雞馬立克氏病抗性機制及抗病品系研究進展

鄭 鋼，楊玉琴，杜玉雙，連 玲

（中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，動物遺傳資源與分子育種實驗室，北京 100193）

雞馬立克氏?。∕arek's disease，MD）是一種由皰疹病毒科-馬立克氏病病毒（MDV）引起的家禽傳染性疾病，嚴重影響雞的健康和家禽生產(chǎn)，該病由József Marek 于1907 年首次描述，最初定義是“雞癱瘓病”，后續(xù)Biggs 建議使用馬立克氏?。∕D）命名該病，并將其定義為由皰疹病毒引起的淋巴組織增生性疾病。患病雞的生長發(fā)育受到抑制，肉質(zhì)和產(chǎn)蛋能力下降，死亡率增加，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[1,2]。為了研究抗馬立克氏病的遺傳機制，學者們一直致力于了解該病的發(fā)病機制和免疫反應，并且通過培育抗性雞品系和開發(fā)疫苗等手段來控制該病。

目前，馬立克氏病的預防和控制主要依賴疫苗，所開發(fā)的疫苗從HVT 到SB-1 以及目前最廣泛使用的CVI988 疫苗，已經(jīng)更迭三代，現(xiàn)國內(nèi)外正在積極開發(fā)和推廣超強毒株（Very virulent，vv）MDV meq 缺失疫苗，以應對MDV 毒力的不斷增強。疫苗的使用對于減少馬立克氏病的發(fā)生和傳播起到了重要作用，但也側面助推了MDV 的變異和演化，使得馬立克氏病的控制變得更加復雜。因此，從宿主自身的抗性以及易感機制入手研究馬立克氏病，培育MD 高抗品系一直是研究熱點。近年來，隨著基因組學、免疫學和生物學等領域技術的進步，針對馬立克氏病的研究得以加速。研究人員通過組學測序能分析病毒序列的多樣性和致病機制。有研究發(fā)現(xiàn)，MDV感染后會操縱宿主細胞的基因表達，干擾細胞的免疫應答以實現(xiàn)免疫逃逸，且宿主雞的免疫系統(tǒng)會出現(xiàn)損傷，增加雞感染其他病原微生物的風險。多項研究表明，馬立克氏病的抗性和易感性受遺傳因素的影響，通過遺傳分析和基因組評估，研究人員已鑒定出多個雞MD 抗性相關基因位點和遺傳標記，這些發(fā)現(xiàn)為進一步培育抗性雞品系提供了重要依據(jù)。

總的來說，馬立克氏病是一種嚴重危害雞養(yǎng)殖業(yè)的疾病，通過利用基因組學、免疫學和生物學等領域的技術，我們能更好地理解馬立克氏病的發(fā)病機制和抗性形成的遺傳基礎，為防控該病以及選育抗病系提供了有效的策略，對保障禽類健康生產(chǎn)意義重大。本文綜述了目前雞馬立克氏病抗性機制及抗性品系選育進展，為深入探究該病的抗性基礎以及抗性系選育提供參考。

1 主要組織相容復合體與雞馬立克氏病的相關性

主要組織相容復合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）是一組高度多態(tài)的基因群，發(fā)揮著抗原呈遞作用。雞的MHC 基因簇位于16號染色體上，其中核心區(qū)域（BF/BL 區(qū)域）包含了一組編碼MHC-I 類和MHC-Ⅱ類分子的基因[3]。研究表明，特定的MHC 單倍型與雞的馬立克氏病抗性/ 易感性存在顯著相關，在雞上MHC 單倍型又被稱為B 單倍型。早在20 世紀80 年代，依據(jù)血清學分型共鑒定了27 種MHC-B 血清單倍型，包括11 個常見單倍型（B2、B4、B5、B6、B7、B12、B13、B14、B15、B19 和B21）和16個低頻單倍型（B1、B3、B8、B9、B10、B11、B17、B18、B22、B23、B24、B25、B26、B27、B28 和B29）以及8 個重組單倍型（以上數(shù)據(jù)78%來自白來航雞），其中B21、B2、B6 單倍型被認為對MD 具有抗性，B5、B13、B19 單倍型對MD 易感[4]。研究人員通過對BF/BL 區(qū)域的基因多態(tài)性進行分析，發(fā)現(xiàn)不同MHC 單倍型的雞體內(nèi)能產(chǎn)生不同的抗體反應、細胞免疫反應和免疫調(diào)節(jié)反應，從而影響其對MD 的抵抗力[5]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，雞MHC-B 區(qū)域（209kb）具有高度多態(tài)性，其中包含45 個基因[6]。不同的MHC單倍型會通過其所編碼的MHC 分子與MDV 抗原結合能力不同，影響免疫系統(tǒng)對病毒的應答。如B2 單倍型的MHC-Ⅱ分子抗原肽結合區(qū)基序是10 個氨基酸[7]，而B19 MHC-Ⅱ類分子為9 個氨基酸，這可能是B2 較B19 單倍型有MD 抗性的原因之一；針對B15 和B19 的雞MHC-I 類分子結構的研究發(fā)現(xiàn)，BF2*1501 具有更寬和更深的肽結合槽，這可能是B15 相較于B19 單倍型有更強抗性的原因[8]；B21 單倍型被認為對MDV 具有抗性，研究發(fā)現(xiàn)B21 單倍型的MHC-I 類分子BF2*2101 的結合槽有一個大的中心腔，且根據(jù)初步的肽段配體模型，預測出BF2*2101 分子可以結合更多來自MDV 的抗原肽，比B4、B12 和B15 等的MHC-I 類分子預測結合的肽段更多，這可能是B21 單倍型具有更強抗性的原因[9]；Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)B4 單倍型的BF2*0401 分子顯示出在其他MHC 分子中未觀察到的高度正電荷表面，以及由于等位基因特異性殘基帶有臃腫側鏈而導致的異常狹窄的抗原結合槽，這可能是B4 單倍型雞具有MD 易感性的原因之一。

需要注意的是，MHC 單倍型對馬立克氏病抗性的影響并非絕對的，因為MDV 具有遺傳多樣性和適應性進化能力，可以借此逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。除了MHC，其他基因和免疫系統(tǒng)組分的相互作用也會在馬立克氏病的抗性或易感性中發(fā)揮作用。因此，需要進一步研究揭示MHC 與其他基因和免疫系統(tǒng)組分的相互作用，以及這些相互作用與MD 抗性的關系，才能更好地解釋抗性/易感性的遺傳基礎。

2 與MD 相關的群體遺傳標記

除了目前公認的主效基因MHC 基因簇外，研究人員還在尋找與MD 抗性/ 易感性相關的其他遺傳標記[11]，其中包括基于微衛(wèi)星標記、單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）標記，以及拷貝數(shù)變異（Copy number variation，CNV）等。

微衛(wèi)星標記是一種常用的分子標記，是DNA序列中的短重復序列，其重復次數(shù)在不同個體中可能不同。早期研究發(fā)現(xiàn)了17 個與MDV 感染后的存活率有關的微衛(wèi)星標記（表1）[12]。通過微衛(wèi)星標記的分析，鑒定可能與MD 抗性相關的候選基因或基因座，檢測這些基因座的遺傳變異，并與MD 抗性進行關聯(lián)，可以進一步分析MD 相關的變異位點。

表1 與感染馬立克氏病病毒后的存活率相關的標記[12]

單核苷酸多態(tài)性是基因組中常見的遺傳變異形式，SNP 芯片和測序技術的廣泛應用使研究人員能全面分析雞的基因組。目前，已有多項研究發(fā)現(xiàn)SNP 和結構變異與MD 相關。Li 等[14]對67只MDV 感染雞進行了全基因組關聯(lián)分析（Genome-Wide Association Studies，GWAS），搜索了38655 個有效基因組標記后，發(fā)現(xiàn)2 個SNPs與宿主的MD 抗性有關，分別是rs14527240（位于SPARC 相關模塊鈣結合蛋白1，SMOC1 基因上）和GGaluGA156129（位于非受體型蛋白酪氨酸磷酸 酶3，PTPN3 基因上），其中SMOC1 在MDV 感染后的易感雞脾臟中表達上調(diào)，表明其在MD 腫瘤發(fā)生中起到重要作用。Perumbakkam等[15]在具有抗性差異的肉雞群體（Cobb-Vantress純系雞或其F1 代雞）和MD 抗性63 系、易感72系雜交后的F1 代雞中分別識別了與MDV 抗性相關的等位基因特異性表達（Allele-specific expression，ASE）的SNPs 6132 個和4528 個，分別位于4768 個和3718 個基因中，其中只有72 個SNPs 和850 個基因在2 個群體中同時顯示等位基因特異性表達，且上述兩群體在MDV 感染后分別有548 個和434 個基因差異表達，其中只有20個基因是兩群體共有的，富集分析發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）以及JAK/STAT 信號通路等在2 個群體中都出現(xiàn)富集。Cheng 等[16]利用上述4528 個ASE SNPs 中的1824 個，以及3097 個隨機選擇的SNPs 設計芯片，結果顯示，1824 個在MDV 感染后表現(xiàn)出ASE 的SNPs 可以解釋83%以上的遺傳變異，且ASE SNP 預測育種值的準確度（0.736）比傳統(tǒng)基于血緣關系的最佳線性無偏預測（Best Linear Unbiased Prediction，BLUP）方法（0.325）高很多。筆者課題組針對3 只63 系個體，3 只72系個體進行全基因組重測序，在馬立克氏病抗性系中共找到4904832 個SNPs 和742041 個小片段插入以及缺失（Insertion and Deletion，InDels），在馬立克氏病易感系中共找到4882010 個SNPs 和744783 個InDels；其 中1676196 個SNPs 和242126 個In-Dels 是抗性品系特有的，1510499 個SNPs 和227013 個InDels 是易感品系內(nèi)特有的。

Yan 等[17]隨后利用全基因組重測序?qū)D 抗性63 系和易感72 系進行了CNV 分析，共鑒定到5680 個CNV 區(qū)域（Copy Number Variation Region，CNVR），其中1546 個和1866 個分別在MD 抗性和易感系中特異存在（被認為已固定），易感性系內(nèi)固定的CNVRs 所涉及的基因顯著富集在MAPK 信號通路上。Xu 等[18]使用Affymetrix Axiom HD 600 K SNP 基因分型芯片檢測了MD抗性6 系、易感7 系以及它們的重組同類系（Recombinant Congenic Strain，RCS）一共10 個純系雞中的CNV，共檢測到393 個CNVs 片段，其中12 個CNVs 為72 系雞中特有，有2 個CNVs（chr10：5716844-5717897 和chr26：1927477-1931663）的缺失很可能對MD 易感性起到貢獻作用，同時還發(fā)現(xiàn)66 個CNVs 與MD 相關的數(shù)量性狀基因座（Quantitative Trait Loci，QTL）區(qū)域重疊。Bai 等[19]基于MD 抗性63 系和易感72系以及它們的F1 代和6 個具有不同易感性的重組同類系共9 個群體，鑒定出1649 個CNVRs，其中90 個CNVRs 在所有雞系中共享，共涉及1360 個基因。此外，在63 和72 系中分別特異性地鑒定到包含62 個基因的55 個CNVRs 和包含57 個基因的44 個CNVRs。

為了更好地理解MD 抗性的遺傳機制，研究還將遺傳標記與表型數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析，如全基因組關聯(lián)分析和基因組選擇信號分析。通過結合遺傳標記和表型數(shù)據(jù)，可以鑒定出與MD 抗性相關的遺傳變異，并了解這些變異如何影響抗性的表現(xiàn)。在雞馬立克氏病抗性研究中，已經(jīng)鑒定和報道了多個與該抗性相關的QTLs。Smith 等[20]基于2 個MD 抗性不同的商業(yè)白來航品系雜交產(chǎn)生的F6 群體進行600k 芯片的GWAS 分析，找到與MD 相關的38 個QTLRs，如表2 所示。這些QTLs 位點的鑒定和研究對理解雞馬立克氏病抗性的遺傳機制起到了重要作用。除上述QTLs 位點之外，Lipkin 等[21]挖掘得到了7 個位于Z 染色體上的與MD 關聯(lián)的QTLs，通過生物信息學分析找到了一些可能的候選基因，如磷酸二酯酶8B（PDE8B）、一般轉錄因子IIH 亞基2（GTF2H2）等，這些基因與免疫和疾病相關，這也是MDV在公母雞上的感染存在差異性的原因之一。

表2 與馬立克氏病相關的QTL 位點信息[20]

3 宿主與病毒基因互作

大量研究表明，宿主與病毒基因之間的相互作用在馬立克氏病的發(fā)病和抗性中起著重要作用。這些互作調(diào)控過程包括病毒入侵宿主細胞、病毒基因的表達與調(diào)控、免疫逃逸和免疫抑制、宿主的免疫應答以及病毒復制和釋放等。MDV感染的第一步是病毒入侵宿主細胞，MDV 依賴于其表面的糖蛋白與宿主細胞膜上的特定受體結合，一旦病毒與宿主細胞結合，它可以通過膜融合或內(nèi)吞過程進入細胞。具體來說，MDV 的入侵過程可能涉及多種細胞表面受體。CD30 是T細胞表面分子，也稱CD30 抗原，可能作為MDV的受體之一。研究發(fā)現(xiàn)，MDV 主要感染T 淋巴細胞，且腫瘤細胞表型從低表達CD30（lo）轉變?yōu)楦弑磉_CD30（hi）[22]。有研究報道，雞CD30啟動子具有15 個預測的高嚴格MDV 主要致瘤基因（meq）結合轉錄因子識別基序，Meq 可在體外增強CD30 啟動子的轉錄[23]。Zhang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白-70（Heat shock protein 70，HSP-70）可能是MDV 糖蛋白gH 的潛在細胞受體，體外實驗驗證了HSP-70 參與MDV 進入雞胚胎成纖維細胞（CEF）的早期階段。因不同MDV亞型可能利用不同的受體，也可能存在侵入不同類型細胞時利用不同受體的情況，目前MDV 的入侵機制仍在研究中。

一旦MDV 進入宿主細胞，其基因組會被釋放，而后病毒基因開始被表達和調(diào)控。MDV 的基因組是一個將近180kb 的雙鏈DNA，不同毒株略有不同，強毒株GA 株全基因長174kb[25]，超強毒株Md5 株約178kb，編碼了100 多個基因。MDV 感染后通過多種方式逃避宿主的免疫反應。Meq 基因編碼的蛋白是MDV 的主要致癌蛋白[26]，其本身是一種轉錄因子[27]，參與細胞溶解性感染，并且對于體內(nèi)淋巴細胞的轉化至關重要。研究表明，Meq 與干擾素刺激因子（STING）和干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）結合，中斷STING-TBK1-IRF7 復合物的形成，從而抑制干擾素β（IFN-β）的表達。US3 是單純皰疹病毒中的一個多功能基因，其編碼的病毒蛋白激酶通過靶向IRF7 抑制IFN-β 的產(chǎn)生促進MDV 復制，阻斷cGAS-STING信號通路[28]，同時也有研究顯示，US3 蛋白激酶可磷酸化雞組蛋白去乙?；福℉DAC）1 和2并調(diào)節(jié)病毒復制和發(fā)病機制[29]；另外病毒基因RLORF4、UL46 和VP23 也能通過調(diào)節(jié)cGASSTING 信號通路來抑制一型干擾素（IFN-I）的產(chǎn)生。

vIL-8 基因編碼的蛋白是宿主白細胞介素-8（IL-8）的同源物，編碼一種CXC 趨化因子，能募集B 細胞和CD4+CD25+T 細胞，分別是病毒復制和MDV 誘導轉化的靶細胞，vIL-8 在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要功能，從MDV 基因組中刪除vIL-8基因后，幾乎完全消除了疾病和腫瘤的形成[30]。vTR 基因編碼一種非編碼RNA-vTR RNA[31]，其被認為是一種轉座酶RNA（Telomerase RNA），vTR 和雞源的端粒酶RNA（TR）具有88%的同源性，vTR RNA 在MDV 感染過程中起到調(diào)節(jié)細胞端粒酶活性的作用，其與宿主細胞的端粒酶逆轉錄酶（TERT）相互作用，幫助形成端粒酶的活性復合物，從而促進端粒延長以提高MDV 的生存能力和感染能力。vBCL-2 基因編碼的蛋白是宿主BCL-2 的同源物，BCL-2 是一種重要的抗凋亡蛋白，MDV 通過表達vBCL-2，抑制細胞凋亡，從而提高病毒的生存能力[32]。

在MDV 進入宿主細胞后，宿主免疫系統(tǒng)會對MDV 感染作出反應，這包括先天免疫反應以及適應性免疫反應。先天免疫應答是宿主對病毒感染的第一道防線，宿主的免疫系統(tǒng)會通過識別病毒的病原相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）來激活先天免疫應答。這個過程主要涉及TLR 和RIG-I 樣受體（RLRs）等基因的表達，這些受體可以識別PAMPs，激活下游的信號通路，產(chǎn)生干擾素和炎性細胞因子，從而抑制病毒的復制和擴散。研究發(fā)現(xiàn)，血清淀粉樣蛋白A 能參與MDV 誘導的宿主先天免疫，在感染期間血清淀粉樣蛋白A（Serumamyloid A，SAA）激活Toll 樣受體2/4（TLR2/4）下游通路中的IFN-β 和IRF7 基因的啟動子活性[33]。適應性免疫應答是宿主對病毒感染的第二道防線，在MDV 感染之后，宿主的免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生針對病毒的特異性免疫應答。這個過程主要涉及B 細胞和T 細胞等免疫細胞的活化和增殖，以及抗體和細胞毒性T 細胞（CTLs）等免疫效應分子的產(chǎn)生。這個過程涉及多種基因的表達，包括抗原呈遞基因（MHC）、T 細胞受體（TCR）、B 細胞受體（BCR）、細胞因子基因（如白細胞介素2（IL-2）、IFN-γ 等）等。

在易感個體中，病毒感染的最終過程是病毒大量復制和釋放，這個過程涉及許多基因的調(diào)控，主要體現(xiàn)在毛囊中病毒粒子的釋放。病毒的裝配和成熟過程涉及許多結構蛋白的表達，如VP5、VP13/14 等，其中Jarosinski 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，早在感染后8d 的羽毛囊上皮細胞中就能檢測到MDV 的晚期蛋白UL47 表達。

值得注意的是，MDV 是一種細胞結合型病毒，其傳播主要依賴于細胞間的直接接觸。在病毒復制和釋放過程中，病毒粒子并不直接從宿主細胞中釋放出來，這些新的病毒顆粒會被包裹在核膜和細胞膜之間，形成成熟的病毒粒子。通過細胞膜的融合，將病毒直接傳遞給相鄰的宿主細胞。這種傳播方式可以避免病毒暴露在宿主免疫系統(tǒng)的攻擊下，有利于病毒的持久性感染。而在單純皰疹病毒的感染過程中，病毒的鞘膜蛋白（如gB、gH、gL 等）和宿主細胞受體（如HVEM、Nectin 等）的相互作用是促使皰疹病毒進入宿主細胞的一種機制[35,36]，但對于MDV 來說，目前還不清楚具體是哪些病毒蛋白和宿主細胞受體參與了病毒的細胞間傳播。

以上感染過程涉及病毒與宿主基因間復雜的互作，系統(tǒng)解析了馬立克氏病的發(fā)病機制、免疫應答，有助于探明雞MD 抗性形成的分子基礎。

4 基因表達調(diào)控與MD 遺傳抗性

4.1 宿主相關抗性基因表達

在宿主對MD 的研究中，除MHC 和免疫相關基因外，還有一些差異基因的表達值得關注。白來航雞中生長激素1（GH1）的多態(tài)性與MHC B2/B15 單倍型的個體感染后MD 腫瘤數(shù)量有關，推斷GH1 是與MD 相關的抗性基因。Sarson 等[37]比較MD 抗性單倍型B21 和易感單倍型B19 個體感染MDV 后的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)一些差異表達基因，包括趨化因子AH221、B 細胞標記物1（Bu-1）、免疫球蛋白家族（IgG、IgA、IgM）、MHC-II β 鏈、顆粒酶A（GZMA）和信號轉導與轉錄激活因子2（STAT2）編碼基因。Smith 等[38]分析了抗性61 系和易感72 系雞在感染MDV 后的反應以及感染后2 個系之間的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)感染后4d 含有HIC ZBTB 轉錄抑制因子1（HIC1）結合位點的基因表達下調(diào)，同時將基因表達數(shù)據(jù)與先前的QTL 數(shù)據(jù)進行比較，確定了候選基因AVD、IFNA、MX1、IL-6、FN1、IRG1、DDT、DNAJC3、SFTPA2、GNG12 可能與MD 抗性有關。在未感染狀態(tài)下，一些已知的先天免疫反應基因的表達量在61 系和72 系上存在差異，如DNAJC3、DDT、NMU、GSTO1、VIP、HPS5、MMP7、FGFR3、HSCB、E2F4、SFTPA2 和GNG12 在61 系高表達，在72 系低表達，這暗示易感和抗性系之間存在基因表達的固有差異；感染后，兩系之間也觀察到基因的差異表達（脾臟中有539 個差異表達基因，胸腺中有156 個差異表達基因）。在抗性系中，IgG-H、AMIGO2、MMP13 和CLEC3B 等免疫基因表達更高，在易感系中，AVD、IRG1、HSP25、ART1、IL-18、NOS2A、CXCL13、CCLi2、MX1、SOCS1 和IL-6基因表達更高，說明在感染后2 個系存在不同免疫基因的表達上調(diào)。Subramaniam 等[39]通過比較來自MD 抗性6 系和易感性7 系的CEF 對MDV感染的反應，鑒定了以下可能與MD 遺傳抗性相關的候選基因：凋亡相關基因（如Caspase3、Caspase6、Caspase8 等）在抗性6 系中上調(diào)；抗凋亡基因（如BIRC2 和Bcl-2 家族成員）在抗性6 系中下調(diào)；MAPK 信號通路相關基因，如MEK2 在抗性6 系中下調(diào)，Ras 在易感7 系中上調(diào)；JAK-STAT 信號通路相關基因在易感7 系中上調(diào)。IRG1 基因在易感7 系中下調(diào)；還發(fā)現(xiàn)了直接受meq 調(diào)控，且具有變異位點的24 個基因，如BRAF、GPS1 等；還有其他可能參與細胞凋亡、增殖調(diào)控的轉錄因子編碼基因，如AP1M1、OPTN 等。同樣分離6 系和7 系CEF 攻毒后，Haunshi 等[40]發(fā)現(xiàn)，MDV 感染明顯提高了易感性和抗性雞中Toll 樣受體3（TLR3）、IL6 和白細胞介素8（IL8）的mRNA 表達水平。此外，在未感染狀態(tài)下，TLR3、Toll 樣受體7（TLR7）等基因在抗性雞CEF 中的基礎表達水平高于易感雞。還有很多研究鑒定得到了與MD 抗性相關的基因位點，如淋巴細胞抗原6 復合物（LY6E）[41]，干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF2）[19]，髓細胞白血病1 基因（MCL1）[42]等。

4.2 DNA 甲基化調(diào)控

表觀遺傳學是研究遺傳信息的表達和調(diào)控的科學，主要涉及DNA 甲基化、組蛋白修飾和RNA 干擾等方面。DNA 甲基化在MD 遺傳抗性中的作用是多方面的。一方面，DNA 甲基化可影響宿主對MDV 的抵抗能力。Tian 等[43]發(fā)現(xiàn)在MDV 感染后，抗性63 系的甲基化水平下降，研究共鑒定了11512 個感染誘導的差異甲基化區(qū)域（iDMRs），其中易感72 系的iDMRs 數(shù)量較抗性63 系更多，進一步證明，體外甲基化水平與MDV 復制直接相關，通過藥物抑制DNA 甲基化可以限制感染細胞中的MDV 傳播，推斷宿主的DNA 甲基化可能與MD 抗性或易感性相關。Li等[44]研究發(fā)現(xiàn)，CD30 在MDV 感染的脾臟中顯示出較低的DNA 甲基化水平和較高轉錄水平。Wang 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，MDV 感染后細胞抗原受體復合物相關蛋白β 基因（CD79B）表達的降低很可能是DNA 甲基化水平升高所導致。Luo 等[46]發(fā)現(xiàn)MDV 感染引起的DNA 甲基化波動在MD 抗性63 系和易感72 系雞之間不同，一些候選基因在72 系雞中具有比63 系雞更高的啟動子甲基化水平，其中參與細胞成分、刺激響應、細胞黏附和免疫過程的高甲基化基因可能通過調(diào)控表達在疾病易感性中發(fā)揮重要作用。Yuan 等[47]結合甲基化、轉錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)60%差異表達基因與差異甲基化區(qū)域中CpG 位點的甲基化水平顯著相關，其中CD4 和HMBG1 基因在腫瘤組織中異常高表達，體外過表達試驗發(fā)現(xiàn)其能促進淋巴瘤細胞的增殖。另一方面，MDV 的DNA 也可能被甲基化。在肝臟原發(fā)性腫瘤中，Brown 等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在感染后不到2 個月，CpG 甲基化主要集中在ICP4 基因內(nèi)，并提出非隨機新生DNA 甲基化發(fā)生在淋巴瘤發(fā)生的早期。Rasschaert 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，ICP4 的遠端啟動子在裂解期和潛伏期與基因表達相關，而近端啟動子在再激活階段與該基因的表達相關，2 種啟動子在病毒周期中都受到DNA 甲基化的調(diào)節(jié)，并且在潛伏期中被高甲基化。這些研究表明，DNA 甲基化在MD 的抗性機制中起著重要作用。

4.3 組蛋白修飾調(diào)

組蛋白修飾是調(diào)控基因表達的重要方式，通過改變?nèi)旧|(zhì)的結構影響轉錄因子和RNA 聚合酶等調(diào)控因子對基因啟動子的識別和結合，從而影響基因的轉錄過程。MDV 感染過程中，組蛋白修飾可能起到關鍵作用[50]。Luo 等[51]針對MDV抗性和易感系雞進行了全基因組組蛋白修飾的研究，發(fā)現(xiàn)組蛋白H3 賴氨酸4 三甲基化（H3K4me3）與蛋白編碼基因及microRNA（miRNA）基因的表達呈正相關，而組蛋白H3 賴氨酸27 三甲基化（H3K27me3）與蛋白編碼基因及microRNA（miRNA）基因的表達負相關，另外還發(fā)現(xiàn)抗性雞中被激活的免疫應答和細胞黏附相關基因存在獨特的H3K4me3 修飾區(qū)域。

Brown 等[48]研究發(fā)現(xiàn)，meq 和非編碼RNA 的啟動子周圍的染色質(zhì)與H3K9 乙酰化和H3K4 三甲基化相關，這些是轉錄活躍的染色質(zhì)標記，而溶解基因pp38 的溶解復制起始點（OriLyt）附近區(qū)域缺乏活性標記，這與其周圍存在抑制性組蛋白修飾（H3K27 和H3K9 三甲基化）有關。因此，組蛋白修飾在MD 中可能發(fā)揮著重要作用，包括促進病毒的復制和擴散，以及調(diào)控宿主的抗病毒免疫反應等。

4.4 非編碼RNA

MDV-1 基因組可以編碼產(chǎn)生26 種miRNAs[52]。Mdv1-miR-M4-5p[53,54]是MDV 編碼的最為重要的miRNA 之一，它可以靶向宿主的免疫相關基因，如IFN-γ，抑制宿主的免疫反應。此外，mdv1-miR-M4-5p 還可以靶向宿主細胞周期相關基因，如CDK6，從而促進病毒復制；Mdv1-miR-M11-5p 靶向宿主MAFB、LOC776816 和RFX7 基因[55]，miR-M11-5p 敲除可顯著增強MDV 致病性及致瘤性，表明其可能是MD 腫瘤抑制因子；研究發(fā)現(xiàn)編碼3 個miRNAs（mdv1-miR-M8-M9-M10）的MDV 基因簇缺失不影響細胞培養(yǎng)中的病毒復制和噬斑大小，但增加了母雞MDV 的早期細胞溶解復制，且缺失后導致外周血淋巴細胞的病毒再激活的量顯著增加，此外還會導致淋巴器官更嚴重的萎縮和平均死亡時間的縮短[56]；Zhu等[57]研究發(fā)現(xiàn)，MDV-1 編碼的miR-M2-5p 同時通過RBM24 和MYOD1 介導的信號通路促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，潛在參與病毒誘導的T細胞淋巴瘤發(fā)生。有關MDV 編碼lncRNA 的報道相對較少，研究人員發(fā)現(xiàn)了一個名為ERL 的lncRNA 基因[58]，它可能作為MDV 的致癌基因meq 和miRNA 簇的自然反義轉錄本（NAT）；通過轉錄組研究發(fā)現(xiàn)ERL lncRNA 在MDV 感染過程中受到高度編輯，可能對MDV 的感染和致病過程具有重要影響。Alexis 等[59]對MDV 感染的不同階段（溶細胞感染、潛伏期、再激活期）進行分析，挖掘得到了由meq、潛伏相關轉錄物（LATs）、pp14、ERL 以及一些重復序列區(qū)域表達的circRNA 分子，推測這些環(huán)狀RNA 分子可能發(fā)揮著重要的生物學功能。

在雞MD 抗性研究中，一些宿主非編碼RNA在MDV 感染后表達量也會發(fā)生改變，這些非編碼RNA 可能通過調(diào)控宿主基因表達，影響宿主對MDV 的抵抗能力。Stik 等[60]研究發(fā)現(xiàn)，病毒癌基因meq 可與TMEM10 基因啟動子結合，從而反式激活gga-miR-21 表達并靶向雞程序性死亡細胞4（PDCD4），進一步促進腫瘤細胞生長和細胞凋亡及免疫逃逸。Lian 等[61]發(fā)現(xiàn)gga-miR-181a在MDV 誘導的淋巴瘤中下調(diào)，其靶基因是類骨髓增生病毒癌基因同源物1（MYBL1），體外試驗表明gga-miR-181a 對MDV 轉化淋巴瘤細胞系（MSB1）細胞增殖具有抑制作用。Lian 等[62]還發(fā)現(xiàn)，gga-miR-199-3p、gga-miR-140-3p 和gga-miR-221 對MSB1 細胞增殖也有抑制作用，表明這些miRNAs 可作為MD的腫瘤抑制因子；Yao 等[63]通過芯片分析了7個不同MDV 轉化細胞系中的miRNA 表達譜，研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 在MDV 轉化的腫瘤細胞中特異表達下調(diào)。該現(xiàn)象被認為是MD 腫瘤細胞的獨特表達特征；Xu 等[64]發(fā)現(xiàn)miR-26a 在許多禽淋巴瘤細胞中均處于全局下調(diào)狀態(tài)，且miR-26a 有直接靶向雞IL-2 的潛力，腫瘤細胞中miR-26a 的下調(diào)可以減輕對IL-2 表達的抑制作用，有助于轉化淋巴細胞系的增殖特征；Li 等[65]發(fā)現(xiàn)miR-26a 還能靶向NEK6，抑制MSB1細胞增殖。lncRNA GAS5 和lncRNA MALAT1在MDV 感染后的雞體內(nèi)表達量發(fā)生改變。He 等[66]研究發(fā)現(xiàn)，linc-GALMD1 通過調(diào)節(jié)MDV 基因和腫瘤相關基因的表達以及調(diào)節(jié)對MDV 感染的免疫反應來促進腫瘤抑制的功能，另外He 等[67]還發(fā)現(xiàn)，linc-satb1 通過調(diào)節(jié)附近的蛋白編碼基因SATB1 在MD 免疫反應中發(fā)揮關鍵作用，對MDV 誘導的T 細胞腫瘤產(chǎn)生很大影響。You 等[68]針對馬立克氏病腫瘤的全轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，差異表達的 lncRNAs（MSTRG.360.1、MSTRG.6725.1、MSTRG.6754.1、MSTRG.15539.1 和MSTRG.7747.5）與MD 抗性候選基因（如IGFI、CTLA4、HDAC9、SWAP70、CD72、JCHAIN、CXCL12 和CD8B）之間存在強烈的相關性，表明lncRNAs 可能通過它們的靶基因影響MD 抗性和腫瘤發(fā)生。Wang 等[69]在攻毒脾臟組織中鑒定得到有113 個差異表達的circRNAs，發(fā)現(xiàn)gga-miR-155 不僅與circGTDC1 和circMYO1B 相互作用，還靶向免疫相關基因，如Gata4，提示非編碼RNA 在介導免疫響應基因中的重要作用。

4.5 m6A 修飾

N6-甲基腺苷（m6A）是一種在真核生物mRNA 中普遍存在的內(nèi)源性修飾，已被證明在包括細胞分化、發(fā)育、應激反應和免疫反應在內(nèi)的過程中起到重要作用。Zhuang 等[70]研究了體內(nèi)MDV 感染期間病毒和mRNA 水平m6A 修飾的變化，結果發(fā)現(xiàn)，甲基轉移酶樣3/14（METTL3/14）復合物在MDV 生命周期的裂解和再激活階段受到抑制，而在潛伏期和MDV 誘導的腫瘤中表達增加，且過表達METTL3/14 會抑制MDV 基因的表達和復制，而敲低METTL3/14 則增強MDV 基因表達和復制。Sun 等[71,72]通過對MDV 體外感染的CEF 細胞中l(wèi)ncRNA 和circRNA 的m6A 修飾進行了分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA 和circRNA 的m6A 修飾在MDV 感染中高度保守；MDV 感染增加了lncRNA m6A 修飾位點的表達，且與MDV 感染相關的信號通路密切相關，而circRNA m6A 修飾與胰島素信號通路調(diào)控相關。這些研究表明m6A 甲基化可能在MD 抗性中發(fā)揮作用。

5 抗性品系培育進展

5.1 美國農(nóng)業(yè)部抗性6 系/易感7 系培育

從1939 年開始，美國農(nóng)業(yè)部（USDA-ARS）Nelson[73]使用9 個不同來源的白來航蛋雞群作為基礎群體，通過300d 存活率等指標進行選育，經(jīng)過5 年形成15 個近交系，初步將1、4、6、7、8、10、12、13 號定義為較高的抗性，2、3、5、9、11、14、15 號系定義為易感。1940 年將來自于1、2、5、7 號系的公雞與來自于2、3 號系的母雞雜交，后代是6 系選育的基礎，開始系譜記錄，每個家系中選留對淋巴瘤發(fā)展有抗性的種雞進行交配，到1961 年近交程度是95%，1962 年停止疾病選擇，開始每個近交系內(nèi)使用同胞交配。因為6 系是幾個抗性系中生產(chǎn)性能最好的，所以用來供研究使用，自1980 年以來，63 系通過選擇產(chǎn)蛋性能高的母雞后代中的1～2 只公雞，與同胞（sib）或堂/ 表（first cousin）交配的方式繁育后代。與此同時1940 年將1 號和7 號系公雞與2 號和7 號系母雞雜交，作為7 系的基礎，選擇家系中對馬立克氏病腫瘤最易感的雞進行育種。經(jīng)過溫和到強烈的近交，1961 年7 號品系近交率達95%，同樣在1962 年停止疾病選擇，開始每個近交系內(nèi)使用同胞交配，產(chǎn)生71 系和72系。7 系長期用于研究馬立克氏病易感性研究。從血清單倍型的角度來說，6 系和7 系均是B2 單倍型，這常常被用來佐證除MHC 外還有其他的因素與MD 抗性有關。

5.2 海蘭公司抗MD 品系培育

針對美國育種公司的抗病品系培育工作資料有限，僅有趙淑娟等[74]報道中提到美國先鋒公司用抗一般不良環(huán)境的B2 品系和幼雛生活力強的B14 品系培育了生活力強的B18 品系，用抗MD的B21 品系和抗一般不良環(huán)境的B2 品系培育了生活力強、抗MD 的934E 品系；另外美國海蘭公司用B2 和B21 培育出抗病性強的HL W36 蛋用商品雞品系?？赡苁芟抻谏虡I(yè)育種公司的行業(yè)機密，目前并沒有公開的資料報道這些培育品系進MDV 感染后的抗病效果。

5.3 俄羅斯雪白雞培育

俄羅斯育種工作者在俄羅斯白雞的基礎上，自1978 年起，經(jīng)過20 年的遺傳選擇，育成了一個蛋雞新品種-俄羅斯雪白雞（Russian Snow-White），該新品種抗MD 能力強。選擇前，基礎群1439 只雞在攻毒的情況下帶有臨床MD 癥狀的雞占12.4%。通過抗MD 選擇到第7 代，在3180 只雞中MD 的發(fā)病率降到2%。最終培育出兩個MD 抗性品系-16 系和10 系。在第7 代，16系MD 發(fā)生率為0.3%，10 系為3.5%。在俄家禽科學研究所實驗室進行的強毒PBIB1 攻毒實驗證實了新品種的抗MD 的特性，在這項實驗中，16系淋巴瘤發(fā)生率為4%，10 系為14%，對照組為41.7%（表3）[75]。

表3 16 系和10 系抗馬立克氏病能力的比較[75]

5.4 國內(nèi)抗MD 品系培育工作

為了有效控制馬立克氏病的發(fā)生，保證養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，李康然等[76]經(jīng)過3 年的研究，采用MDV 強毒株攻擊霞煙雞雛雞，選留幸存者作為零世代進行繁育，其F1 代不經(jīng)疫苗接種，以自然感染衡量其抗病性能，同時結合后裔攻毒測定，通過后代MD 發(fā)生情況評估其父母即F1 代的抗病性能，根據(jù)上述指標進行選育直至第3 世代。第3 世代雛雞1 日齡攻毒后，10 周齡總保護率為74%（對照組35%），其中自然死亡雞的腫瘤陽性率為16%（零世代為48.1%，對照組37.5%）。1 日齡雞經(jīng)火雞皰疹病毒疫苗（HVT）免疫，14 日齡以強MDV 攻毒，MD 總保護率為96.9%（對照組87%）。該研究經(jīng)過三個世代的選擇，初步培育出抗馬立克氏病的霞煙雞品系，填補了我國家禽抗病育種的空白。

國內(nèi)科研工作者在構建疾病研究群體上也取得很好的進展，Gao 等[77]成功利用微衛(wèi)星標記從BWEL 雞群（中國養(yǎng)禽遺傳資源實驗動物國家中心培育并發(fā)展的無特定病原體（SPF）雞）中建立了6 個MHC-B 單倍體雞群體，分別命名為BW/G（1、2、3、5、6、7）系，并將其基因型與6 個血清學定義的MHC-B 單倍體（B13、B15、B2、B5、B21、B19）相對應。通過比較MD 引起的死亡率、組織病變以及病毒負荷，證實相比于BW/G3 系（B2 單倍型），BW/G7（B19單倍型）對MDV 表現(xiàn)出更大的易感性。

6 展望

雞馬立克氏病抗性的研究已經(jīng)取得了重要進展，一些影響雞馬立克氏病抗性的關鍵基因和遺傳因素已被識別，這些發(fā)現(xiàn)為揭示馬立克氏病抗性機制，創(chuàng)制抗馬立克氏病品系提供了理論依據(jù)。未來的研究方向包括：①雞馬立克氏病抗性關鍵基因功能驗證和分子機制解析；②免疫系統(tǒng)與病毒的互作機制解析，探索利用免疫調(diào)節(jié)提高雞馬立克氏病抗性的可能性；③雞馬立克氏病抗性品系培育；④通過基因編輯手段，創(chuàng)制雞抗馬立克氏病育種新素材。