家族性雙側(cè)大結(jié)節(jié)性腎上腺增生癥生物標(biāo)志物的生信分析

湯 鑫,朱 焱*,沈 毅,司曉云,何萬婭,聶 穎

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與健康學(xué)院,貴陽550025;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科,貴陽 550004)

庫欣綜合征(Cushing’s syndrome, CS)是由于長期暴露于升高的內(nèi)源性皮質(zhì)醇所致的一種臨床綜合征[1],且長期的糖皮質(zhì)激素過量會(huì)導(dǎo)致許多合并癥,損害生活質(zhì)量并增加死亡率[2]。CS主要分為促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotrophic hormone,ACTH)依賴性和非依賴性兩大類,前者發(fā)生的主要原因是由垂體腺瘤(庫欣病)或異位ACTH依賴性綜合征,如小細(xì)胞肺癌、胸腺類癌等分泌過量的ACTH,刺激雙側(cè)腎上腺增生并分泌過量的皮質(zhì)醇所致;后者是由于腎上腺皮質(zhì)腺瘤、腺癌或結(jié)節(jié)性增生自主性地分泌過量皮質(zhì)醇所致[3]。雙側(cè)大結(jié)節(jié)性腎上腺皮質(zhì)增生癥(Bilateral macronodular adrenal hyperplasia,BMAH)或ACTH 非依賴性大結(jié)節(jié)性腎上腺皮質(zhì)增生癥(ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia,AIMAH)由Kirschner等于1964年首次描述[4],是一種罕見的臨床疾病,其特征是雙側(cè)腎上腺皮質(zhì)中存在多個(gè)良性結(jié)節(jié)[5]。據(jù)報(bào)道,BMAH約占中國庫欣綜合征患者所有內(nèi)源性病因的6.2%[6],其病因仍不明確, 既往認(rèn)為其是由ACTH依賴性逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)锳CTH非依賴性,但近年的研究表明其可由ACTH以外因素, 如精氨酸加壓素(Arginine vasopressin,AVP)、抑胃肽(Gastric inhibitory peptide,GIP)、兒茶酚胺(Catecholamines,CA)等受體的異常表達(dá)引起,最終使得腎上腺細(xì)胞增生[7]。由于BMAH發(fā)展緩慢,皮質(zhì)醇增多癥和臨床CS隱匿發(fā)展,導(dǎo)致亞臨床庫欣綜合征的比例很高[8],CS本身的隱匿發(fā)作也可能導(dǎo)致診斷延遲。此外,BMAH與遺傳有著密切的聯(lián)系[9],對(duì)家族性形式和疾病雙側(cè)特征的描述表明,這些疾病是遺傳決定的,這已在近70%的原發(fā)性色素微結(jié)節(jié)性腎上腺和25%的原發(fā)性雙側(cè)大結(jié)節(jié)性腎上腺皮質(zhì)增生癥病例中得到證實(shí)[10],受影響患者的相關(guān)家庭成員有發(fā)生BMAH的風(fēng)險(xiǎn)。BMAH患者在診斷前有長期暴露于皮質(zhì)醇過量的有害組織分解代謝作用的風(fēng)險(xiǎn),臨床上迫切需要早期的診斷和治療,然而目前該疾病缺乏可靠的診斷和治療生物標(biāo)志物。因此本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析,探索家族性雙側(cè)大結(jié)節(jié)性腎上腺皮質(zhì)增生癥的潛在生物標(biāo)志物,為該疾病的臨床診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與處理

從GEO數(shù)據(jù)庫 (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載了Gagliardi L等上傳的關(guān)于家族性的BMAH的微陣列表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE171558和Almeida MQ等上傳的關(guān)于AIMAH的表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE25031。GSE171558數(shù)據(jù)集基于GPL6244 Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array平臺(tái)進(jìn)行分析,作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集。它包含8個(gè)樣本,包括三個(gè)受家族影響的6個(gè)樣本和2個(gè)正常對(duì)照。GSE25031數(shù)據(jù)集基于GPL6255 Illumina humanRef-8 v2.0 expression beadchip平臺(tái)進(jìn)行分析,作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集。它包括7個(gè)樣本和3個(gè)正常組織。兩個(gè)數(shù)據(jù)集在上傳時(shí)已對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。除此之外,本研究去除了不匹配基因符號(hào)和重復(fù)基因符號(hào)的探針。本研究的數(shù)據(jù)可從GEO數(shù)據(jù)庫免費(fèi)下載,因此不需要患者的倫理批準(zhǔn)和知情同意。

1.2 差異表達(dá)基因(DEGs)的鑒定

基于DEGs的納入標(biāo)準(zhǔn)P<0.05和log2|FC|>1,通過R軟件中的“l(fā)imma”[11]包來識(shí)別數(shù)據(jù)集GSE171558的差異表達(dá)基因。本研究提供了DEGs的火山圖和熱圖?；鹕綀D和熱圖通過微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn)繪制,這是一個(gè)免費(fèi)的在線數(shù)據(jù)分析和可視化平臺(tái)。

1.3 DEGs的功能富集分析

使用DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對(duì)DEGs進(jìn)行富集分析。該分析包括基因本體論(Gene ontology,GO)術(shù)語,即生物過程(Biological process,BP)、細(xì)胞成分(Cellular component,CC)和分子功能(Molecular function,MF),主要用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能[12]和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)途徑,主要用于構(gòu)建分子相互作用、反應(yīng)和關(guān)系網(wǎng)絡(luò)[13]。選擇P<0.05 和富集基因計(jì)數(shù) ≥ 5作為統(tǒng)計(jì)顯著性的標(biāo)準(zhǔn),并進(jìn)行可視化。如果詞條超過十個(gè),則選擇前十個(gè)富集基因計(jì)數(shù)較多的詞條可視化。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

使用在線數(shù)據(jù)庫STRING(https：//string-db.org/)進(jìn)行了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)分析,以評(píng)估 DEGs 的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。將 DEGs映射到 PPI 網(wǎng)絡(luò)上,并設(shè)置交互得分>0.9作為閾值。此外,使用Cytoscape v3.9.1軟件中的插件cytoHubba分別通過三種算法(MCC、MNC和Degree)篩選出高度值最高的前10個(gè)基因,并通過維恩圖可視化三種算法共同的關(guān)鍵基因。維恩圖是使用Venny 2.1 ( Venny (csic.es)) 繪制的。

1.5 數(shù)據(jù)集驗(yàn)證hub基因

數(shù)據(jù)集 GSE25031包含7個(gè)樣本和3個(gè)健康樣本,作為驗(yàn)證集以驗(yàn)證hub基因的表達(dá)。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因作為關(guān)鍵的生物標(biāo)志物,對(duì)BMAH的診斷和治療具有重要價(jià)值。

1.6 基因集富集分析(GSEA)

根據(jù)hub基因表達(dá)的中位數(shù),將BMAH樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,將處理后的差異倍數(shù)值進(jìn)行從大到小排序, 用來表示基因在兩組間的表達(dá)量變化趨勢(shì),以更準(zhǔn)確地確定每個(gè)關(guān)鍵生物標(biāo)志物的功能。

1.7 TF-miRNA共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)-化合物相互作用

NetworkAnalyst[14](https：//www.networkanalyst.ca/)用于構(gòu)建關(guān)鍵生物標(biāo)志物的 TF-miRNA共調(diào)控網(wǎng)絡(luò),調(diào)控相互作用信息是從RegNetwork存儲(chǔ)庫中收集的,并識(shí)別與關(guān)鍵生物標(biāo)志物相互作用的化合物。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs的識(shí)別

基于DEGs∣log2FC|>1,P<0.05的納入標(biāo)準(zhǔn),數(shù)據(jù)集GSE171558共鑒定出336個(gè)DEGs,其中上調(diào)基因147個(gè),下調(diào)基因189個(gè)。火山圖和熱圖展示了DEGs的結(jié)果(見圖1)。

圖1 差異表達(dá)基因結(jié)果Fig.1 Results of differentially expressed genes

2.2 DEGs的功能和通路富集

使用在線工具 DAVID 6.8對(duì)選取的336個(gè)基因基于P< 0.05和富集基因計(jì)數(shù)≥5的納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析,研究與BMAH相關(guān)的生物學(xué)功能。富集分析結(jié)果如圖2所示。GO富集分析(見圖2a)結(jié)果中,生物過程(BP)分析表明,這些基因與細(xì)胞粘附過程、細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)過程、RNA加工過程、多細(xì)胞生物發(fā)育過程、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)過程、軸突引導(dǎo)等過程有關(guān)。細(xì)胞成分(CC)與質(zhì)膜、膜的組成部分、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外外泌體、細(xì)胞表面、神經(jīng)元細(xì)胞體、軸突等密切相關(guān),而分子功能(MF)分析則展示了與鈣離子結(jié)合、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合、鈣調(diào)素結(jié)合、ATP結(jié)合、碳水化合物結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性的相關(guān)性。KEGG富集分析(見圖2b)顯示鈣信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、擴(kuò)張型心肌病、cAMP信號(hào)通路、肥厚型心肌病、醛固酮合成和分泌、cGMP-PKG信號(hào)通路、ECM-受體相互作用、胰腺分泌物等富集明顯。

圖2 GO和KEGG富集分析結(jié)果(p<0.05)Fig.2 Results of GO and KEGG enrichment analysis (p<0.05)

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)STRING在線數(shù)據(jù)庫,基于網(wǎng)絡(luò)的交互得分> 0.9,得到一個(gè)有297個(gè)節(jié)點(diǎn)和73條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。通過Cytoscape中的Cytohubba插件,采用MCC(見圖4a)、MNC(見圖4b)和Degree(見圖4c)三種算法分別篩選出前10個(gè)基因,并取交集(見圖4d),得到五個(gè)共同的關(guān)鍵基因,即三個(gè)上調(diào)基因多功能蛋白聚糖(Versican,VCAN)、小核糖核蛋白多肽E(Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide E,SNRPE)、LSM3(LSM3同源物,U6小核RNA和mRNA降解相關(guān))和兩個(gè)下調(diào)基因雙糖鏈蛋白聚糖(Biglycan,BGN)、蛋白磷酸酶2支架亞基Aalpha(Protein phosphatase 2 scaffold subunit Aalpha,PPP2R1A),視為BMAH的關(guān)鍵基因。

圖4 cytoHubba插件中三種拓?fù)浞治龇椒êY選出的關(guān)鍵基因Fig.4 Key genes screened by three topological analysis methods in the cytoHubba plugin

2.4 驗(yàn)證hub基因

在GSE25031數(shù)據(jù)集中獲得關(guān)鍵基因在腎上腺結(jié)節(jié)與正常腎上腺組織中的表達(dá)量,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示SNRPE、PPP2R1A和LSM3在疾病與正常組中的表達(dá)量均無顯著差異(p>0.05)。而VCAN和BGN在BMAH和對(duì)照組中表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),可以認(rèn)為與正常組相比,VCAN在BMAH中表達(dá)顯著升高,BGN在BMAH中表達(dá)顯著降低,故以VCAN和BGN作為BMAH的關(guān)鍵生物標(biāo)志物(見圖5)。

圖5 關(guān)鍵基因的驗(yàn)證Fig.5 Validation of key genes

2.5 基因集富集分析(GSEA)

對(duì)VCAN和BGN做進(jìn)一步分析以更準(zhǔn)確的了解其功能。GSEA結(jié)果顯示,VCAN主要參與丁酸代謝、ECM-受體相互作用、半乳糖代謝、蛋白質(zhì)消化吸收、類固醇生物合成、異體移植排斥、哮喘、移植物抗宿主病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、I型糖尿病(見圖6a)。BGN與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白質(zhì)消化吸收、核糖體、剪接體、各種類型的N-聚糖生物合成、集合管酸分泌、皮質(zhì)醇的合成和分泌、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、類固醇生物合成、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路密切相關(guān)(見圖6b)。

2.6 TF-miRNA共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)-化合物相互作用

TF-miRNA共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示了VCAN和BGN與TF基因和miRNA的相互作用(見圖7)。VCAN有16個(gè)TF基因和26個(gè)miRNA調(diào)控,BGN受SMAD4 TF基因和 has-miR-647 miRNA的共同調(diào)控。 此外,我們發(fā)現(xiàn)有16個(gè)化合物是這兩個(gè)關(guān)鍵生物標(biāo)志物相互作用的共同化合物(見圖 8,表1)。 由于這些化合物是針對(duì)這兩個(gè)關(guān)鍵生物標(biāo)志物檢測(cè)到的,因此它們與BMAH的發(fā)生和發(fā)展有重要聯(lián)系。

3 討 論

本研究共鑒定了336個(gè)DEGs,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探索家族性BMAH的分子生物學(xué)功能和途徑,以找到影響B(tài)MAH發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物。GO富集分析表明大部分DEGs主要與細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、RNA加工過程、多細(xì)胞生物發(fā)育過程、細(xì)胞遷移過程、軸突引導(dǎo)等生物過程有關(guān)。因此做出推測(cè),即這些基因可能通過這些過程在家族性BMAH中發(fā)揮關(guān)鍵作用。之前的研究表明,細(xì)胞增殖以及與細(xì)胞粘附相關(guān)的其他體細(xì)胞遺傳事件也發(fā)生在各種結(jié)節(jié)中[15-16]。另一方面,本研究發(fā)現(xiàn)這336個(gè)靶基因大部分富集在鈣信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病、cAMP信號(hào)通路、醛固酮合成和分泌、cGMP-PKG信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路中。最近有研究表明環(huán)磷酸腺苷單磷酸蛋白(cAMP)激酶A信號(hào)傳導(dǎo),被發(fā)現(xiàn)在庫欣綜合征的良性腎上腺皮質(zhì)腫瘤或增生的發(fā)展中起主要作用[17-18],而且改變細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)與良性醛固酮產(chǎn)生腫瘤或增生的發(fā)展也有關(guān)[19]。然而,在雙側(cè)腎上腺皮質(zhì)增生患者中,雙側(cè)腎上腺切除術(shù)可誘發(fā)明確的腎上腺皮質(zhì)功能不全,有研究發(fā)現(xiàn)腎上腺功能不全也會(huì)使患者因心血管疾病和感染而增加發(fā)病率和死亡率[20-21]。也有研究表明接受腎上腺切除術(shù)的亞臨床 CS 患者改善了心血管危險(xiǎn)因素,尤其是高血壓和糖尿病[22]。此外,特發(fā)性雙側(cè)腎上腺皮質(zhì)增生是原發(fā)性醛固酮增多癥的最常見原因[23],可見醛固酮合成和分泌與家族性BMAH也存在密切聯(lián)系。另外,PI3K-Akt 信號(hào)通路和cGMP-PKG信號(hào)通路目前沒有相關(guān)研究表明其與BMAH的發(fā)生有關(guān),因此需要做進(jìn)一步研究,這可能是一種新的臨床機(jī)制。

圖7 TF-miRNA相互作用的網(wǎng)絡(luò)Fig.7 network of TF-miRNAs interactions

圖8 NetworkAnalyst的蛋白質(zhì)-化學(xué)相互作用Fig.8 Protein-chemical Interactions by NetworkAnalyst

此外,對(duì)DEGs進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)分析,確定了5個(gè)hub基因(VCAN、SNRPE、BGN、PPP2R1A和LSM3),并經(jīng)GSE25031數(shù)據(jù)集驗(yàn)證,最終將基因表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的VCAN和BGN視為家族性BMAH的潛在生物標(biāo)志物,有研究也使用了與本文相同的數(shù)據(jù)集,因此本研究的結(jié)果具有一定的可靠性[24]。多功能蛋白聚糖(Versican,VCAN)是一種大型聚集的硫酸軟骨素蛋白多糖,屬于聚集蛋白聚糖/versican蛋白多糖家族,是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分[25],參與細(xì)胞粘附、增殖、遷移、血管生成和組織形態(tài)發(fā)生和維持[26-28]。VCAN已被證明具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的潛力[29-30],其能夠激活EGFR-PI3K-AKT途徑促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移[31],參與骨髓瘤發(fā)病機(jī)制[32],也能夠激活NF-kB信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲[33],與許多不同類型癌癥的不良結(jié)局密切相關(guān)[34]。這與我們研究所得結(jié)果類似,即VCAN的高表達(dá)與BMAH的發(fā)生呈正相關(guān)。進(jìn)一步的GSEA結(jié)果分析顯示,VCAN主要與丁酸代謝、ECM-受體相互作用、半乳糖代謝、蛋白質(zhì)消化吸收和類固醇生物合成等有關(guān)。然而目前沒有關(guān)于丁酸、半乳糖代謝和ECM-受體相互作用與BMAH的相關(guān)報(bào)道,這些途徑可能是治療BMAH新的潛在機(jī)制,可作進(jìn)一步研究。但有研究指出調(diào)節(jié)類固醇的分泌與BMAH的發(fā)生發(fā)展密不可分,類固醇生物合成降低是原發(fā)性雙側(cè)大結(jié)節(jié)性腎上腺皮質(zhì)增生癥的一大特征[35]。此外,在幾個(gè)AIMAH家族病例中,特定的異常激素受體在受影響成員的腎上腺中起作用,而一種或幾種G蛋白偶聯(lián)受體的異常腎上腺表達(dá)和功能可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和類固醇生成的異常調(diào)節(jié)[15]。在本研究中VCAN的高表達(dá)會(huì)增加類固醇的分泌,由此可推測(cè)出抑制VCAN的表達(dá)能夠減少類固醇的分泌,從而參與疾病的治療?？傊?VCAN參與多種致癌作用機(jī)制,因此,可進(jìn)一步研究其在家族性BMAH中的可能機(jī)制。

雙糖鏈蛋白聚糖(Biglycan,BGN)是一種I類分子的富含亮氨酸的小蛋白聚糖 (SLRP),在軟骨和骨骼中都存在,在維持結(jié)構(gòu)和體內(nèi)平衡方面發(fā)揮著重要作用[36]。BGN在腫瘤的生物發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮重要作用,并且在各種癌癥中發(fā)現(xiàn)了BGN的異常表達(dá)[37]。之前的研究發(fā)現(xiàn)BGN在人平滑肌肉瘤細(xì)胞系SK-UT-1中的表達(dá)與cAMP依賴性及蛋白激酶A介導(dǎo)有關(guān)[38]。除此之外,也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高會(huì)增加骨細(xì)胞中BGN啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,并首次暗示cAMP/蛋白激酶A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與BGN基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[39]。而異常的cAMP/蛋白激酶A信號(hào)傳導(dǎo)在腫瘤發(fā)生中起核心作用,其是腎上腺皮質(zhì)皮質(zhì)中皮質(zhì)醇分泌的主要激活因子,與庫欣綜合征和腎上腺皮質(zhì)腫瘤密切相關(guān)[40],可見,BGN在AIMAH的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。GSEA結(jié)果分析顯示,BGN還與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白質(zhì)消化吸收、核糖體、剪接體、各種類型的N-聚糖生物合成、皮質(zhì)醇的合成和分泌、類固醇生物合成和血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路等密切相關(guān)。BMAH的發(fā)生與皮質(zhì)醇的分泌有著更加密切的聯(lián)系,皮質(zhì)醇合成抑制劑能夠參與該疾病的治療[41]。另外,剪接體能夠引導(dǎo)真核細(xì)胞中的前mRNA剪接,而之前有研究表明,剪接體可能構(gòu)成了癌癥中有吸引力的治療靶點(diǎn)[42]?？傊?BGN在家族性BMAH的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。

4 結(jié) 論

綜上所述,本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析,在家族性BMAH和正常組之間篩選出336個(gè)DEGs,進(jìn)一步篩選出5個(gè)關(guān)鍵基因并進(jìn)行驗(yàn)證,最終確定了VCAN和BGN基因的表達(dá)水平在BMAH和正常組之間存在顯著差異,以此鑒定為家族性雙側(cè)大結(jié)節(jié)性腎上腺皮質(zhì)增生癥的潛在生物標(biāo)志物,為臨床診斷和治療提供參考。但本研究存在一定局限性,即目前尚無相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究這些基因在家族性BMAH中的具體作用機(jī)制。因此,需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明這些基因在家族性BMAH中的功能作用。