云南地區(qū)結(jié)核病患者與HBV、HCV、HIV 共感染免疫功能及耐藥性研究

王曉燕 ，李 婭 ，何成祿 ，王 霖 ，馬志強(qiáng) ，萬鑫蕊

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，云南 昆明 650032;2）昆明市第三人民醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650301）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）、肝炎及艾滋?。╝cquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是我國主要的三大慢性傳染性疾病。TB 為慢性消耗性疾病，可導(dǎo)致人體免疫功能全面下降，從而增加了人體對其它相關(guān)病原體的易感性，易與乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）共感染[1]。臨床上結(jié)核病合并慢性 HBV 感染可能導(dǎo)致抗結(jié)核療效下降甚至需中斷治療[2]。在我國TB 患者中HCV 感染的比例約1.6%～6.7%[3]，2020 年全球約有新增21.4 萬HIV 檢測陽性患者死于結(jié)核病，死亡人數(shù)較前增加、發(fā)病率下降趨勢緩慢[4]。當(dāng)結(jié)核合并感染以上病毒時，兩者相互影響、相互促進(jìn)，可使患者病情迅速惡化，使得結(jié)核病的防治工作更加困難。因此，分別研究云南地區(qū)結(jié)核病患者與HBV、HCV、HIV 共感染的感染率、免疫功能及耐藥性具有重要意義。本研究通過討論結(jié)核病合并感染HBV、HCV、HIV 感染率、免疫功能及耐藥性狀況，為本地區(qū)結(jié)核病合并感染HBV、HCV 及HIV 的診治、預(yù)防及控制方案的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究根據(jù)《結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)》（WS288-2017）[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一即結(jié)核分枝桿菌核酸檢測（tuberculosis-deoxyribonucleic acid，TB-DNA）陽性，收集了昆明市第三人民醫(yī)院2020 年4 月至2023 年3 月間收治的云南結(jié)核病患者共2 271例，其中男性1 617 例，女性654 例，年齡15～96 歲，平均（49.35±18.5）歲。以單純性結(jié)核患者為對照組（n=1 410），結(jié)核病分別合并HBV、HCV、HIV 感染為研究組（n=861）。排除不同病程和抗艾滋病病毒治療等相關(guān)因素，及結(jié)核病同時合并感染以上2 種或3 種病毒。本研究經(jīng)過昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會審查通過（KSLL 20230320007）。

1.2 實驗方法

收集檢測陽性患者的血清3 mL、靜脈血3 mL及其TB-DNA 檢測陽性菌液。采用實時熒光定量（polymerase chain reaction，PCR）法、“乙肝5 項”乳膠法、膠體金法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法定量法、蛋白免疫印跡法（Western blot）等檢測患者的TB-DNA、HBV、HBsAg 及乙肝兩對半、HCV、HIV 等；采用流式細(xì)胞法檢測患者CD3+T、CD4+T 和CD8+T 等淋巴細(xì)胞；采用熒光PCR 熔解曲線法檢測結(jié)核菌一線藥利福平、異煙肼、乙胺丁醇、及鏈霉素耐藥基因。

1.3 儀器及試劑

TB-DNA 檢測試劑盒由上海伯杰生物有限公司提供，儀器采用美國伯樂熒光定量PCR 儀CFX96 及全自動核酸提取儀NP968-C；HBV 初篩采用艾博生物醫(yī)藥公司乙肝病毒表面抗原及抗體、核心抗體、e 抗原及e 抗體檢測試劑盒（乳膠法），確認(rèn)采用深圳新產(chǎn)業(yè)生物乙肝病毒表面抗原及抗體、核心抗體、e 抗原及e 抗體檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法），儀器采用全自動化學(xué)發(fā)光測定儀MAGLUM4000Plus；HCV 首篩采用英科新創(chuàng)丙肝病毒抗體檢測試劑盒（膠體金法），確認(rèn)采用上?？迫A生物丙肝病毒抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法），儀器采用HB-500E 全自動酶聯(lián)免疫分析儀，浙江嘉興科瑞迪生產(chǎn)；HIV 初篩采用英科新創(chuàng)人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒（膠體金法），確認(rèn)采用免疫印跡法；淋巴細(xì)胞采用深圳邁瑞生物CD3/CD8/CD45/CD4 檢測試劑（流式細(xì)胞法），儀器采用深圳邁瑞流式細(xì)胞儀Bricyte E6；結(jié)核菌耐藥基因采用熒光PCR 熔解曲線法，廈門致善生物有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素耐藥突變檢測試劑盒，儀器采用廈門致善生物有限公司全自動核酸提取儀Lab-Aid 896 及上海宏石全自動PCR 分析系統(tǒng)SLAN-96S。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS24.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，采用t檢驗；非正態(tài)分布時以中位數(shù)和四分位數(shù)M（P25，P75）描述，采用卡方檢驗或非參數(shù)Mann-Whitney 檢驗。多因素混合模型間的差異采用似然比檢驗。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般情況

2 271 例結(jié)核病患者中，結(jié)核病合并HBV 感染499 例，感染率21.97%；合并HCV 感染196例，感染率8.63%；合并HIV 感染166 例，感染率7.31%；單純結(jié)核患者1 410 例，占比62.09%。對各組不同性別和年齡段陽性情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不同年齡組結(jié)核及合并HBV、HCV、HIV 感染率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。不同性別組結(jié)核及合并HBV、HCV、HIV 感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。表明在結(jié)核及合并HBV、HCV、HIV 共感染的患者中，結(jié)核及合并HBV感染率最高，其中男性患者感染率比女性高，19～45 歲組患者感染率最高，（P=0.001）見表1。

表1 結(jié)核及合并HBV、HCV、HIV 感染分析 [n（%）]Tab.1 Analysis of tuberculosis and co-infection with HBV，HCV and HIV [n（%）]

2.2 結(jié)核病與HBV、HCV、HIV 共感染免疫狀況分析

筆者對各組患者T 淋巴細(xì)胞整體表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與單純結(jié)核病患者比較，結(jié)核合并HBV、HCV 患者CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞絕對數(shù)量表達(dá)較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；結(jié)核病合并HIV 患者CD3+、CD4+T 細(xì)胞的絕對數(shù)量表達(dá)較低，CD8+T 細(xì)胞的絕對數(shù)量表達(dá)上升，兩者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。表明在結(jié)核病與HBV、HCV、HIV 共感染的患者中，結(jié)核合并HIV 患者的免疫功能最低，見表2、圖1。

圖1 結(jié)核及合并HBV、HCV、HIV 免疫指標(biāo)分析Fig.1 Analysis of immunologic indicators of tuberculosis and combined HBV，HCV，and HIV

表2 結(jié)核及合并HBV、HCV、HIV 免疫指標(biāo)情況（）Tab.2 Tuberculosis and combined HBV，HCV，and HIV immune indicators（）

表2 結(jié)核及合并HBV、HCV、HIV 免疫指標(biāo)情況（）Tab.2 Tuberculosis and combined HBV，HCV，and HIV immune indicators（）

與單純結(jié)核比較，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01。

對免疫功能最低的結(jié)核合并HIV 患者進(jìn)行不同性別和年齡段免疫功能的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與男性患者相比，CD3+、CD4+和CD8+T 細(xì)胞絕對數(shù)量在結(jié)核合并HIV 的女性患者中有較高的表達(dá)，且差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各年齡段中，結(jié)核合并HIV 患者CD3+、CD8+T 細(xì)胞絕對數(shù)量在46～65 歲組最低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CD4+T 細(xì)胞絕對數(shù)量在19～45 歲組最低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這表明在結(jié)核合并HIV 患者中，女性患者的免疫功能要強(qiáng)于男性，見表3、圖2。

圖2 結(jié)核合并HIV 不同性別和年齡段免疫指標(biāo)Fig.2 Immunization indicators of tuberculosis combined with HIV by gender and age group

表3 結(jié)核合并HIV 不同性別和年齡段免疫指標(biāo)情況（）Tab.3 Immunological indicators of tuberculosis combined with HIV by sex and age（）

表3 結(jié)核合并HIV 不同性別和年齡段免疫指標(biāo)情況（）Tab.3 Immunological indicators of tuberculosis combined with HIV by sex and age（）

與男性比較，*P ＜ 0.05；與46～65歲比較，#P ＜ 0.05；—：無數(shù)據(jù)。

由于結(jié)核合并HIV 患者的CD3+、CD4+T、CD8+T 細(xì)胞絕對數(shù)量最低表達(dá)在各年齡段均有分布，因此筆者對其淋巴細(xì)胞絕對數(shù)量構(gòu)建嵌套模型，經(jīng)似然比檢驗，研究結(jié)果顯示，CD3+、CD4+T 和CD8+T 的絕對數(shù)量在結(jié)核合并HIV 患者中46～65 歲組的總體表達(dá)最低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。表明在結(jié)核合并HIV 患者中，46～65 歲組患者的免疫功能可能最低，見圖3。

圖3 結(jié)核合并HIV 各年齡段淋巴細(xì)胞表達(dá)差異分析Fig.3 Differential analysis of lymphocyte expression by age in TB combined with HIV

2.3 結(jié)核病與HBV、HCV、HIV 共感染耐藥情況分析

2 271 例結(jié)核病患者中，耐任意1 種一線藥（單耐藥）有391 例，總體耐藥率17.22%；其中，合并HBV 耐藥52 例，耐藥率10.42%；合并HCV 耐藥10 例，耐藥率5.10%；合并HIV 耐藥40 例，耐藥率24.10%；單純結(jié)核患者耐藥289 例，耐藥率20.50%。研究結(jié)果顯示，結(jié)核合并HBV、HCV 和HIV 共同感染的患者中，耐藥率最高的是結(jié)核合并HIV，男性患者耐藥率高于女性，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），耐藥性在不同年齡階段差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見表4。

表4 結(jié)核病與HBV、HCV、HIV 共感染耐藥情況 [n（%）]Tab.4 Tuberculosis and HBV，HCV，HIV co-infection drug resistance [n（%）]

結(jié)核病與HBV、HCV、HIV 共感染中，分析了一線抗結(jié)核藥物異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇的耐藥情況。結(jié)果表明，各組患者耐藥率均以耐利福平最高，耐異煙肼次之，各抗結(jié)核藥耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見表5。

表5 結(jié)核病與HBV、HCV、HIV 共感染各抗結(jié)核藥耐藥情況 [n（%）]Tab.5 Tuberculosis and HBV，HCV，HIV co-infection by anti-tuberculosis drug resistance [n（%）]

對耐藥率最高的結(jié)核合并HIV 感染各抗結(jié)核藥物分析，其中單耐藥以耐利福平33 例最多，占比19.88 %，異煙肼次之，為4 例；多耐藥[6-7]（結(jié)核桿菌不同時對異煙肼、利福平在內(nèi)的一種以上的一線抗結(jié)核藥物耐藥）為3 例，占比1.81 %，耐多藥（結(jié)核桿菌至少對異煙肼、利福平耐藥）為5 例，占比3.01 %，見圖4。

圖4 結(jié)核合并HIV 各耐抗結(jié)核藥物情況分析Fig.4 Analysis of TB combined with HIV by antituberculosis drug resistance

3 討論

結(jié)核病患者與HBV、HCV、HIV 混合感染可造成病毒間生物學(xué)行為改變，對彼此的自然病程造成相互影響，致感染者臨床表現(xiàn)更加復(fù)雜，增加治療難度。對TB 合并其他感染的治療不當(dāng)，易造成TB 的耐藥。根據(jù)報道2019 年約有996 萬新發(fā)病例，全球新增46.5 萬利福平耐藥結(jié)核（rifampicin resistant tuberculosis，RR-TB），其中中國位居第二。國內(nèi)感染人數(shù)約3～4 億，活動性結(jié)核患者約600 萬，全國新發(fā)結(jié)核病例83.3 萬，新發(fā)患者中耐多藥結(jié)核病人6.5 萬[8]。耐藥結(jié)核病患者臨床治療時間長、傳染性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)和心理壓力大，尤其是耐多藥肺結(jié)核患者的治愈率偏低，病死率高，給人類健康造成了嚴(yán)重危害，使得TB 防治工作變得非常復(fù)雜。

本研究通過對云南地區(qū)不同性別和年齡組結(jié)核病患者分別合并HBV、HCV、HIV 感染率進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明結(jié)核病合并HBV 感染率最高，感染率21.97%，其中男性患者感染率高于女性，患者年齡在19～45 歲組感染率占比最高。有報道指出結(jié)核病負(fù)擔(dān)重的地區(qū)常伴發(fā)高病毒性肝炎感染率，活動性結(jié)核病可以增強(qiáng)肝炎病毒的復(fù)制能力[9]。云南省最新法定傳染病報告發(fā)病數(shù)居前5位的病種依次為新型冠狀病毒感染、肺結(jié)核、病毒性肝炎、梅毒、淋病，有相關(guān)流行病學(xué)研究顯示我國乙型病毒性肝炎感染率高達(dá)7.2%[10]。云南地區(qū)結(jié)核病合并HBV 感染率高可能與HBV 主要通過血液傳播，而云南是邊疆省份，其特殊的地理環(huán)境、民族環(huán)境和社會環(huán)境導(dǎo)致毒品犯罪在云南省各類犯罪中占比大，通過靜脈注射毒品感染風(fēng)險高有關(guān)。晁春梅等[11]研究顯示，云南省男性血清陽性隱匿性乙肝病毒感染陽性明顯高于女性，可能與中青年男性社會活動性較為豐富，暴露及接觸感染的可能性高于女性有關(guān)。李濤等[12]調(diào)查研究顯示，結(jié)核感染中除14 歲以下兒童外，15～45 歲年齡段結(jié)核感染率相對較高。這一研究表面從性別和年齡上看，結(jié)核合并HBV 感染在云南地區(qū)基本符合上述研究結(jié)果。

本研究通過對云南地區(qū)結(jié)核病患者分別合并HBV、HCV、HIV 感染免疫功能進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，云南地區(qū)結(jié)核病合并HIV 感染患者的免疫功能最低，可能與結(jié)核病與HIV 共同感染對患者的免疫調(diào)節(jié)有協(xié)同作用有關(guān)，HIV 感染損害細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能，主要是通過使CD4+T 淋巴細(xì)胞發(fā)生缺損，免疫功能遭到破壞，結(jié)核通過提高艾滋病病毒的復(fù)制和強(qiáng)化艾滋病病毒的免疫抑制作用而受到損害[13]，因此HIV 感染者免疫功能最低，可加快HIV 疾病進(jìn)展。在結(jié)核合并HIV 患者中，女性患者的免疫功能要強(qiáng)于男性，可能與女性較少有吸煙嗜酒等不良生活習(xí)慣及女性體內(nèi)免疫球蛋白含量比男性多有關(guān)，其天然免疫防御功能自然也較強(qiáng)。本研究還顯示46～65 歲組患者的免疫功能最低，可能隨著年齡增長，人體的免疫系統(tǒng)也逐步衰減加之結(jié)核與HIV 雙重感染導(dǎo)致年齡相對大的人群免疫功能更低。與未感染艾滋病病毒的人相比，肺結(jié)核已成為艾滋病患者或HIV 感染者常見的死亡原因之一，艾滋病感染者發(fā)生結(jié)核的危險性約增加20～37 倍[14]。因此，在治療結(jié)核病合并HIV 感染時重點關(guān)注其免疫功能，提高此類患者免疫功能有助于臨床治療。

本研究最后通過對云南地區(qū)結(jié)核病與HBV、HCV、HIV 共感染耐藥情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，云南地區(qū)2 271 例結(jié)核病患者中，總體耐藥率17.22%，唐柳生等[15]研究中報道廣西地區(qū)223 例艾滋病合并結(jié)核患者的總耐藥率為8.1%，而王娟娟等[16]報道南京地區(qū)HIV/AIDS 合并結(jié)核分枝桿菌感染總耐藥率分別為24.07%，王印等[17]研究結(jié)果顯示成都地區(qū)艾滋病合并結(jié)核分枝桿菌感染的總耐藥率為26.02%，表明不同的地域是有差別的，這可能跟不同的地域有不同的治療策略有關(guān)系。

在結(jié)核病合并HBV、HCV、HIV 共感染的患者中，結(jié)核分枝桿菌單耐藥率分別為10.42%、5.10%、24.10%，其中耐藥率最高的是結(jié)核合并艾滋病病毒，男性患者耐藥率比女性高，有文獻(xiàn)報道HIV 合并結(jié)核分枝桿菌感染者總體耐藥率和耐多藥發(fā)生率明顯增加[18]，結(jié)核合并HIV 耐藥率高于HBV、HCV 可能與兩者雙重感染免疫功能更差導(dǎo)致抗結(jié)核治療困難，而易造成結(jié)核合并HIV耐藥發(fā)生。

對耐藥率最高的結(jié)核合并HIV 感染各抗結(jié)核藥物分析，其中單耐藥以耐利福平33 例最多，占比19.88 %，異煙肼次之，為4 例；在2019 年中國利福平耐藥率為7.8%，2019 年云南省全省報告利福平耐藥率為6.7%，而本文結(jié)果顯示利福平耐藥率顯著高于2019 年全國及全省耐藥率[19]，這主要與利福平和異煙肼是抗結(jié)核常用一線基礎(chǔ)藥，可能受新冠疫情的影響未規(guī)范接受抗結(jié)核治療或未積極開展藥敏檢測導(dǎo)致。

綜上所述，云南地區(qū)結(jié)核病合并HBV 感染率最高，結(jié)核病合并HIV 患者的免疫功能最差，結(jié)核病合并HIV 的耐藥率最高。因此，應(yīng)加強(qiáng)對結(jié)核感染人群進(jìn)行HBV、HCV、HIV 感染預(yù)防、檢測篩查等，減少結(jié)核病患者與HBV、HCV、HIV共感染耐藥發(fā)生，加強(qiáng)云南地區(qū)結(jié)核病防治策略，提高結(jié)核病的診療和檢測質(zhì)量，特別是利福平的用藥指導(dǎo)，患者初治前充分利用先進(jìn)技術(shù)加大耐藥篩查力度，在合理制定抗病毒治療策略的同時，盡可能使用最敏感的藥物降低初治耐藥率，同時還要合理制定抗病毒治療策略，在治療過程中可及時監(jiān)測耐藥及病毒載量情況，及時調(diào)整治療方案，從而提高患者的整體療效，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和疾病帶來的痛苦，減少耐藥性結(jié)核的傳播和乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病病毒感染的發(fā)生。