胚胎植入前遺傳學(xué)檢測在Turner 綜合征患者中的臨床應(yīng)用

陳智鏢 ，黃秋香 ，毛麗華 ，陳國勇 ，劉 蕓 ，王志紅

（1）福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院（第九〇〇醫(yī)院）婦產(chǎn)科生殖中心;2）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室，福建 福州 350025）

Turner 綜合征，又稱為先天性卵巢發(fā)育不全綜合征，是X 染色體完全或部分缺失以及結(jié)構(gòu)異常所導(dǎo)致的性染色體疾病，是造成女性生殖困難最常見的染色體畸變類型[1]。在Turner 綜合征患者中，大約50%為X 單體型（45，X），20%～30%為嵌合型（45，X/46，XX），其余多為另一條X 染色體結(jié)構(gòu)異常[2]。據(jù)報道，Turner 綜合征女性自然懷孕的幾率僅為4%～7%，早期流產(chǎn)率高達(dá)30%～45%，后代伴畸形或染色體異常率達(dá)20%～50%[3]。2018 年《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查專家共識》[4]對性染色體異常是否行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）給予一定的建議，但文獻(xiàn)報道不多。本研究回顧性分析選擇行PGT 助孕的18 例Turner 患者的臨床資料、胚胎發(fā)育情況、PGT 結(jié)果以及移植妊娠結(jié)局，探討PGT 在Turner 患者中的臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2016 年1 月至2023 年6 月在第九〇〇醫(yī)院生殖中心行PGT 助孕的18 例Turner 綜合征患者。所有夫婦均經(jīng)過遺傳咨詢并簽署PGT 知情同意書。本PGT 項目經(jīng)衛(wèi)生行政部門審批并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)開展（2 013 027）。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎體外受精、培養(yǎng)和活檢根據(jù)患者臨床基礎(chǔ)情況選擇相應(yīng)超促排卵方案。采用常規(guī)體外受精或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射授精，轉(zhuǎn)移至G1（Vitrolife，瑞士）微滴培養(yǎng)，16～18 h 觀察記錄受精情況。取卵后D3 觀察卵裂情況，將原核（pronucleus，PN）為2PN 或0PN 或1PN 的卵裂胚轉(zhuǎn)入G2（Vitrolife，瑞士）微滴進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。至D5/D6/D7，對可行活檢囊胚參照文獻(xiàn)[5]操作，活檢5～10 個滋養(yǎng)層細(xì)胞?；顧z過的囊胚行玻璃化冷凍保存。

1.2.2 PGT 流程對于核型為45，X 的患者和X染色體結(jié)構(gòu)異常的患者，PGT 采用NGS 技術(shù)?；顧z細(xì)胞采用多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA），擴(kuò)增產(chǎn)物使用Hiseq2500（Illumina，美國）測序，檢測胚胎23 對染色體，篩除非整倍體及拷貝數(shù)變異4 Mb 以上缺失或重復(fù)的胚胎。X 染色體結(jié)構(gòu)異常患者的胚胎檢測范圍同上述，如果異常片段小于1 Mb 則同時進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）連鎖分析。

對于嵌合型Turner 綜合征患者，PGT 采用微陣列-比較基因組雜交技術(shù)（microarray comparative genomic hybridization，a-CGH）?；顧z細(xì)胞采用PicoPlex 法（DNA Amplification Kit，Takara，日本）進(jìn)行WGA，擴(kuò)增產(chǎn)物使用GenetiSure 芯片（Agilent，美國）進(jìn)行檢測，檢測胚胎23 對染色體，篩除非整倍體及拷貝數(shù)變異10 Mb 以上缺失或重復(fù)的胚胎。

1.2.3 胚胎移植與隨訪根據(jù)PGT 結(jié)果，擇期選擇可移植胚胎進(jìn)行解凍移植。移植后14 d 檢測尿及血HCG，35 d B 超可觀察到妊娠囊，即可確認(rèn)為臨床妊娠。妊娠18～24 周行羊水穿刺產(chǎn)前診斷，并隨訪臨床結(jié)局。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

18 例患者年齡24～40 歲，其中核型45，X患者2 例，嵌合45，X 患者11 例（包括45，X/46，XX 患者9 例；45，X/47，XXX 患者1 例；45，X/47，XXX/46，XX 患者1 例），X 染色體結(jié)構(gòu)異?；颊? 例，見表1。

表1 患者的核型和基本資料Tab.1 Karyotype and basic information of the patients

18 例患者中病例2、6 和8 的抗苗勒管激素（anti-M ü llerian hormone，AMH）水平低，均小于1.1 ng/mL；病例13 的竇卵泡數(shù)（antral follicle count，AFC）少于5 個，見表1。

18 例患者中有12 例為繼發(fā)不育：病例15 無流產(chǎn)史，病例6 和7 因胎兒畸形而引產(chǎn)，其余病例均因胚胎停育而流產(chǎn)。病例5、7、15、16 和17 均有分娩史，除病例7 早順產(chǎn)1 男嬰不明原因夭折外，4 例患者分娩4 個健康新生兒（3 女1 男），患者主訴均體健，但未查染色體，見表1。

2.2 超促排卵與胚胎發(fā)育

18 例患者共進(jìn)行了24 個取卵周期，以拮抗劑方案為主，卵泡生長未見明顯異常，但在獲卵方面，病例1、4、7 和12 均較差，獲卵率不超過50%。病例4 的第2 個周期因無成熟卵未行ICSI 授精，而病例6 獲卵3 個，僅1 個成熟卵。病例4（第3 個周期）以及病例6 的成熟卵經(jīng)ICSI授精后，均未受精。胚胎發(fā)育方面，除6 例患者（病例1～6）外，余12 例均有形成可活檢囊胚，見表2。

表2 患者的胚胎發(fā)育情況Tab.2 Embryonic development

2.3 PGT 結(jié)果

12 例患者共活檢61 個胚胎：全基因組擴(kuò)增失敗1 個，明確診斷60 個。其中整倍體胚胎29 個，染色體異常胚胎25 個，嵌合體胚胎6 個，染色體異常率達(dá)41.7%。

6 例患者胚胎染色體異常率均超過50%，分別為病例7、8、13、14、17 和18。25 個染色體異常胚胎中，性染色體異常胚胎僅有2 個，分別為攜帶母源X 染色體結(jié)構(gòu)異常和X 染色體單體，常染色體則以1 號、5 號、16 號和22 號染色體異常為多見，見表3。

表3 染色體異常胚胎具體情況Tab.3 The details of chromosomal abnormal embryos

2.4 臨床結(jié)局

截止2023 年6 月30 日，12 例行PGT 患者中，有1 例患者無可移植胚胎，3 例患者有可移植胚胎但未解凍移植，8 例患者進(jìn)行了9 個周期的單囊胚解凍移植，7 例（7/9，77.8%）獲臨床妊娠，其中4 例已分娩4 個健康男嬰，3 例持續(xù)妊娠中，見表4。

表4 胚胎移植及妊娠結(jié)局Tab.4 Embryo transfer and pregnancy outcomes

3 討論

3.1 Turner 綜合征患者的臨床特征

Turner 綜合征的染色體核型種類較多，患者臨床表型復(fù)雜[3，6]。核型表型間缺乏顯著的相關(guān)性，對于有生育要求的Turner 患者應(yīng)結(jié)合具體臨床病史，綜合分析核型、卵巢儲備能力等，進(jìn)行詳細(xì)的篩查和咨詢。本研究18 例患者以嵌合型Turner 為主，均無性腺發(fā)育不良；1 例出現(xiàn)肘外翻的特殊軀體特征；有7 例身材矮小，其中病例6 和7 患者存在決定身高的Xp11-22 區(qū)域[7]范圍內(nèi)缺失；有4 例患者AMH 水平或AFC 檢查，均提示存在POI[8]，其他患者則無典型的POI 癥狀，這可能是因為缺失的X 染色體出現(xiàn)失活偏離，從而導(dǎo)致其表型正常[9]，或者是因為外周血的異常細(xì)胞比例不一定代表其他組織細(xì)胞的真實情況，因而外周血核型嵌合比例不能完全預(yù)測表型[10]。研究表明，核型為45，X 的Turner 患者是有可能自然受孕的，嵌合型和自發(fā)月經(jīng)初潮的患者自然受孕的可能性更高[11]，但是Turner 患者自發(fā)妊娠后不良妊娠結(jié)局發(fā)生率較高[3]。本研究12 例患者有妊娠史，包括1 例核型45，X 的Turner 患者和11 例嵌合型Turner 患者，共27 次妊娠，自然流產(chǎn)19 次，與上述研究報道相似。

3.2 Turner 綜合征患者胚胎的染色體異常情況

隨著年齡的增長，Turner 患者的卵巢儲備能力迅速降低，自發(fā)妊娠的可能性下降，輔助生殖技術(shù)成為有生育要求的Turner 患者妊娠的途徑之一。鑒于Turner 患者有可能生育染色體異?；純?，目前多數(shù)學(xué)者建議Turner 患者選擇PGT 助孕治療[12-14]，但也有學(xué)者持相反觀點[15]。在輔助生殖技術(shù)中以女方年齡≥38 歲為高齡。本研究18 例患者有年輕患者也有高齡患者，但卵巢功能均尚未衰竭，結(jié)合病史，在經(jīng)過詳細(xì)的篩查和咨詢，所有患者均選擇嘗試自卵PGT 助孕。促排卵后少數(shù)患者的獲卵數(shù)和成熟卵數(shù)并不理想，可能是由于Turner 患者與高發(fā)生率的卵成熟障礙引起的[16]。核型45，X 的Turner 患者大多數(shù)無生育力，選擇接受贈卵治療，目前僅Li 等[15]報道1 例29 歲女性通過自卵PGT 助孕獲得1 枚整倍體胚胎。本研究2 例核型45，X 的Turner 患者均無活檢胚胎形成，與Liao 等[13]的報道一致，僅1 例X 染色體結(jié)構(gòu)異?；颊吆?1 例嵌合Turner 患者有可活檢囊胚形成?；顧z胚胎PGT 結(jié)果顯示，染色體異常率41.7%，略低于Li 等[15]報道的46.82%。另外，本研究有5 例患者胚胎染色體異常率超過50%，其中4 例為45，X/46，XX 患者，包括1 例高齡（≥38 歲）但低嵌合比例（≤10%）的患者、2 例年輕（＜38 歲）但高嵌合比例（＞10%）的患者和1 例高齡合并高嵌合比例患者，1 例為高齡合并45，X/47，XXX/46，XX 患者，與Li 等[14]認(rèn)為對胚胎影響更嚴(yán)重的是女性年齡，而不是X 染色體異常的觀點似乎不完全一致，這可能與筆者的病例數(shù)較少而缺乏數(shù)據(jù)支持有關(guān)。但有趣的是，筆者同樣發(fā)現(xiàn)X 染色體在胚胎中畸變頻率并不高，相反地，常染色體以16 號和22 號染色體異常更為常見。這可能是由于16 號和22 號染色體更易受減數(shù)分裂錯誤的影響以及胚胎發(fā)生過程中對這些常染色體異常有更高的耐受性引起的[15]。

3.3 Turner 綜合征患者行PGT 助孕后的臨床結(jié)局

本研究8 例嵌合Turner 患者，其中4 例為年輕但高嵌合比例的患者，4 例為或高齡或復(fù)發(fā)流產(chǎn)或男方因素合并低嵌合比例的患者，進(jìn)行9 個單囊胚解凍移植周期。除1 例年輕但高嵌合比例的患者未獲妊娠外，其余患者均獲臨床妊娠：有4 例已分娩4 個健康男嬰，產(chǎn)前診斷檢測核型3個正常，1 個新發(fā)染色體平衡易位，另外3 例持續(xù)妊娠中。以上結(jié)果提示嵌合型Turner 患者，高嵌合比例患者或合并其他PGT 適應(yīng)癥的低嵌合比例患者，通過PGT 選擇可移植胚胎，可獲得良好的妊娠結(jié)局，與Liao 等[12-14]學(xué)者的觀點一致。

綜上所述，Turner 綜合征染色體核型種類較多，患者臨床表型各不相同，輔助生殖助孕前應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的評估與咨詢，充分告知PGT 助孕預(yù)后差異較大。對于有活檢胚胎的Turner 患者，通過PGT 能有效篩選可用胚胎，獲得理想的臨床結(jié)局。