環(huán)境，以穩(wěn)定碳納米點中的三重態(tài)激發(fā)態(tài)，獲得了肉眼可見約5 s 的綠色室溫磷光[63]。

二氧化硅無毒且不含金屬離子，其多孔網(wǎng)絡(luò)能有效增加碳納米點材料在水溶液中的分散性，已成為構(gòu)筑穩(wěn)定RTP 碳納米點體系的一種典型策略。Liang 等將水溶性碳納米點限域在二氧化硅的納米空間中，實現(xiàn)了一種具有超長高效RTP 的生物相容性有機-無機納米雜化碳納米點材料。以乙二胺（EDA）和磷酸（PA）為原料生產(chǎn)碳納米點，采用二氧化硅包膜層保證碳納米點的溶解度，使碳納米點與周圍水溶液中的氧隔離（見圖11a），從透射電鏡圖像中可以看出，納米顆粒涂有無定形硅殼，限制了其共價鍵的運動和振動。這種雜化的方法減少了三重態(tài)激子發(fā)光淬滅，實現(xiàn)了肉眼可觀察到的長壽命亮綠色磷光。碳納米點的壽命和發(fā)光量子產(chǎn)率分別為1.86 s 和11.6%。該方法制備的磷光有機-無機納米雜化碳納米點成功實現(xiàn)了體內(nèi)/體外的余輝成像[64]。Li 等通過硅酸四乙酯的水解和縮合，將碳納米點結(jié)合到三維二氧化硅網(wǎng)絡(luò)得到了碳點基二氧化硅復(fù)合材料，其具有長達(dá)1.64 s 的超長RTP 壽命[65]。Hao等通過水熱法處理三乙烯四胺和四乙氧基硅烷（TEOS）制備了長余輝RTP 的氮摻雜碳納米點材料（圖11b），其中N—CD 鍵和二氧化硅之間的共價連接的Si—O—C 鍵進(jìn)一步增強了結(jié)構(gòu)剛性并保護(hù)了發(fā)光中心，獲得壽命長達(dá)1.81 s 的黃綠色RTP，并成功應(yīng)用于有熒光背景信號干擾的血清中三價鐵離子的定量檢測[66]。

圖11 WSP-CNDs@二氧化硅的制備工藝，透射電鏡圖像，熒光和磷光光譜和紫外照射圖像（a）[64]；N-CDs@二氧化硅的制備工藝和發(fā)光性質(zhì)圖像（b）[66]Fig.11 The preparation process, the TEM image, the fluorescence and phosphorescence spectra and images after UV irradiation of the WSP- CNDs @ silica (a) [64]; the preparation process and luminescence properties of N-CDs @ silica (b) [66]

3 磷光納米材料生物成像應(yīng)用

開發(fā)具有低毒性、低成本、生物相容性好、穩(wěn)定長壽命或?qū)ρ鯕饷舾械母吡炼扔袡CRTP 納米材料，是實現(xiàn)多功能生物成像應(yīng)用的前提[1]。在細(xì)胞等生物體成像中，利用具有毫秒級別壽命的RTP 納米材料與時間門控顯微鏡技術(shù)結(jié)合，可以排除各種短壽命的背景熒光信號的干擾，比如激發(fā)光源的散射和雜質(zhì)的自發(fā)熒光，成像具有更高的信噪比[67]；而基于幾百毫秒甚至秒級壽命RTP 組分制備的長余輝納米材料，可以像長余輝的化學(xué)發(fā)光一樣應(yīng)用于活體內(nèi)組織的長余輝成像。此外，利用氧氣敏感型高亮度RTP 來可視化檢測生物組織內(nèi)部氧環(huán)境，可實現(xiàn)腫瘤等與氧含量相關(guān)的組織診斷。

3.1 細(xì)胞共聚焦磷光成像

Nicol 等[15]通過兩親性皂苷包裹得到的高效持久的純有機RTP 納米晶體，可成功通過HeLa 細(xì)胞的透化膜，并保持長達(dá)100 ms 的綠色持久壽命磷光（圖12a-1）。在實際生物成像應(yīng)用中，由于其相對短波長的激發(fā)，深層組織穿透是無金屬有機RTP 材料的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，因此有效的紅色發(fā)射是生物成像的另一個關(guān)鍵點。Fateminia 等將具有棒狀形態(tài)和180 nm 尺寸的納米晶體，通過兩親性分子包裹后得到納米粒子用于乳腺癌細(xì)胞的體外磷光成像，顯示出明亮的紅色磷光發(fā)射（圖12a-2）。該納米粒子可用于清楚地區(qū)分納米晶體標(biāo)記的細(xì)胞與熒光素染料干擾和背景自發(fā)熒光[32]。肝臟細(xì)胞也是細(xì)胞成像中的常用細(xì)胞，Cai 等報道了一種長有機RTP 納米材料，用F127 封裝后得到穩(wěn)定的水溶性長磷光納米粒子培養(yǎng)活體HepG2 細(xì)胞（人類肝癌細(xì)胞）2 h 后，可觀察到RTP 納米粒子可以很容易地穿過細(xì)胞膜并利用超長RTP 特征可標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)和磷光成像（圖12a-3）[68]。

圖12 用磷光納米粒子培養(yǎng)的Hela 細(xì)胞、肝臟細(xì)胞的共聚焦顯微鏡成像（a）[15,32,68]；Hela 細(xì)胞和斑馬魚的磷光壽命成像[26]，在真空條件下的時間門控的應(yīng)用及用磷光納米粒子處理后的神經(jīng)元細(xì)胞的顯微鏡成像[52]（b）；活體小鼠淋巴結(jié)的熒光和磷光成像[12]，用有機-無機雜化碳納米點處理的綠豆芽莖的橫截面和洋蔥鱗莖表皮組織熒光和磷光圖像[66]，PRET 的磷光機理圖和活體小鼠體內(nèi)余輝成像[42]（c）；不同氧氣含量的乳腺癌瘤區(qū)成像[16]，活兔視網(wǎng)膜缺氧成像示意圖及在家兔玻璃體內(nèi)注射磷光納米粒子后不同時間的激光損傷部位的熒光和磷光成像[48]（d）Fig.12 Confocal microscopic imaging of Hela cells, liver cells cultured with phosphorescent nanoparticles (a) [15,31,68];phosphorescent lifetime imaging of Hela cells and zebrafish [26], applications of temporal gating under vacuum conditions and microscopic imaging of neuronal cells treated with NPs [52] (b); fluorescence and phosphorescence imaging of lymph nodes in living mice[12], fluorescence and phosphorescence images of cross-sections of mung bean sprouts and epidermal tissue of onion bulbs treated with organic-inorganic hybridized carbon nanodots [66], phosphorescence mechanism diagram of PRET and in vivo afterglow imaging of living mice [42] (c); imaging of breast cancer tumor areas with different oxygen levels [16], schematic diagram of hypoxia imaging of living rabbit retina and fluorescence and phosphorescence imaging of laser damage sites at different times after intravitreal injection of NPs in rabbits [48] (d)

3.2 磷光壽命成像

Zhou 等[26]采用自上而下的方法，使用F-127 包封長壽命和高磷光效率的紅色發(fā)射材料，成功制備了粒徑在5 nm 左右的分散良好的磷光納米點（PND），可應(yīng)用于活的HeLa 細(xì)胞和斑馬魚中磷光壽命成像顯微鏡。如圖12b 所示，很明顯HeLa 細(xì)胞核染料具有自身強熒光干擾。在1 μs 時間延遲后，只能觀察到來自細(xì)胞質(zhì)PND的長壽命磷光信號，而來自細(xì)胞核的強熒光信號消失，即使在10 μs之后，磷光信號仍然可見。類似的現(xiàn)象也可以在斑馬魚體內(nèi)成像中獲得。Chen 等用天然生物大分子、聚殼聚糖和牛血清白蛋白對RTP 材料進(jìn)行了改性修飾后，可進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞的紅色發(fā)射RTP 成像。與時間門控顯微鏡技術(shù)結(jié)合后，可顯示RTP 在80 ms 內(nèi)的緩慢衰減（見圖12b）[52]。

3.3 長余輝成像

基于長壽命RTP 材料可制備在水溶液中表現(xiàn)出強烈余輝的納米粒子，可用于體內(nèi)余輝成像以消除背景信號的干擾。Zhen 等[12]將水溶性納米顆粒皮下注射至小鼠背部，不久后可通過紫外線（UV）照射誘導(dǎo)持久性RTP。納米粒子的熒光信號完全被小鼠皮膚的強烈自發(fā)熒光所掩蓋，磷光納米粒子在活體小鼠身上變得清晰可見（見圖12c）。Li 等觀測了超長RTP 的有機-無機雜化納米顆粒處理植物樣品（綠豆芽和洋蔥球表皮組織）的磷光衰變。有機-無機納米雜化的碳點CDs@SiO2具有較低的生物毒性，穿過植物和動物組織中的細(xì)胞壁（見圖12c），可以成功通過消除自發(fā)熒光的干擾，對植物細(xì)胞進(jìn)行成像[66]。Dang 等利用能量轉(zhuǎn)移策略得到的雙組分納米晶體顆粒mTPA-N 探針。mTPA-N 具有極低的背景噪聲和深層組織穿透力以及紅色余輝發(fā)光，mTPA-N 允許在信噪比高達(dá)104.40 的情況下對活小鼠的淋巴結(jié)進(jìn)行近紅外余輝成像（見圖12c）[42]。這些結(jié)果表明，使用具有持久性RTP 的材料可以在體內(nèi)條件下進(jìn)行不依賴背景的高對比度成像。

3.4 組織氧環(huán)境成像

眾所周知，腫瘤內(nèi)微環(huán)境顯著缺氧，準(zhǔn)確的乏氧成像能幫助臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)和定位缺氧腫瘤，為癌癥的診斷和治療做出巨大貢獻(xiàn)。對氧敏感的RTP 材料在腫瘤缺氧成像應(yīng)用上具有很大的潛力。Zhang等[16]將合成的碘代二氟硼烷二苯甲酰甲烷聚乳酸聚合物（BF2dbm(I)PLA）納米粒子應(yīng)用于腫瘤成像中。在空氣和氮氣不同狀態(tài)下，以熒光強度和磷光強度之間的比率顯示微血管和腫瘤組織，即紅色區(qū)域和藍(lán)色區(qū)域之間對比較明顯（見圖12d）。因此這種聚合物的納米顆?？稍诟叻直娉上裰凶鳛楸嚷侍结槣y定腫瘤缺氧成像區(qū)域。Zeng 等[48]研發(fā)的多功能脂質(zhì)-聚合物混合組裝體系，可用于以無損方式縱向光學(xué)可視化活兔脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜組織缺氧（見圖12d）。將含有磷光基元的水溶性納米粒子靜脈注射至生物體內(nèi)15 min 后，將與納米粒子一起注入的溶解氧被逐漸消耗，在兔玻璃體內(nèi)的磷光信號清晰可見。納米粒子有效地積聚在脈絡(luò)膜的激光病變處，在2 h 后出現(xiàn)RTP 信號峰值的開啟模式。該體系納米粒子對氧猝滅具有高度響應(yīng)性，這使得它們能夠被用作脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜組織缺氧的開啟成像探針，有望作為監(jiān)測縱向組織氧氣水平和評估各種缺氧驅(qū)動的血管疾病的靈敏成像工具。

4 結(jié)語與展望

本文系統(tǒng)性分析和概括了生物相容性有機RTP 納米粒子的設(shè)計策略、光物理機制和制備方法，總結(jié)了基于RTP 特性的納米材料在生物成像領(lǐng)域的特殊應(yīng)用。盡管有機RTP 材料發(fā)展日益迅速，通過精巧的分子設(shè)計和聚集行為調(diào)節(jié)不再局限于低溫和惰性條件，但是現(xiàn)有的RTP 聚集體大多為晶態(tài)材料，雖然利用兩親性分子包裹的納米晶體可以解決生物相容性的難題，但是此類復(fù)雜的多元體系不適合長期穩(wěn)定的生物成像研究。因此發(fā)展更為穩(wěn)定且制備簡單的組分單一的磷光納米材料具有重要的研究價值，例如引入聚合物鏈制備生物相容性好的磷光納米材料。同時，為實現(xiàn)高效RTP，許多磷光體系需要引入重原子溴或碘，這降低了光穩(wěn)定性并可能對生物產(chǎn)生一定的毒性，所以發(fā)展無重原子的磷光納米材料也是一個重要的目標(biāo)。另外，大多數(shù)已報道的有機RTP 體系激發(fā)波長較短，僅能被對生物有害的紫外線激發(fā)，其發(fā)射的磷光多為生物穿透性一般的黃光和綠光，因此需要發(fā)展可見光或X射線激發(fā)的且具有長波長發(fā)射的磷光納米材料[69]。調(diào)控光物理過程、合理設(shè)計分子得到更多發(fā)光效率高和壽命長的有機RTP 分子或多組分體系，是制備高性能磷光納米粒子的前提。在發(fā)展高性能磷光體系的基礎(chǔ)上，不斷優(yōu)化納米材料的制備方法也至關(guān)重要，例如使用渦流對沖法控制納米粒子形貌，制備更多均一穩(wěn)定的磷光納米粒子[70]。設(shè)計和制備功能性RTP 納米粒子，可以拓寬生物成像應(yīng)用領(lǐng)域。利用三重態(tài)激子敏感性高的特點，引入特殊的生物靶向性或特異性識別的基元，有望實現(xiàn)生物體內(nèi)微環(huán)境響應(yīng)和細(xì)胞組織特殊響應(yīng)。希望本文提供的思路能為新型有機RTP 納米材料的開發(fā)、制備及其生物應(yīng)用提供指導(dǎo)。