山藥中黏液蛋白的提取與相對(duì)分子質(zhì)量的探究

王海娟，石榮花，李艷紅

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽 265200；2.萊陽市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東萊陽 265299）

黏液蛋白是存在于某些植物與動(dòng)物體中的高分子量蛋白質(zhì)，其組成和結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，常與多糖組成蛋白－多糖復(fù)合體，被人體吸收后可轉(zhuǎn)化為免疫蛋白[1]。鐵棍山藥是山藥中的極品，其塊莖富含黏液蛋白。國內(nèi)外關(guān)于山藥營養(yǎng)價(jià)值的研究較多，但對(duì)山藥黏液蛋白的研究不多。以鐵棍山藥為研究材料，采用水提醇沉法提取山藥黏液蛋白；采用SDSPAGE 法測(cè)定山藥中黏液蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，以期為山藥黏液蛋白的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鐵棍山藥粉（過80 目篩）。

1.2 試驗(yàn)試劑及設(shè)備

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、SDS、溴酚藍(lán)、巰基乙醇、甘油、丙烯酰胺、次甲基雙丙烯酰胺、鹽酸、Tris-HCI、TEMED、過硫酸銨、R-250 考馬斯亮藍(lán)、甲醇、95%乙醇、異丙醇、冰醋酸、標(biāo)準(zhǔn)蛋白，除標(biāo)準(zhǔn)蛋白外其他均為分析純。

TDZS-WS 型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；電子調(diào)溫萬用電爐，龍口市電爐制造廠產(chǎn)品；電子天平，梅特勒- 托利多儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市萬合儀器制造有限公司產(chǎn)品；TS-2 型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水提醇沉法試驗(yàn)過程

取樣品1 g 于小燒杯中，加入去離子水25 mL，水浴鍋內(nèi)浸提2 h，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心15 min，收集上清液，加入沉淀劑，攪拌30 min，靜置過夜，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心15 min，收集沉淀，烘干，得到黏液蛋白[2]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在浸提溫度為42 ℃，料液比（黏液蛋白提取液體積∶沉淀劑體積） 為1∶4 的條件下，分別以甲醇、95%乙醇、異丙醇作為沉淀劑進(jìn)行黏液蛋白提取，考查沉淀劑的種類對(duì)黏液蛋白得率的影響。在沉淀劑為異丙醇，浸提溫度為42 ℃的條件下，選擇料液比分別為1∶2，1∶3，1∶4 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考查不同料液比對(duì)黏液蛋白提取率的影響。在沉淀劑為異丙醇，料液比為1∶4 的條件下，選擇浸提溫度為42，45，48 ℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考查不同浸提溫度對(duì)山藥黏液蛋白提取率的影響。根據(jù)正交試驗(yàn)，確定最合適的3 個(gè)試驗(yàn)條件。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.3 SDS- PAGE 法測(cè)定山藥黏液蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量

濃縮膠體積分?jǐn)?shù)為10%，分離膠體積分?jǐn)?shù)為3%[3]。通過已知蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量常用對(duì)數(shù)與相對(duì)遷移率（Rf） 繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)的分子則可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。Rf=蛋白質(zhì)的遷移距離/示蹤染料距離。蛋白質(zhì)的遷移距離是指從分離膠的起始位點(diǎn)到蛋白質(zhì)條帶的前沿[4-5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉淀劑種類對(duì)山藥中黏液蛋白得率的影響

料液比為1∶4，浸提溫度為42 ℃，沉淀劑采用甲醇、95%乙醇、異丙醇分別進(jìn)行提取。

沉淀劑種類對(duì)山藥中黏液蛋白得率的影響見圖1。

圖1 沉淀劑種類對(duì)山藥中黏液蛋白得率的影響

由圖1 可知，甲醇對(duì)山藥中黏液蛋白的提取率幾乎為零，95%乙醇的提取能力次之，異丙醇的提取能力最強(qiáng)。因此，選擇異丙醇為沉淀劑。

2.2 料液比對(duì)山藥中黏液蛋白得率的影響

沉淀劑采用異丙醇，浸提溫度為42 ℃，料液比采用3 個(gè)水平，分別為1∶2，1∶3，1∶4。

料液比對(duì)山藥黏液蛋白得率的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)山藥黏液蛋白得率的影響

由圖2 可知，料液比和山藥中黏液蛋白得率呈正相關(guān)，料液比越大，山藥中黏液蛋白得率越高。由此可見，最佳料液比為1∶4。

2.3 浸提溫度對(duì)山藥中黏液蛋白得率的影響

沉淀劑采用異丙醇，料液比為1∶4，浸提溫度分別采用42，45，48 ℃。

浸提溫度對(duì)山藥中黏液蛋白得率的影響見圖3。

圖3 浸提溫度對(duì)山藥中黏液蛋白得率的影響

隨著溫度的提高，山藥中黏液蛋白得率明顯下降。42 ℃和45 ℃下浸提出的山藥中黏液蛋白得率相差不大，而48 ℃下，山藥黏液蛋白得率下降非常明顯。因此，山藥的最佳浸提溫度為42 ℃。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

以沉淀劑種類、料液比和浸提溫度為因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，對(duì)山藥黏液蛋白得率造成影響的因素從大到小依次為（沉淀劑種類（A） ＞料液比（B） ＞浸提溫度（C），最佳組合為A3B2C2。因A3B2C2組合在正交設(shè)計(jì)表中未出現(xiàn)，因此需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，A3B2C2組合的黏液蛋白得率為3.00%，高于其他組合，因此確定山藥黏液蛋白的最佳提取條件為沉淀劑為異丙醇，料液比為1∶3，浸提溫度為45 ℃。

2.5 山藥黏液蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

SDS-PAGE 電泳圖見圖4，標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖5。

圖4 SDS-PAGE 電泳圖

圖5 標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

樣品2 為山藥黏液蛋白。由圖4 可知，用β - 巰基乙醇處理后的山藥的黏液蛋白分離出2 條條帶，分子量小的命名A 帶，分子量大的命名為B 帶。由圖4 可知，A 帶的Rf值為0.91。B 帶的Rf值為0.53。根據(jù)圖5，推算出A 帶的相對(duì)分子質(zhì)量為13.11 kD，B 帶的相對(duì)分子質(zhì)量為36.00 kD。

3 結(jié)論

鐵棍山藥黏液蛋白的最佳提取工藝如下：最合適的沉淀劑為異丙醇，最佳浸提溫度為42 ℃，最佳料液比為1∶4。采用SDS-PAGE 法分離出的山藥黏液蛋白中的A 帶的相對(duì)分子質(zhì)量為13.11 kD，B 帶的相對(duì)分子質(zhì)量為36.00 kD。根據(jù)SDS-PAGE 的結(jié)果，無法確定鐵棍山藥中的黏液蛋白為單一蛋白還是多種蛋白，所以仍需進(jìn)一步研究確定。

對(duì)山藥黏液蛋白提取工藝優(yōu)化后，黏液蛋白提取率可達(dá)3%，與其他試驗(yàn)的提取工藝相比，山藥黏液蛋白提取率增加了1%，黏液蛋白的提取率明顯提高[5]。水提醇沉法的缺點(diǎn)是容易殘留有機(jī)溶劑，存在著一定的安全風(fēng)險(xiǎn)，多用于試驗(yàn)[6]。若用于生產(chǎn)，還需對(duì)殘留的有機(jī)溶劑進(jìn)行去除。