基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探析槲皮素對(duì)抑郁的作用機(jī)制

楊翼馳,劉 芳,聶家奇,馮倩倩,李小松,王素青

(1.武漢大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,武漢 430000;2.武漢大學(xué) 護(hù)理學(xué)院,武漢 430000)

抑郁是一種情緒障礙,以心理愉悅感消失、情緒低落超過2個(gè)星期、明顯軀體不適和功能缺陷為特征,臨床表現(xiàn)為失眠、意志減退、食欲異常、精神頹廢等,嚴(yán)重者有自殺傾向[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)表示,截至2017年,全球患有抑郁癥的人數(shù)約為3.22億,而2005—2015這十年間,抑郁癥的患病率提升了18.4%[2]。目前,臨床上大部分抗抑郁藥治療周期長(zhǎng),有嚴(yán)重的副反應(yīng),且費(fèi)用高昂,給抑郁癥患者及家庭造成了巨大的壓力[3]。因此,研究分子機(jī)制及靶點(diǎn),研制出安全且高效的藥物對(duì)抑郁癥的治療極為重要。

槲皮素(3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮)是一種普遍存在于人類膳食中的類黃酮物質(zhì)[4]。廣泛存在于桑樹、山茶花、菖蒲、辣木、金絲桃、蔥、苜蓿、刺槐、葡萄和銀杏葉中[5]。槲皮素具有許多生物活性,例如抗氧化劑、抗炎、神經(jīng)保護(hù)和腦保護(hù)等[6]。一項(xiàng)膳食類黃酮攝入量與認(rèn)知功能的隊(duì)列表明,較高的類黃酮膳食攝入量可能與成年個(gè)體更好的認(rèn)知健康有關(guān),并且在單個(gè)多酚中,只有槲皮素與認(rèn)知健康相關(guān)[7]。 FANG Ke等[8]發(fā)現(xiàn),槲皮素可以緩解大鼠腹膜內(nèi)注射脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的抑郁癥。Samad等[9]也證明,槲皮素可以防止壓力引起的焦慮和抑郁樣行為,并改善雄性小鼠的記憶力。但截至目前,槲皮素改善抑郁的具體作用機(jī)制并未得到充分解釋 。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門從系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)中衍生而來的新學(xué)科[10]。建立 成分、靶點(diǎn)、疾病間的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系是其常用方法,以研究藥物對(duì)機(jī)體的整體影響以及具體作用機(jī)制。本文擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù),探討槲皮素對(duì)抑郁的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供依據(jù),以期開發(fā)出新的藥物用于抑郁癥的治療。

1 資料與方法

1.1 藥物靶點(diǎn)的收集

在Pubchem (https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中收集槲皮素(Quercetin)名稱、結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息,下載其二維結(jié)構(gòu)并以SDF格式儲(chǔ)存。將該文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)平臺(tái)草圖繪制器,蛋白質(zhì)靶標(biāo)種類選擇“智人”,對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。SwissTargetPrediction平臺(tái)可以鑒定具有與查詢分子高度相似的已知配體的蛋白質(zhì),進(jìn)而預(yù)測(cè)分子的靶標(biāo)。進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí),3D 相似性值的閾值設(shè)置為 0.75,2D 相似性值的閾值設(shè)置為 0.45[11]。低于這些閾值,配體與查詢分子的相似性非常低,不顯示在結(jié)果中。接下來在Superpred(https：//prediction.charite.de/)數(shù)據(jù)庫中收集槲皮素的靶點(diǎn)。Superpred生物物種默認(rèn)為“智人”,置信度為大于等于0.7,采用邏輯回歸機(jī)器學(xué)習(xí)模型對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。將收集到的靶點(diǎn)置于同一Excel文檔中,進(jìn)行去重整合,校正為人源靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)收集

以“Depression”為關(guān)鍵詞,分別在OMIM(https：//omim.org)和Genecards(http：//Genecards. org)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲取抑郁疾病靶點(diǎn)信息。在OMIM中選擇具有已知序列的基因進(jìn)行搜索。在Genecards中,若靶點(diǎn)數(shù)目過多,則以大于等于“Relevance score”的2倍中位數(shù)為篩選條件。將靶點(diǎn)信息置于同一Excel文檔中,整合抑郁相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

通過Jvenn(http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html)對(duì)槲皮素和抑郁靶點(diǎn)求交集,獲得槲皮素-抑郁的共同靶點(diǎn),以CSV文件形式導(dǎo)出。將交集靶點(diǎn)文件上傳至STRING平臺(tái)(https：//cn.string-db.org/)進(jìn)行PPI構(gòu)建,蛋白質(zhì)類型設(shè)置為智人,置信度設(shè)置為中等(0.400)。再將該網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape3.9.1應(yīng)用軟件 ,并使用CytoHubba插件中的MCC算法篩選出度值排行前10的基因?yàn)閔ub基因。CytoHubba插件是基于應(yīng)用程序編程接口在Java中實(shí)現(xiàn)的。PPI網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)定義為v,度值定義為F(v)。MCC計(jì)算后的度值定義為MCC(v) = ∑C∈S(v)(|C| - 1)!,其中S(v)是包含v的最大集團(tuán)的集合,(|C|-1)!是所有小于|C|的正整數(shù)的乘積[12]。

1.4 GO和KEGG富集分析

在David平臺(tái)輸入槲皮素-抑郁的共同靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析,物種選擇“Homo sapiens”,最小基因數(shù)目為2,評(píng)分閾值<0.1。利用Excel軟件計(jì)算并篩選富集分析中校正后P<0.05的項(xiàng),并對(duì)GO 生物過程、GO 分子功能以及 GO 細(xì)胞成分分析的前15項(xiàng)進(jìn)行可視化展示。KEGG 通路按校正后P值大小排序,利用R軟件,以圖片形式對(duì)前15條通路進(jìn)行展示。

1.5 分子對(duì)接

在RCSB PDB(https：//www.rcsb.org)下載度值前五的蛋白分子對(duì)應(yīng)的復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu),刪除配體部分,去除水分子,利用Discovery Studio2019中Macromolecules/Prepare Protein/Clean Protein功能對(duì)蛋白分子進(jìn)行預(yù)處理。接著利用LibDock依次進(jìn)行分子對(duì)接,并需要LibDockScore以確定靶點(diǎn)蛋白與槲皮素之間的結(jié)合力,得分較高的組分被視為與槲皮素相互作用的活性組分。

2 結(jié)果

2.1 藥物及疾病靶點(diǎn)的收集

在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫收集到100個(gè)槲皮素靶點(diǎn),在Superpred數(shù)據(jù)庫收集到111個(gè)靶點(diǎn)。取并集后共獲得槲皮素人源靶點(diǎn)198個(gè)。在Genecards平臺(tái)共查詢到3 675個(gè)抑郁靶點(diǎn),在OMIM平臺(tái)共查詢到188個(gè)靶點(diǎn),去重合并后共獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)3 718個(gè)。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)以及核心靶點(diǎn)分析

Jvenn中共獲得103個(gè)槲皮素-抑郁共同靶點(diǎn),用韋恩圖表示(見圖1)。利用STRING平臺(tái)繪制槲皮素和抑郁交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,包括103個(gè)節(jié)點(diǎn),536條邊。將其結(jié)果信息上傳至Cytoscape3.9.1軟件進(jìn)行簡(jiǎn)化(見圖2)。經(jīng)MCC算法計(jì)算后,度值排名前10的hub基因依次為：SRC、MTOR、EGFR、AKT1、PTK2、CXCR4、KDR、IGF-1R、PIK3R1、PTPN11。依據(jù)MCC分?jǐn)?shù)對(duì)hub基因進(jìn)行可視化(見圖3),顏色由紅轉(zhuǎn)黃,MCC得分越高,其基因顏色越趨近于紅色。

圖1 槲皮素靶點(diǎn)與抑郁靶點(diǎn)的Venny圖Fig.1 Venny diagram of quercetin targets and depression targets

圖2 槲皮素和抑郁共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of common targets of quercetin and depression

2.3 GO與KEGG通路分析

應(yīng)用David平臺(tái)進(jìn)行GO、KEGG富集分析。GO是基因本體(Gene ontology)的簡(jiǎn)稱,用于注釋與其相關(guān)的生物功能、通路、以及其他的基因產(chǎn)品。經(jīng)校正后P<0.05 的富集條目篩選,獲得了162條GO富集分析結(jié)果,其中包含88項(xiàng)生物過程條目,40項(xiàng)細(xì)胞成分條目,34項(xiàng)分子功能條目。圖4展示了各部分校正后P值最高的15條通路。各個(gè)部分顏色不同。橫向坐標(biāo)代表校正后的P值,校正后P值越高,說明基因在通路富集程度越大。其中,最具有代表性的是生物進(jìn)程條目,涉及凋亡過程的負(fù)向調(diào)節(jié)(Negative regulation of apoptotic process)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)和蛋白質(zhì)磷酸化(Protein phosphorylation)等生物學(xué)過程。

圖3 排名前10的hub基因Fig.3 Top 10 hub genes

圖4 槲皮素作用靶點(diǎn)的GO富集分析Fig4 GO enrichment analysis of quercetin targets

經(jīng)校正P<0.05篩選后,共得到107條KEGG信號(hào)通路結(jié)果。校正后P值排名前15的通路結(jié)果如圖5所示,主要有：缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、ErbB信號(hào)通路(ErbB signaling pathway)、磷脂酶D信號(hào)通路(Phospholipase D signaling pathway)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路(Neurotrophin signaling pathway)等。橫軸表示Gene ratio ,表示 KEGG通路中所含的基因數(shù)目占所有基因的百分比;縱坐標(biāo)表示路徑名稱;氣泡大小代表著富集的基因數(shù)目;縱軸展示通路名稱;氣泡尺寸表示富集基因的數(shù)量,其大小與富集基因數(shù)呈整正相關(guān);以不同色彩代表P值,氣泡顏色隨P值依次漸變。其中,ErbB信號(hào)通路高度值hub基因富集程度最高,可能是最重要的信號(hào)通路(見圖6)。

圖5 槲皮素作用靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis of quercetintargets Molecular docking results

2.4 分子對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接結(jié)果顯示(見圖7),槲皮素與SRC 、MTOR、EGFR、AKT1、PTK2 分子對(duì)接LibDockSccore值依次為 95.718 8、97.583 3、77.993 5、114.16、93.314 5,對(duì)接評(píng)分均較高,說明槲皮素與這些靶標(biāo)具有良好的結(jié)合能力。

3 討 論

本研究的主要目的是探析槲皮素治療抑郁的潛在機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明,SRC、AKT1和mTOR可能是槲皮素改善抑郁癥的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。以往研究表明,LPS注射可導(dǎo)致小鼠神經(jīng)炎癥和抑郁樣行為。LPS注射組小鼠腦組織中SRC-1表達(dá)降低,提示SRC-1在炎癥和抑郁中的作用[13]。 pCREB影響海馬突觸可塑性和空間記憶功能,它的表達(dá)減少與阿爾茨海默癥的學(xué)習(xí)和記憶受損有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中,SRC-1敲低顯著降低了pCREB表達(dá)水平[14]。神經(jīng)炎癥可以誘導(dǎo)神經(jīng)元再生,使神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子釋放減少,導(dǎo)致神經(jīng)活動(dòng)失調(diào),并有助于抑郁癥的發(fā)展[15]。有研究證實(shí),PI3K / Akt通路的激活誘導(dǎo)NF-κB的磷酸化,這導(dǎo)致大腦區(qū)域的神經(jīng)炎癥,并有助于嚙齒動(dòng)物抑郁樣行為的發(fā)展[16]。PI3K / Akt / NF-κB通路也能在新生兒母體剝奪和慢性輕度應(yīng)激的抑郁模型中被激活[17]。mTOR作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶[18],可通過p70S6激酶的磷酸化和哺乳動(dòng)物eIF4E結(jié)合蛋白(4EBP)的抑制來調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生、樹突狀脊柱生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)翻譯啟動(dòng),從而合成神經(jīng)元突觸所需的蛋白質(zhì)[18-19]。這與目前抗抑郁藥的作用機(jī)制一致,即通過促使神經(jīng)突觸再生,從而達(dá)到抗抑郁的目的。這些發(fā)現(xiàn)與我們的結(jié)果一致。因此我們推測(cè)槲皮素可能通過作用于SRC、AKT1和mTOR產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)。

圖6 ErbB信號(hào)通路圖Fig 6 ErbB signaling pathway map

圖7 分子對(duì)接結(jié)果Fig 7 Molecular docking results

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,槲皮素治療抑郁可能與 HIF-1信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等多條通路密切相關(guān)。HIF-1是一種由α、β兩種亞基構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子,能對(duì)缺氧作出反應(yīng)。已有研究表明,HIF-1通路激活的顯著增加導(dǎo)致腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的持續(xù)表達(dá)[20]。BDNF廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),在海馬、皮質(zhì)中大量表達(dá),并參與神經(jīng)元功能的維持、發(fā)育以及神經(jīng)元受損后的修復(fù),從而產(chǎn)生抗抑郁藥樣效應(yīng)[21]。以上結(jié)果提示激活HIF-1信號(hào)傳導(dǎo)可在槲皮素治療抑郁中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)調(diào)節(jié)素-1(NRG1)是精神分裂癥,雙相情感障礙等多種精神疾病的易感基因,對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、耳蝸感覺神經(jīng)元和PC12細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用[22]。NRG1相關(guān)通路的異常改變與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)。Bi等人發(fā)現(xiàn),阻斷NRG1-ErbB4信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)了焦慮樣行為[23]。NRG/ErbB信號(hào)傳導(dǎo)改變后,轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)異常行為以及學(xué)習(xí)記憶缺陷。因此,綜合既往文獻(xiàn)及本研究結(jié)果,推測(cè)槲皮素可能通過調(diào)控HIF-1、NRG/ErbB等多條信號(hào)通路來維持神經(jīng)元功能和發(fā)育,從而發(fā)產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)。

目前已有研究?jī)H說明槲皮素可改善抑郁樣行為,并未對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行研究。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,發(fā)現(xiàn)了槲皮素治療抑郁的潛在靶點(diǎn)及通路,為設(shè)計(jì)和開發(fā)新的有效抗抑郁藥物奠定基礎(chǔ)。但本研究也存在一定局限性。首先,研究所使用的數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)覆蓋范圍有限,不包含未經(jīng)證實(shí)和未記錄的化合物或靶標(biāo)。其次,分子對(duì)接本質(zhì)上屬于計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)技術(shù),無法完全代替動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。因此,研究結(jié)果需在動(dòng)物模型中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法為指導(dǎo),利用分子對(duì)接技術(shù),對(duì)槲皮素-抑郁的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)抑郁的作用主要涉及SRC、AKT1、mTOR等靶點(diǎn),HIF-1、NRG/ErbB等信號(hào)通路,提示槲皮素的抗抑郁機(jī)制可能是促進(jìn)神經(jīng)突觸再生、改善腦腸軸功能以維持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能。