酶分子設(shè)計(jì)常用策略和進(jìn)展

蘇紹玉,葉秀云,鄢仁祥

(1.福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,福州 350100;2.福建省科學(xué)技術(shù)信息研究所,福州 350300;3.福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350116;4.福建福大百特生物科技有限公司,福州 350100)

酶分子設(shè)計(jì)是以其分子結(jié)構(gòu)與功能規(guī)律作為基礎(chǔ),通過生物化學(xué)、分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)等手段,在基因和蛋白質(zhì)層面上對現(xiàn)有酶分子進(jìn)行改造優(yōu)化,制造和設(shè)計(jì)出改良的酶分子,以滿足工業(yè)生產(chǎn)、生活以及科研的需要。酶是生物體內(nèi)一種重要的分子,在細(xì)胞內(nèi)部行使著重要的生物學(xué)功能。例如,酶作為蛋白質(zhì)的一種重要類型,通常是一種具有高效催化效率和底物選擇特異性的天然生物催化劑。酶分子設(shè)計(jì)是在深入了解其空間結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能關(guān)系的基礎(chǔ)上,改造和設(shè)計(jì)酶以獲得具有特定物理和化學(xué)性質(zhì)的新分子。在漫長的分子進(jìn)化歷程中,自然界已經(jīng)進(jìn)化出種類多樣的酶,但天然酶一般只是在自然條件下才發(fā)揮出其良好的生物學(xué)功能。在實(shí)際生活中,酶以及相關(guān)制劑在造紙、釀酒、紡織以及皮革等相關(guān)工業(yè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。另外,酶制劑一般可以用可再生資源進(jìn)行生產(chǎn),最終又可以通過自然界的微生物進(jìn)行降解,具有綠色環(huán)保的特點(diǎn),在提倡可持續(xù)發(fā)展的今天有著非常重要的應(yīng)用意義。但在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中的高溫高壓以及非水相溶劑(例如,釀酒中用到的酶制劑在酒精以及高溫環(huán)境中)等非常溫環(huán)境下酶的穩(wěn)定性與催化活性一般會有所下降,甚至在一些情況下酶的活性可能會消失。因此,當(dāng)代酶工程的研究趨勢之一就是探尋耐高溫、耐酸堿、耐鹽等可以適應(yīng)工業(yè)需求的酶。根據(jù)實(shí)際需要,通常需要對蛋白質(zhì)以及酶進(jìn)行改造和優(yōu)化設(shè)計(jì),同時(shí)了解其發(fā)揮生物學(xué)功能所需要的生物環(huán)境,使其能夠在工業(yè)環(huán)境或者特定條件下仍然可以發(fā)揮甚至提高其生物學(xué)功能。在自然界中也存在一些可以適應(yīng)工業(yè)需求的酶,這些酶一般存在于嗜高溫、嗜酸堿以及高鹽的細(xì)菌中。

從工業(yè)應(yīng)用的角度來講,酶及其相關(guān)制劑的研發(fā)主要考慮兩個因素。一是酶制劑的分子特性參數(shù),包括耐熱性、耐酸堿性、非水溶劑穩(wěn)定性、抗氧化性、底物特異性、酶的催化活力效率以及酶表面活性劑的耐受性等;二是酶發(fā)酵水平的高低,即生產(chǎn)酶的工業(yè)成本的高低。本文主要討論酶的分子特性參數(shù)。從分子層面上來看,酶分子所具有的生物學(xué)功能有很大程度上是由其三維空間結(jié)構(gòu)以及其所處的溶劑環(huán)境條件共同決定的。因此,酶分子三維空間結(jié)構(gòu)構(gòu)象、生物學(xué)功能信息以及所處溶劑環(huán)境條件對準(zhǔn)確的酶分子設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)性的數(shù)據(jù)支撐。近年來,隨著X射線晶體衍射、冷凍電鏡以及核磁共振等實(shí)驗(yàn)技術(shù)快速和穩(wěn)定的發(fā)展,越來越多的包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的一系列復(fù)雜分子的三維結(jié)構(gòu)得到準(zhǔn)確解析,這些分子結(jié)構(gòu)一般可以通過在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org)中檢索獲得。另外,在AlphaFold數(shù)據(jù)庫(https：//www.alphafold.ebi.ac.uk)中也提供了大量預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[1]。近些年,也有報(bào)道使用AlphaFold和機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行分子對接的研究[2]。這些分子三維結(jié)構(gòu)對相應(yīng)的生物學(xué)機(jī)理解釋提供了更加精細(xì)的信息,這也進(jìn)一步促進(jìn)了理性藥物開發(fā)和蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的發(fā)展。在我們課題組前期的工作中,對幾種酶進(jìn)行了研究,包括漆酶[3-4]和幾丁質(zhì)酶[5-6]等,另外我們課題組也分別在兩個實(shí)例中對特定的酶進(jìn)行改造,提高了酶的催化活力[7],以及提高了酶的熱穩(wěn)定性[8]。國內(nèi)外都有不少分子設(shè)計(jì)相關(guān)的網(wǎng)站和工具可以使用,例如美國密歇根大學(xué)結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)課題提供的https：//zhanggroup.org/research/#ProteinDesign 網(wǎng)站上就有不少基于蛋白質(zhì)受體的分子設(shè)計(jì)工具。

從分子的角度來看,酶分子可以和多種分子相互作用,包括多肽、多糖、金屬離子以及小分子等,另外酶和其他蛋白質(zhì)之間也會相互作用。同時(shí),一部分的蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)重要的酶[9]。酶分子的催化作用一般具有專一性、高效性、以及作用條件較為溫和等特點(diǎn)。通常來講,依靠結(jié)構(gòu)信息的酶功能機(jī)理解釋,一般可以使用數(shù)學(xué)模型來描述酶分子結(jié)構(gòu)和其催化活性以及穩(wěn)定性之間的相關(guān)關(guān)系。這些數(shù)學(xué)模型的基本假設(shè)是酶分子結(jié)構(gòu)中包含了決定其物理、化學(xué)及生物學(xué)等方面性質(zhì)的大部分信息,而這些理化性質(zhì)則進(jìn)一步?jīng)Q定了酶分子的生物活性和穩(wěn)定性。簡而言之,酶分子結(jié)構(gòu)以及生物化學(xué)性質(zhì)與其生物活性也存在一定程度上的相關(guān)性。另外,溶劑環(huán)境對酶分子功能也有影響。因此,結(jié)構(gòu)和溶劑環(huán)境是構(gòu)成分析酶分子生物學(xué)功能模型的重要參數(shù)[10]。目前常見的結(jié)構(gòu)參數(shù)包括疏水性、電荷極性、幾何構(gòu)型(例如立體和拓?fù)湫畔⒌?、構(gòu)象表面特征以及理化性質(zhì)等?；诮Y(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)的原理,就是完成結(jié)構(gòu)特征的數(shù)字化或者特征特化,同時(shí)不斷優(yōu)化相應(yīng)的結(jié)構(gòu)特征,以提高酶分子催化活性和穩(wěn)定性。本文從酶分子三維結(jié)構(gòu)以及所處溶劑的視角對酶分子設(shè)計(jì)進(jìn)行系統(tǒng)性總結(jié)和討論。

1 酶分子設(shè)計(jì)簡介

通常來講,酶分子設(shè)計(jì)的目的是獲得特定需求的新酶分子,或者獲得比已有酶具有更優(yōu)良特性的新分子,或者設(shè)計(jì)出從基因?qū)哟紊细菀妆磉_(dá)的酶,或者探索可以展示出其最優(yōu)生化性能的溶劑環(huán)境條件[11]。溶劑環(huán)境對酶性能有影響,簡單來說酶的催化活力在非極性溶液和水性介質(zhì)溶液中有顯著差異,這是由于酶在非極性溶液環(huán)境中的介電常數(shù)較水介質(zhì)溶液中的介電常數(shù)低。在非極性溶液環(huán)境中兩個帶電荷基團(tuán)之間的靜電作用比在極性溶液環(huán)境中顯著增高。酶分子設(shè)計(jì)的原理就是讓其從一種狀態(tài)到另外一種狀態(tài)(例如,設(shè)計(jì)出更適合特定需求的狀態(tài))轉(zhuǎn)變的過程。在自然界中也存在這種酶分子在不同狀態(tài)之間根據(jù)不同溶液環(huán)境自動化轉(zhuǎn)變的過程,其中比較著名的例子之一是脂肪酶。脂肪酶隸屬于羧基酯水解酶類,能夠逐步地將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶一般存在于含有脂肪的動物、植物和微生物的組織中。同時(shí),脂肪酶也廣泛地應(yīng)用于藥品、食品生產(chǎn)以及生物化學(xué)產(chǎn)品等實(shí)際應(yīng)用方面[12]。

來源不同的脂肪酶,在氨基酸序列、組成以及結(jié)構(gòu)上存在一定的差異,但一般相同類型的脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)是比較相似的,即脂肪酶之間存在進(jìn)化層面上較強(qiáng)的弱同源性。脂肪酶的活性部位一般由絲氨酸(S)、天冬氨酸(D)、以及組氨酸(H)等氨基酸殘基組成。脂肪酶屬于絲氨酸蛋白酶類,這個主要由三個氨基酸組成的活性區(qū)域一般也稱為S-D-H三聯(lián)體催化部位。脂肪酶的催化部位一般包埋在分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部,結(jié)構(gòu)表面則被一小段特定的氨基酸殘基形成的螺旋蓋狀結(jié)構(gòu)覆蓋(此結(jié)構(gòu)又稱為脂肪酶活性口袋的“蓋子”),對三聯(lián)體催化部位起保護(hù)作用。脂肪酶活性影響的關(guān)鍵相關(guān)因素之一是活性口袋的開閉。通常認(rèn)為,酶分子處于活性口袋打開的狀態(tài)(即激活狀態(tài)Activation state)時(shí),才能更易于在與底物的碰撞過程中發(fā)生結(jié)合和反應(yīng)。在圖1中清晰地以三維結(jié)構(gòu)形式展示一種脂肪酶活性口袋的開閉狀態(tài)。從PDB[13]結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中下載了一種脂肪酶的兩種狀態(tài)結(jié)構(gòu),其PDB號分別為1DT3和1EIN[14]。在Pymol[15]軟件中對兩個酶結(jié)構(gòu)通過使用結(jié)構(gòu)比對命令進(jìn)行結(jié)構(gòu)重疊。其中,圖1a中紅色和黑色圓分別是這個酶激活和非激活狀態(tài)時(shí)活性口袋的大小。藍(lán)色和紅色箭頭分別表示結(jié)構(gòu)重疊的兩個結(jié)構(gòu)(見圖1a)分開后的兩個結(jié)構(gòu)(見圖1b,1c)。從圖1a中可以看到,1DT3為酶活性口袋未激活時(shí)的種狀態(tài),顏色主要渲染為紅色;1EIN為此酶活性口袋的打開狀態(tài),顏色主要渲染為綠色顯示。

圖1 脂肪酶活性口袋的開閉狀態(tài)Fig.1 Open and closing states of the lipase activity pocket

在這個脂肪酶中,活性結(jié)合位點(diǎn)為146位的絲氨酸(S146)、201位的天冬氨酸(D201)以及258位的組氨酸(H258)。這三個結(jié)合位點(diǎn)氨基酸殘基在圖1a中渲染為黃色。通過結(jié)構(gòu)重疊的結(jié)果,可以看到這個脂肪酶的開閉狀態(tài)主要差異在于一個二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主的區(qū)域(即脂肪酶活性口袋的蓋子,在圖1a中渲染為褐色),這個區(qū)域在這個酶中的位置為85到92的氨基酸片段“SIENWIGN”。當(dāng)脂肪酶結(jié)構(gòu)處于催化活性激活狀態(tài)時(shí),其活性口袋明顯比非活性狀態(tài)時(shí)更大(相應(yīng)活性口袋區(qū)域在圖1中標(biāo)注為黑色和紅色圈)。圖1b為脂肪酶打開活性口袋狀態(tài)時(shí)的脂肪酶表面圖,其中黃色區(qū)域?yàn)榛钚园被釟埢?。圖1c為脂肪酶活性口袋關(guān)閉狀態(tài)時(shí)的表面圖,雖然此時(shí)活性氨基酸也標(biāo)注為黃色但是因?yàn)槠浔话裨诮Y(jié)構(gòu)內(nèi)部所以無法觀測到。當(dāng)脂肪酶分子處于水溶液中時(shí),蓋子的疏水性氨基酸朝內(nèi),從而關(guān)閉活性口袋。而當(dāng)脂肪酶處于油水界面時(shí),疏水氨基酸會朝界面處油脂分子結(jié)合,從而打開了活性口袋,這個過程增強(qiáng)了底物和酶活性中心的催化活力。大多數(shù)脂肪酶在脂質(zhì)與水的界面上時(shí)會自動打開這個蓋子從而使脂肪酶的活性提高。當(dāng)脂肪酶處于非活化狀態(tài)時(shí),這個蓋子又可以自動關(guān)閉以保護(hù)活性部位。例如在純水介質(zhì)中,脂肪酶中蓋子主要是關(guān)閉的,而在疏水層的存在下(例如油脂界面處),蓋子會逐漸打開以激活催化活性。

與脂肪酶類似,自然界中的不少酶都存在這種活性口袋的開閉狀態(tài)。例如,胃蛋白酶也存在生物活性激活和非激活兩種狀態(tài)。從生物化學(xué)的角度來看,胃酸可以激活胃蛋白酶。同時(shí),胃蛋白酶非激活狀態(tài)結(jié)構(gòu)可以讓其貯存在其合成部位而沒有引起細(xì)胞或組織自我消化與水解的潛在危險(xiǎn),待細(xì)胞需要其功能時(shí)再進(jìn)一步被激活。從分子三維結(jié)構(gòu)的角度來看,胃蛋白酶原處于沒有活性狀態(tài)結(jié)構(gòu)時(shí)也主要是因?yàn)榛钚灾行奈幢┞冻鰜?。一般通過調(diào)整胃蛋白酶所處環(huán)境的pH值、以及對一些特定多肽鏈的剪切修飾等方法使酶的活性中心形成或暴露出來,進(jìn)而激活其酶活性。胰蛋白酶原也有類似的活化機(jī)制。另外還有其他類似例子,例如Liu等報(bào)道昆蟲中的一種酶可以在蛻皮液中被激活從而在特定時(shí)期發(fā)揮其生物學(xué)活性[16]。

一些酶在不同的溶劑環(huán)境中(例如油水界面、溶劑的酸堿性),其活性口袋區(qū)域可能處于關(guān)閉和打開的兩種重要的不同狀態(tài)。這個核心活性區(qū)域的關(guān)閉和激活打開現(xiàn)象也為酶分子設(shè)計(jì)提供了一些思路,在需要提高酶分子的活性時(shí)打開其活性區(qū)域或者在保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的同時(shí)盡量擴(kuò)張其活性空腔區(qū)域,并探索促進(jìn)酶分子打開和關(guān)閉其活性口袋的最優(yōu)溶劑環(huán)境。

2 酶分子設(shè)計(jì)工具之分子對接

分子對接是分子之間空間結(jié)構(gòu)與能量的雙重匹配過程。分子對接是酶分子設(shè)計(jì)中的重要方法之一。分子對接這一概念的歷史最早可以追溯到19世紀(jì)由 Fischer等學(xué)者提出的受體學(xué)說。受體學(xué)說認(rèn)為,其他分子會與酶分子即受體會發(fā)生類似鑰匙與鎖之間的識別關(guān)系,這種分子識別關(guān)系主要依賴兩者之間空間與能量的相互作用。通常情況下,可以與酶相互作用(即可對接)的分子包括小分子、金屬離子、多糖以及多肽等,以及蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間也可以對接。不同類型的分子與酶對接一般使用不同的對接力場體系,即使用不同的對接程序完成這個對接過程。小分子(包括多糖)和酶分子對接一般使用AutoDock Vina[17]。酶分子和其他蛋白質(zhì)大分子之間的對接一般使用Zdock[18]。多肽和酶分子對接一般使用Flexpepdock[19]。網(wǎng)絡(luò)上還有不少其他可以實(shí)現(xiàn)類似功能的程序和網(wǎng)站。不同的對接體系一般所使用的能量函數(shù)不同,在通常情況下不同能量函數(shù)之間不可混用。

分子對接在酶分子設(shè)計(jì)中主要用于衡量酶分子和底物(或者酶分子和其他分子)之間的可匹配性。分子對接一般是從兩個維度進(jìn)行,第一個維度是計(jì)算結(jié)合親和力的大小;第二個維度是計(jì)算分子復(fù)合物的結(jié)合模式構(gòu)象。一般而言,活力更好的酶與相應(yīng)底物的親和力更強(qiáng);另一方面,分子對接過程中,也可以分析活性通道中改變哪些氨基酸可以更好地減少底物對接過程中的空間位阻效應(yīng)?？臻g位阻效應(yīng)主要指底物進(jìn)入酶分子活性空腔過程中的空間阻礙作用。酶分子催化反應(yīng)中空間位阻效應(yīng)會降低其催化活性。通常來講,底物進(jìn)入受體活性通道中的空間位阻效應(yīng)越小,那么相應(yīng)酶分子的活性則越高。空間位阻效應(yīng)的原理是每個原子在分子中占有一定的空間。如果原子太接近了,相鄰的原子就會形成重疊的電子云表現(xiàn)為斥力。另外,對接結(jié)果中對酶分子-底物相互作用的關(guān)鍵氨基酸分析,也可以對設(shè)計(jì)更強(qiáng)親和力的酶分子提供一定的線索。一般可以設(shè)計(jì)不同的結(jié)構(gòu)突變體,之后不同的結(jié)構(gòu)突變體分別和底物進(jìn)行對接,通過對接的親和力分?jǐn)?shù)大小以及結(jié)構(gòu)構(gòu)象判斷突變是否比原始結(jié)構(gòu)更加優(yōu)良。

圖2為AutoDock Vina軟件的使用界面。學(xué)術(shù)界通常使用AutoDock Vina等一些開源軟件對酶分子和小分子進(jìn)行對接。在進(jìn)行分子對接前,酶分子的結(jié)構(gòu)文件格式需要進(jìn)行初始化,例如酶分子結(jié)構(gòu)文件一般需要經(jīng)過去水、加氫原子、加電荷等處理后存為pdbqt格式。類似地,小分子配體也需要經(jīng)過前處理并存儲為pdbqt格式。AutoDock Vina在分子對接過程中還需要指定一個對接區(qū)域盒子(Box),使盒子包括酶分子的活性口袋(見圖2),可以把一些與配體有相互作用的氨基酸殘基選擇出來作為設(shè)定box的參考。盒子的位置和大小一般通過指定盒子的中心位置(x,y,z)以及盒子的長寬高來確定的(見圖2)。酶活力直接相關(guān)的區(qū)域稱為酶的活性口袋或者活性中心。通常又將活性中心分為結(jié)合部位和催化部位。結(jié)合部位負(fù)責(zé)與底物結(jié)合,決定酶的專一性。催化部位負(fù)責(zé)底物鍵的斷裂和新鍵形成,決定酶的催化能力。酶的活性部位位于空腔之內(nèi),底物分子(或者一部分)結(jié)合到空腔內(nèi)并發(fā)生催化作用。空腔是疏水性較高的區(qū)域,非極性氨基酸多,但也含有極性氨基酸,以便與底物結(jié)合并發(fā)生催化反應(yīng)。其疏水性質(zhì)產(chǎn)生一個微環(huán)境,提高與底物的結(jié)合能力有利于催化?？涨坏幕钚晕稽c(diǎn)對于不需要輔酶的酶來說就是幾個氨基酸,而對于需要輔酶的酶來說輔酶或者輔酶的一部分也可能是活性部位的組成部分。酶與底物結(jié)合主要依靠氫鍵、鹽鍵、范德華力、疏水作用等作用力。酶的活性中心一般具有一定的柔性和可運(yùn)動性。

圖2 AutoDock Vina程序分子對接界面Fig.2 Molecular docking interface of AutoDock Vina program

圖3為酶分子1IEP(轉(zhuǎn)移酶的一種)[20]分別和小分子伊馬替尼(Imatinib)以及布洛芬(Ibuprofen)進(jìn)行分子對接的結(jié)果。伊馬替尼(圖3a上小分子)是全球首個獲得批準(zhǔn)的腫瘤發(fā)生相關(guān)信號傳導(dǎo)抑制劑。布洛芬(圖3b上小分子)也為酶的一種抑制劑,在生物體內(nèi)有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用?？梢酝ㄟ^對接結(jié)果來判斷兩個抑制劑對蛋白1IEP作用效果的差異。這里對復(fù)合物的模型的模擬是使用AutoDock Vina[21]軟件進(jìn)行分子對接得到的。在圖3a中,黃色小分子為伊馬替尼在對接前的初始結(jié)構(gòu),紅色小分子為對接后的結(jié)果。蛋白質(zhì)1IEP和布洛芬對接結(jié)果在圖3b中(圖3b中紅色為對接后的布洛芬),其親和力數(shù)值為-8.5 kcal/mol。而酶1IEP和伊馬替尼對接的親和力數(shù)值為-10.5 kcal/mol。從親和力的數(shù)值上來說,小分子伊馬替尼對酶1IEP相互作用更好一些。在這個實(shí)際例子中可以根據(jù)對接結(jié)果的能量來判斷蛋白質(zhì)和小分子相互作用的強(qiáng)弱。

圖3 使用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對接例子Fig.3 Examples of molecular docking using AutoDock Vina

圖4是以球形對酶分子的活性空腔進(jìn)行展示。此圖為使用Discovery Studio 2019(福州大學(xué)海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室購置的正版Discovery Studio軟件,https：//www.3ds.com)繪制而成。此酶分子的活性空腔區(qū)域可以用一個球狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表示。球狀結(jié)構(gòu)的酶活性口袋一般用(x,y,z,r)的一組4個數(shù)值組成的向量表示。其中坐標(biāo)(x,y,z)表示該球體的球心位置,以及r表示球體的半徑。

圖4 酶活性空腔的展示Fig.4 Demonstration of an enzyme active cavity

找到酶分子的空腔是分析其結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵步驟之一[22],一般通過把酶分子結(jié)構(gòu)以表面的形式顯示的方式尋找空腔[23]。在圖5中,使用Discovery Studio軟件畫出的酶分子1IEP的6種表面形式(表1詳細(xì)列出6種表面信息),包括疏水表面(見圖5a)、電荷表面(見圖5b)、氫鍵受體和供體表面(見圖5c)、溶劑可及性表面(見圖5d)、芳香環(huán)表面(見圖5e)以及離子化表面(見圖5f)。

分子對接不僅僅在酶分子設(shè)計(jì)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用,也常常用于一些蛋白質(zhì)功能的機(jī)理解釋。例如,生物殺蟲劑有效成分通常是一些化學(xué)小分子物質(zhì),那么實(shí)用的殺蟲劑就需要可以抑制蟲子中的一些受體分子(通常為蛋白質(zhì)),但是同時(shí)需要對人體內(nèi)相應(yīng)的受體分子的沒有抑制作用或者抑制作用相對弱一些。在這種情況下,可以對殺蟲劑的有效成分小分子與昆蟲以及人體內(nèi)相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分子對接,并進(jìn)行親和力和構(gòu)象分析。通常來講,設(shè)計(jì)良好的殺蟲劑小分子對昆蟲中相應(yīng)蛋白質(zhì)的親和力會更強(qiáng)一些。

表1 不同類型的蛋白質(zhì)表面Table 1 Different types of protein structural surfaces

圖5 蛋白質(zhì)不同表面形式Fig.5 Different types of protein surfaces

除了計(jì)算酶分子和底物結(jié)合親和力外,分子對接結(jié)果還可以用于詳細(xì)地分析活性區(qū)域以及相互作用關(guān)鍵氨基酸,這在酶分子設(shè)計(jì)中可以對關(guān)鍵氨基酸突變體設(shè)計(jì)提供一些設(shè)計(jì)思路。分子對接是研究底物和酶的重要手段之一。某個底物能夠激活生物酶、靶點(diǎn)、受體信號的傳遞,這些都可以通過分子對接方法進(jìn)行相應(yīng)的分析。

通常來講,分子對接是進(jìn)行酶分子設(shè)計(jì)的重要手段之一。但是,酶分子的實(shí)際應(yīng)用不是簡單的與配體分子結(jié)合完成的。通過生物實(shí)驗(yàn)的分離手段將蛋白質(zhì)分離后,其體外活性狀態(tài)和其在生物體里(細(xì)胞膜上或細(xì)胞液里)是不太一樣的。作為酶分子設(shè)計(jì),做完分子對接后不是結(jié)束,后面組織、動物的實(shí)驗(yàn)、或者工業(yè)實(shí)際應(yīng)用,這一系列的問題都需要研究通了。生物體各系統(tǒng)是相互連貫的,而且多系統(tǒng)平行。因此,基于分子對接的酶分子設(shè)計(jì)或者底物設(shè)計(jì)后續(xù)都要進(jìn)行詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3 酶分子設(shè)計(jì)工具之動力學(xué)模擬

酶分子設(shè)計(jì)中另外一個常用到的方法是分子動力學(xué)模擬(Molecular dynamics simulation)[24-25]。經(jīng)典分子動力學(xué)的模擬過程一般是從一個定義好的構(gòu)型開始,這個構(gòu)型可以是分子對接好的復(fù)合物也可以只是一個蛋白質(zhì)單體,之后使用牛頓運(yùn)動方程來計(jì)算蛋白質(zhì)原子的動態(tài)軌跡。對于酶分子體系中的每一原子,所受的合力根據(jù)其與其他粒子之間的相互作用來計(jì)算,這些相互作用通常以力場的形式進(jìn)行描述。分子力場有時(shí)也被稱為勢函數(shù)。一般分子力場勢函數(shù)包括以下幾個部分：描述分子內(nèi)成鍵作用的項(xiàng);鍵伸縮能：構(gòu)成分子的各個化學(xué)鍵在鍵軸方向上的伸縮運(yùn)動所引起的能量變化;鍵角彎曲能：鍵角變化引起的分子能量變化;二面角扭曲能：單鍵旋轉(zhuǎn)引起分子骨架扭曲所產(chǎn)生的能量變化;交叉能量項(xiàng)：上述作用之間耦合引起的能量變化。一個可靠的分子力場對準(zhǔn)確模擬出酶相應(yīng)的動態(tài)變化構(gòu)象具有關(guān)健性的作用。目前常用的分子力場是CHARMM和Amber等力場[26]。同時(shí),分子力是分子動力學(xué)模擬中的參數(shù)之一,分子力以粒子的質(zhì)量為加速度, 再加上粒子以前的位置和速度,這就決定了一小段時(shí)間步長之后粒子的新位置。目前常用的分子動力學(xué)模擬軟件包有Amber(http：//ambermd.org)和Gromacs(http：//www.gromacs.org)等。通常來講,長時(shí)間的分子動力學(xué)模擬(例如,10納秒以上的模擬過程)對理解酶生物學(xué)功能背后的原理以及酶分子設(shè)計(jì)非常有用。通常來講,模擬的時(shí)間長度越長,相應(yīng)的結(jié)果越可靠。近些年新版本Amber[27]軟件(例如版本21)通常通過CPU多線程以及GPU等技術(shù)來提高模擬的速度進(jìn)而縮短了分子模擬程序運(yùn)行時(shí)間。

在分子動力學(xué)模擬中也需要考慮酶分子所處的溶劑環(huán)境因素,這樣才能更準(zhǔn)確地模擬出相應(yīng)的動態(tài)結(jié)果?？茖W(xué)界已經(jīng)證實(shí)一些酶分子變性后在去除變性因素仍然可以恢復(fù)其之前的三維結(jié)構(gòu)。這表明酶分子的序列及其所處的溶劑環(huán)境也一定程度上決定其三維空間結(jié)構(gòu)。所以,在動力學(xué)模擬中,常常通過調(diào)整不同的參數(shù)(例如溶劑的pH值)以及不同的溶劑化環(huán)境(例如,水溶液、有機(jī)溶液或者水和有機(jī)溶劑的混合體系)的方式來獲得酶分子特定的動態(tài)三維結(jié)構(gòu)。酶在有機(jī)相中催化反應(yīng)過程有其特點(diǎn)：例如,疏水性底物或者產(chǎn)物的溶解度增加;可以一定程度抑制有水參與的副反應(yīng);酶一般不溶于有機(jī)容易易于回收;一定程度減少微生物污染等。因此,進(jìn)行動力學(xué)模擬時(shí),需要指明酶所處的溶劑環(huán)境。在溶劑環(huán)境和結(jié)構(gòu)確定的條件下,動力學(xué)模擬一般可以模擬出酶的動態(tài)結(jié)構(gòu)。

目前,經(jīng)典分子動力學(xué)模擬Amber網(wǎng)站[27]提供軟件的下載和使用教程。但可能由于動力學(xué)模擬需要的計(jì)算量較大等原因,Amber網(wǎng)站目前還沒有提供可以直接提交數(shù)據(jù)就計(jì)算的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器。在用Amber軟件過程中,進(jìn)行結(jié)合自由能計(jì)算與能量分解通常用MM-PBSA/GBSA方法。為了更深入地表示蛋白和氨基酸殘基之間的相互作用,一般研究工作中會用相互作用能量和氨基酸殘基數(shù)的一個關(guān)系圖表示,可以把每個殘基對結(jié)合能的貢獻(xiàn)算出來。從使用的角度來說,分子動力學(xué)模擬一般主要分為能量最小化(Minimization)、體系加熱(Heating)、平衡(Equilibrition)、數(shù)據(jù)采集(Production)以及結(jié)果分析等幾個主要步驟。同時(shí)要注意動力學(xué)模擬前需要進(jìn)行前體系溶劑化,并在體系中加抗衡離子等準(zhǔn)備步驟。分子動力學(xué)模擬常用的時(shí)間單位是皮秒(符號ps)以及納秒(符號ns)。經(jīng)過一定時(shí)間長度的模擬,通?？梢垣@得上千個甚至數(shù)量更多的酶結(jié)構(gòu)構(gòu)象。結(jié)果分子中,一般通過聚類算法把這些構(gòu)象進(jìn)行分類并篩選出具有代表性構(gòu)象以此來觀察酶的動態(tài)結(jié)構(gòu)[28]。

在生物體內(nèi)或者生物反應(yīng)體系中,每個酶分子結(jié)構(gòu)都不是靜止的,基本都像個小機(jī)器,有一定的構(gòu)象變化。但結(jié)構(gòu)生物學(xué)目前的晶體衍射實(shí)驗(yàn)手段通常只能獲得靜止的三維結(jié)構(gòu)圖片。NMR實(shí)驗(yàn)方法可以獲得一定范圍內(nèi)酶的動態(tài)結(jié)構(gòu)。為了揭示相應(yīng)分子機(jī)制,就要不斷獲得中間態(tài)的三維空間結(jié)構(gòu)照片,獲得的動態(tài)幀數(shù)越多則相應(yīng)機(jī)制解釋得越精準(zhǔn)。動力學(xué)模擬可以用于模擬酶催化過程中的構(gòu)象變化以及計(jì)算這個成果中的自由能變化,找出酶催化過程的關(guān)鍵氨基酸殘基。動力學(xué)模擬也可以用于模擬酶與不同底物的結(jié)合狀態(tài),以及探索可能的催化機(jī)理。因此,基于分子動力學(xué)模擬得到的分子動態(tài)結(jié)構(gòu)是分子設(shè)計(jì)的重要信息之一,成為現(xiàn)有NMR實(shí)驗(yàn)方法獲得酶動態(tài)結(jié)構(gòu)的一種重要補(bǔ)充方法。

4 小分子相關(guān)資源

從小分子數(shù)據(jù)庫PubChem[29]中(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)可以獲得各種小分子的結(jié)構(gòu)文件和相應(yīng)分子功能信息。另外,PDB(https：//www.rcsb.org)數(shù)據(jù)庫中存儲的雖然主要為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息,但是其中不少蛋白質(zhì)為復(fù)合物結(jié)構(gòu),在這些復(fù)合物結(jié)構(gòu)中也存在小分子結(jié)構(gòu),即也可以從PDB數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)的復(fù)合物中獲得小分子的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。PDB數(shù)據(jù)庫中同時(shí)存儲著蛋白的突變數(shù)據(jù),這些突變體的不同突變位點(diǎn)對應(yīng)著不同的性質(zhì),這些突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)為酶分子設(shè)計(jì)提供了重要參考信息?？梢杂眯蛄斜葘徒Y(jié)構(gòu)疊加等方法把這些位點(diǎn)對應(yīng)到目標(biāo)酶上,從而可以根據(jù)模板的突變位點(diǎn)和性質(zhì)信息系完成初步的酶分子設(shè)計(jì)和優(yōu)化。對于未知結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)的酶,可以使用一些預(yù)測工具,例如密歇根大學(xué)的結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室https：//zhanggroup.org網(wǎng)站,進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)的預(yù)測,這樣可以根據(jù)相應(yīng)的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行分析。

除了從PubChem和PDB等數(shù)據(jù)庫直接下載小分子外,小分子的結(jié)構(gòu)也可以采用ChemOffice[30]以及Discovery Studio等軟件進(jìn)行直接繪制得到,并可通過能量最小化等步驟優(yōu)化其三維結(jié)構(gòu)。特別是對一些比較新穎的小分子結(jié)構(gòu),一般從數(shù)據(jù)庫中難以直接獲得其三維結(jié)構(gòu)。這種情況下,通過繪圖軟件獲得小分子的三維結(jié)構(gòu)是可行的途徑之一。配體分子與受體酶分子之間相互作用關(guān)系通常分為激活、抑制、以及拮抗三種作用關(guān)系。激活作用主要是指配體提高了酶分子相應(yīng)的活性。與此相反,抑制作用是指配體抑制了酶分子的活性。受體拮抗劑,也叫阻斷劑,指能與受體結(jié)合,并能阻止激動劑產(chǎn)生效應(yīng)的一類配體物質(zhì)。拮抗作用系指兩種以上分子合并使用后,使激動劑作用反而減弱或消失,多數(shù)情況下有拮抗作用的分子不宜配對使用。

一般而言,直接通過分子對接和分子動力學(xué)的方式難以直接判斷小分子對酶分子是激活、抑制、以及拮抗三種作用中的哪一種。為了分析具體的相互作用類型,一般是通過實(shí)際的生物實(shí)驗(yàn)來判斷小分子和酶分子之間的作用關(guān)系。

5 酶分子設(shè)計(jì)常用策略

目前,學(xué)術(shù)界關(guān)于酶分子設(shè)計(jì)通常采用定點(diǎn)突變(Site-directed mutagenesis)的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)的主要兩個方向?yàn)樘岣呙阜肿拥拇呋钚砸约疤岣咂浞€(wěn)定性。在分子設(shè)計(jì)中,提高酶分子的催化活性和提高酶分子穩(wěn)定性一般采用兩種不同的策略。提高酶分子催化活性一般是以酶分子-底物的復(fù)合物(可以是實(shí)驗(yàn)解析的復(fù)合物構(gòu)象,也可以為分子對接的到的復(fù)合物結(jié)果)中距離底物3-5 ?距離范圍內(nèi)的酶分子氨基酸進(jìn)行突變,即在酶分子的活性口袋及其附近進(jìn)行位點(diǎn)突變;而提高酶分子穩(wěn)定性則一般選取遠(yuǎn)離酶分子活性中心區(qū)域的氨基酸進(jìn)行突變。有時(shí)會進(jìn)行多個位點(diǎn)協(xié)同突變,以期同時(shí)提高酶分子的活性和穩(wěn)定性。提高酶分子的穩(wěn)定性是讓其更好地適合工業(yè)應(yīng)用。雖然目前學(xué)術(shù)界已經(jīng)篩選出了數(shù)量眾多以及種類多樣的酶分子,但是在工業(yè)應(yīng)用的環(huán)境一般都是處于高溫高壓以及強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下,大多數(shù)酶分子在這種情況下可能會失活或者不太穩(wěn)定。因此,需要對酶分子進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造,使其在特定條件下仍然可以起到一定的生物學(xué)功能甚至可以提高其生物學(xué)功能。

表2中列出了用于酶分子設(shè)計(jì)不同目標(biāo)的策略。從生物物理學(xué)的角度來看,提高酶的熱穩(wěn)定性的分子設(shè)計(jì)策略一般是通過增加酶分子中化學(xué)鍵的數(shù)量,包括共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的數(shù)量來提高酶分子的熱穩(wěn)定性以及耐酸堿性等。構(gòu)成酶分子的原子間通過共用電子對作用形成的化學(xué)鍵為共價(jià)鍵,共價(jià)鍵一般包括肽鍵以及二硫鍵等。非共價(jià)鍵包括主要包括氫鍵、范德華力、鹽鍵、疏水作用力、芳環(huán)堆積作用、鹵鍵等。這些共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的化學(xué)鍵的數(shù)量增多一般有利于提高酶分子的穩(wěn)定性。另外,酶分子制劑也需要一定的穩(wěn)定性以方便儲存、運(yùn)輸以及在實(shí)際在復(fù)雜環(huán)境中使用。同時(shí),降低酶分子聚集性也是提高其穩(wěn)定性的一個方面。因此,提高穩(wěn)定性是酶分子設(shè)計(jì)中需要考慮的一個重要因素。

酶分子一般可以和許多功能類似的小分子分別對接。在這種情況下,可以分析這些小分子之間的共性,一般可以通過藥效團(tuán)(Pharmacophore)[31]的方式進(jìn)行的。藥效團(tuán)是特征化的小分子三維結(jié)構(gòu)要素的組合,可以分為兩種類型。一類是具有相同藥理作用的類似物,它們具有某種基本結(jié)構(gòu),即相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)部分,如磺胺類藥物、局麻藥、受體阻斷劑、擬腎上腺素藥物等;另一類是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同的分子,但它們以相同或類似的機(jī)理與同一受體鍵合,產(chǎn)生同樣或者類似的藥理作用,如己烯雌酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)比較簡單,但因其立體構(gòu)象與雌二醇相似,也具有雌激素樣作用。對藥效團(tuán)的分析可以找出底物和蛋白質(zhì)結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域,發(fā)現(xiàn)其中的規(guī)律,這為酶分子設(shè)計(jì)提供一定的線索。同時(shí),生物實(shí)驗(yàn)中一般通過易錯PCR的方法可以獲得酶分子的突變體并進(jìn)行篩選。易錯PCR一般通過調(diào)節(jié)體系中的Mg2+、Mn2+以及dNTP濃度來提高PCR過程中的突變率。在易錯PCR過程中,增加突變頻率可以通過在每一輪PCR反應(yīng)中使用低保真的DNA聚合酶,改變dNTP濃度(例如,使其中1種dNTP濃度高于其他3種),同時(shí)可以一定程度地提高二價(jià)陽離子Mg2+、Mn2+等在溶液中的濃度來達(dá)到。同時(shí),這是一個累計(jì)的過程,可以通過多輪的易錯PCR過程調(diào)節(jié)最終的突變率。另外,隨機(jī)突變也是酶分子設(shè)計(jì)的常用策略之一。

表2 用于酶分子設(shè)計(jì)的不同目標(biāo)Table 2 Different objects in enzyme molecular design

酶分子設(shè)計(jì)中常常也會考慮以增加二硫鍵(Disulfide bond)的方式來提高穩(wěn)定性。 二硫鍵是連接不同肽鏈或同一肽鏈中,兩個不同半胱氨酸殘基之間的化學(xué)鍵。二硫鍵是一種比較穩(wěn)定的共價(jià)鍵,在酶分子中主要起著穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用。一般而言,一個酶分子中二硫鍵數(shù)目越多,則酶分子對抗外界因素影響的穩(wěn)定性就愈大。在酶分子設(shè)計(jì)中,也常常以提高酶分子整體二硫鍵數(shù)量的方式來提高酶分子的穩(wěn)定性。一個區(qū)域打算設(shè)計(jì)為其他不同的二級結(jié)構(gòu),那么可以從容易形成特定二級結(jié)構(gòu)的氨基酸中選取。二級結(jié)構(gòu)是分子設(shè)計(jì)中的重要內(nèi)容。例如,1988年杜邦公司宣布,成功設(shè)計(jì)并合成了由四段反平行α-螺旋組成為蛋白質(zhì)。另外,酶分子相應(yīng)區(qū)域的親疏水性和酸堿性也是分子設(shè)計(jì)的考慮因素。在農(nóng)業(yè)科學(xué)的研究中,常常以開發(fā)酶或者蛋白質(zhì)抑制劑的方式來設(shè)計(jì)農(nóng)藥分子。因此,抑制劑的開發(fā)也是酶學(xué)研究中的內(nèi)容之一。凡是能降低酶促反應(yīng)速度的物質(zhì)統(tǒng)稱為抑制劑。表3中詳細(xì)列出了酶分子設(shè)計(jì)的常見策略。

表3 酶分子設(shè)計(jì)中常用策略Table 3 Common strategies used in enzyme molecular design

酶分子的聚合情況有時(shí)也是影響其功能的一個重要方面。一個酶分子的結(jié)構(gòu)域數(shù)量一般是以其一條鏈中所含結(jié)構(gòu)域的個數(shù)進(jìn)行確定的。一般而言,酶分子的結(jié)構(gòu)文件中有幾條鏈,那么這個酶分子就是幾聚體。例如,漆酶(Laccase)就有雙聚體和三聚體兩種類型[32]。酶分子為幾聚體的情況也可以做為分子設(shè)計(jì)的內(nèi)容之一。例如,陳等[33]就通過突變氨基酸阻止蛋白質(zhì)的二聚化來設(shè)計(jì)阻止腫瘤和炎癥發(fā)生的靶點(diǎn)。

酶分子設(shè)計(jì)的過程(見圖6),首先需要通過結(jié)構(gòu)預(yù)測算法(例如,I-TASSER[34])或者搜索數(shù)據(jù)庫(例如PDB和AlphaFold數(shù)據(jù)庫)等方法建立所研究對象的結(jié)構(gòu)模型,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能-應(yīng)用的關(guān)系研究,然后提出設(shè)計(jì)方案,通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后進(jìn)一步修正設(shè)計(jì),這往往需要幾次循環(huán)才能達(dá)到目的。一般的分子設(shè)計(jì)工作通?？梢园匆韵聨讉€主要步驟進(jìn)行：

1)通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)或者同源建模等方法構(gòu)建目標(biāo)酶分子的三維結(jié)構(gòu)模型;

2)找出對所要求的性質(zhì)有重要影響的位置和區(qū)域。提高酶催化活力一般是選取靠近活性口袋的氨基酸,而提高酶穩(wěn)定性一般選取遠(yuǎn)離活性口袋的氨基酸。提高酶穩(wěn)定性選取遠(yuǎn)離酶活位置一般是為了在提高酶穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上不影響酶的活性,同時(shí)二級結(jié)構(gòu)區(qū)域一般選擇為LOOP;

3)對上一步中所選出位點(diǎn)上改變殘基所得到的突變體,一方面使突變體酶分子產(chǎn)生具有所要求的性質(zhì),同時(shí)考慮殘基的體積、疏水性等性質(zhì)的變化所帶來的影響;

4)預(yù)測突變體的結(jié)構(gòu)。同時(shí)計(jì)算突變后的自由能的改變量ΔΔG=ΔG(天然)- ΔG(突變),從能量變化的角度來判斷突變體是否符合要求,其中ΔG為折疊態(tài)和伸展態(tài)之間的吉布斯自由能差;

5)定性或定量計(jì)算優(yōu)化所得到的突變體結(jié)構(gòu)是否具有所要求的性質(zhì)。

一般而言,能否成功地進(jìn)行酶分子設(shè)計(jì),除了要求有較為合理的設(shè)計(jì)方案外,一般還需要在研究過程中探索相應(yīng)酶所具有的結(jié)構(gòu)化學(xué)和物理化學(xué)參數(shù)等,最終設(shè)計(jì)出來的結(jié)構(gòu)是否符合需求需要通過實(shí)際生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖6 酶分子設(shè)計(jì)一般流程Fig.6 A general flowchart for enzyme design

6 酶分子設(shè)計(jì)經(jīng)典案例

表4中列出了酶分子設(shè)計(jì)相關(guān)的生物信息學(xué)軟件資源。這些軟件資源廣泛的應(yīng)用酶分子設(shè)計(jì)的研究中。近些年來國內(nèi)外不少課題組都研發(fā)一些經(jīng)典的酶分子設(shè)計(jì)案例。例如,Xia等通過比較三種酶結(jié)構(gòu)(嗜冷酶VPR、嗜中溫酶PRK和嗜熱酶AQN),并進(jìn)行了多副本分子動力學(xué)模擬[35]。然后進(jìn)行了連續(xù)靜電學(xué)計(jì)算和靜電表面勢的比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,靜電特性差異有助于三種酶對不同溫度的適應(yīng),從而為進(jìn)一步的酶工程、誘變以及分子設(shè)計(jì)研究提供了基礎(chǔ)[35]。在這個案例中,Xia等直接從PDB數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白質(zhì)晶體結(jié)果,之后使用GROMACS軟件進(jìn)行多副本的分子動力學(xué)模擬,這樣有助于較為準(zhǔn)確的模擬出酶催化過程的動態(tài)過程。同時(shí),作者采用VMD軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)圖形顯示和分析。在多種分子作用力的比較中,靜電作用為三種酶性質(zhì)差異的主要因素。

Tang等[36]通過改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)化B因子指標(biāo)以及二級結(jié)構(gòu)的LOOP方法來定位提高酶熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵區(qū)域,同時(shí)采用環(huán)嫁接策略提高枯草桿菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性。B因子指標(biāo)是晶體學(xué)中原子狀態(tài)的“模糊度”,其數(shù)值越大則相應(yīng)部分構(gòu)象就越不穩(wěn)定或者柔性越強(qiáng)。因此,酶結(jié)構(gòu)中B高因子區(qū)域的氨基酸突變后,酶穩(wěn)定性容易提高。在這個案例中,Tang等[37]采用Swiss-Model網(wǎng)站對目標(biāo)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模,并用Pymol軟件進(jìn)行B因子計(jì)算,之后采用Amber軟件進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。B因子法是這個工作中篩選突變區(qū)域的主要標(biāo)準(zhǔn)。篩選好相應(yīng)區(qū)域后,突變剛性更強(qiáng)的氨基酸殘基,作者通過這種增加了酶結(jié)構(gòu)總體的剛性的方式進(jìn)而提高了酶的熱穩(wěn)定性。

Lin課題組通過使用AutoDock軟件進(jìn)行分子對接以及Amber軟件進(jìn)行分子動力學(xué)模擬等方法,篩選出了谷氨酸突變?yōu)楸彼岬耐蛔儾呗?分別提高了兩種酶的催化活力[38-39]。Lin課題組主要采用定位酶活性口袋附近氨基酸的策略,對底物結(jié)合以及進(jìn)入活性口袋的過程進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)而進(jìn)行突變提高了酶活性。

Nikolaivits等[40]對多酚氧化酶進(jìn)行系統(tǒng)性研究,對酶活性位點(diǎn)附近幾個關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行突變,并最終篩選出其中一種有效突變體(G292N,即序列中292位的甘氨酸突變?yōu)樘於０?,這種突變體可以提高酶活。Lyu等[41]通過基因工程改造短乳桿菌提高谷氨酸脫羧酶的生產(chǎn)效率,和野生菌株相比,改造后的菌株生產(chǎn)效率有顯著提高。Nikolaivits和Lyu這兩個案例采用的策略和軟件和Lin課題組的方法類似。

表4 酶分子設(shè)計(jì)相關(guān)資源Table 4 Related resources for enzyme design

在以上這些例子中,分子對接、分子動力學(xué)模擬以及生物物理學(xué)等方法都可以綜合地應(yīng)用于酶分子設(shè)計(jì)中。另外,分子對接和分子動力學(xué)模擬除了可以用于篩選突變位點(diǎn)之外,也常常用于分子作用機(jī)理的解釋。分子設(shè)計(jì)方法不僅僅局限于本文所論述的這些策略,也可以考慮其他不同的方法。例如Patil等采用利用超聲波對微生物培養(yǎng)過程中形成的細(xì)胞束進(jìn)行疏松,促進(jìn)了菌體生長,產(chǎn)酶量提高以及提高了酶活[42-43]。但是使用超聲波對酶機(jī)構(gòu)的影響,目前還沒有明確的結(jié)論。另外,通過酶固定化的方法也是提高酶活力的方法之一[44]。例如,將酶固定在納米顆粒上可以減少酶解旋,通?？梢蕴岣呙阜€(wěn)定性和催化性能。酶經(jīng)過固定化處理后通常穩(wěn)定性可以提高。例如,Aslani等[45]通過固定化胰蛋白酶提高其活性和穩(wěn)定性。一些酶需要和金屬離子結(jié)合才能發(fā)揮其催化活性,例如漆酶是催化氧化反應(yīng)的一種多銅離子氧化酶,漆酶通常使用氧分子和銅離子來啟動催化過程。因此,在一些酶分子設(shè)計(jì)中可能還需要考慮金屬離子的相互作用。

目前,開展酶分子設(shè)計(jì)的研究一般需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證進(jìn)行,所以相應(yīng)的研究成果一般發(fā)表在實(shí)驗(yàn)類的雜志或者一些綜合類的雜志中,例如這里所討論的一些案例發(fā)表在Journal of Biological Chemistry、Enzyme and Microbial Technology以及Applied Biochemistry and Biotechnology等雜志上。

7 總 結(jié)

隨著學(xué)術(shù)界對酶分子理解不斷加深,酶分子設(shè)計(jì)逐漸成為國內(nèi)外不少課題組的研究內(nèi)容之一。酶分子設(shè)計(jì)是在深入了解其序列、結(jié)構(gòu)以及功能關(guān)系的基礎(chǔ)上進(jìn)行的一種理性設(shè)計(jì)和改造方案,甚至可以設(shè)計(jì)出自然界中還未存在的新結(jié)構(gòu)。酶的催化活性通常取決其活性口袋特點(diǎn),通常而言在酶總體結(jié)構(gòu)適合的范圍內(nèi)其活性口袋越大則酶活力可能越高。在合理范圍內(nèi),擴(kuò)大酶活性口袋通常有兩個方向,其一是設(shè)計(jì)更好的突變體;其二,改變酶所處的溶劑環(huán)境,不同的溶劑環(huán)境會導(dǎo)致酶活性口袋的打開或者關(guān)閉。

酶分子活性通常受其三維結(jié)構(gòu)構(gòu)象的顯著影響。因此,酶分子設(shè)計(jì)一般是在其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行的改造,這是一個系統(tǒng)性過程。酶分子是一個復(fù)雜的體系,不少酶分子具有多靶點(diǎn)、整體性等特點(diǎn)。酶分子行使其生物學(xué)功能過程中一般由多個部分協(xié)同發(fā)揮作用,重要和不重要部分只是相對而言的。同時(shí),也可以通過優(yōu)化酶分子所處的溶劑環(huán)境以及固定化等方法提高酶的穩(wěn)定性和催化活力和穩(wěn)定性。通過虛擬的氨基酸突變等技術(shù)設(shè)計(jì)更高催化活力、高穩(wěn)定以及選著性的酶是一種通用的方法。近些年生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展,使酶分子設(shè)計(jì)方法在國內(nèi)外不少課題組都有一些基于計(jì)算方法的成功案例。隨著PDB以及AlphaFold等數(shù)據(jù)庫提供的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)量越來越多,基于結(jié)構(gòu)的酶分子設(shè)計(jì)在未來將很可能會得到較為廣泛的應(yīng)用。

簡而言之,酶分子是一種重要的生物分子,目前酶分子設(shè)計(jì)的主要方向有提高熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、抗氧化性、提高酶的催化活力、提高催化底物專一性、耐非水溶劑環(huán)境以及減少副作用等。由于酶分子結(jié)構(gòu)、功能以及所處溶劑環(huán)境的復(fù)雜性,特定的酶需要進(jìn)行具體和詳細(xì)分析后才能更好地設(shè)計(jì)出新酶。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,酶分子在學(xué)術(shù)研究和工業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)有越來越廣泛的應(yīng)用。酶分子設(shè)計(jì)目的就是為蛋白質(zhì)工程提供設(shè)計(jì)方案,使酶及其制劑產(chǎn)品更好地為生活和工業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。因此,掌握酶和蛋白質(zhì)的相應(yīng)機(jī)理并進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)是科學(xué)研究與商業(yè)研發(fā)的一個重要方向。通常來講,酶分子設(shè)計(jì)是在其三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能-溶劑環(huán)境-應(yīng)用關(guān)系的研究。酶分子設(shè)計(jì)之后,一般通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后進(jìn)一步修正和優(yōu)化設(shè)計(jì)。