利用小麥-黑麥1BL.1RS易位系快速篩選F2群體中攜帶抗條銹病基因Yr15的純合個(gè)體

鄒 楊，符書蘭，唐宗祥

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物遺傳育種省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130）

條銹病是危害小麥生產(chǎn)的真菌性病害。利用抗病基因是防治小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)、有效的途徑。對已有的條銹病抗性基因進(jìn)行評(píng)價(jià)，可為條銹病抗性基因的應(yīng)用提供參考。對103份攜帶已知抗性基因的小麥品系進(jìn)行條銹病抗性鑒定，結(jié)果表明僅Yr5、Yr15和Yr45對我國當(dāng)前流行的生理小種表現(xiàn)全生育期抗性[1]。這些基因?yàn)樾←湕l銹病抗性育種提供了很好的資源。早在2007年就有報(bào)道指出，四川的小麥育種者已利用Yr5和Yr15進(jìn)行小麥條銹病抗性育種，而且對Yr15的利用更多[2]?？剐曰験r15來自野生二粒小麥[3]，被定位在1B染色體短臂（1BS）遠(yuǎn)端[4]，并且該基因已被克隆[5]。盡管Yr15對條銹病具有很好的抗性，但就全國范圍而言，還沒有被大量應(yīng)用。對107個(gè)不同年份審定的山東小麥品種以及2019—2020年參加山東省區(qū)試的126 份品系進(jìn)行了抗條銹病基因的檢測，沒有發(fā)現(xiàn)Yr15的存在[6-7]。在243 份云南普通小麥地方品種中，也沒有檢測到Y(jié)r15的存在[8]。青海的少量小麥品種（系）含有Yr15基因[9]。這些研究表明，Yr15還可以充分加以利用。

在利用抗病基因Yr15進(jìn)行小麥育種的過程中，從分離世代中快速檢測純合個(gè)體有利于加快其應(yīng)用進(jìn)程。雖然Yr15有了相應(yīng)的功能標(biāo)記[5]，可以被用來準(zhǔn)確鑒定植株是否含有該基因，但該標(biāo)記無法區(qū)分純合與雜合植株[5]。因而在進(jìn)行選擇時(shí)，只能混收雜合植株和純合植株，這會(huì)增加后續(xù)選擇的工作量。另外，利用分子標(biāo)記進(jìn)行檢測，涉及DNA 提取、PCR和電泳等較為繁瑣的過程。為了克服分子標(biāo)記的缺點(diǎn)，可以探索一種新的途徑，既可以起到分子標(biāo)記的效果，又能快速區(qū)分含抗病基因的純合與雜合個(gè)體?；诖?，本研究利用Yr15位于1BS上的特點(diǎn)，以含該基因的品系為親本，與感病的小麥-黑麥1BL.1RS 易位系雜交，然后利用基于寡核苷酸探針的簡便ND-FISH技術(shù)[10]，對F2分離群體進(jìn)行鑒定。簡便ND-FISH 技術(shù)不需提取基因組DNA，也不需要PCR和電泳過程，可以利用根尖或幼嫩葉片快速簡便地獲得間期細(xì)胞核，然后利用特異寡核苷酸探針對間期細(xì)胞核進(jìn)行ND-FISH分析[10]，可以快速排除含1BL.1RS 易位染色體的植株，從而確定含Yr15基因的純合個(gè)體。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為抗條銹病小麥品系F6718和感條銹病小麥-黑麥1BL.1RS 易位系21T248-21。品系F6718 不含1BL.1RS 易位染色體，其系譜為20828-11/13-3Y-2。20828-11高抗條銹病，由中國科學(xué)院成都生物所吳瑜研究員提供。13-3Y-2 來自綿陽11與黑麥Kustro 的雜交后代，為1R 單體附加系，高感條銹病。21T248-21為13-3Y-2的輻射后代。普通小麥中國春用作基因檢測的對照。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 條銹病抗性鑒定

以1BL.1RS 易位系21T248-21 為母本，品系F6718為父本雜交，F(xiàn)1植株套袋自交獲得F2群體，種于溫江公平鎮(zhèn)。用混合條銹菌CYR32、CYR33 和CYR34對親本、F1和F2植株進(jìn)行接種鑒定。成株期按照0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定條銹病抗感情況[11]。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)鑒定

利用ND-FISH技術(shù)對F6718、21T248-21以及F1植株的根尖中期染色體進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。根尖中期染色體制備參照Han F.等描述的方法[12]。ND-FISH參照Fu S.等描述的方法[13]。所用探針為OligopSc119.2-1[14]和Oligo-1RNOR[10]。此外，剪取F2單株的根尖或幼嫩葉片，采用簡便ND-FISH方法對F2單株進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，各步驟參照張蔚等的方法執(zhí)行[10]。

1.2.3 分子標(biāo)記檢測

供試材料F6718、21T248-21、20828-11、綿陽11、中國春以及F6718 與21T248-21 雜交后代的基因組DNA 提取參照已報(bào)道的改良方法[15]。利用檢測Yr15特異的功能標(biāo)記Y15K1_F2:GGA GAT AGA GCA CAT TAC AGA C; uhw301R:TTT CGC ATC CCA CCC TAC TG 對基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增[5]。PCR程序和瓊脂糖電泳參照習(xí)玲等報(bào)道的方法執(zhí)行[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本F6718、21T248-21 和F1植株細(xì)胞學(xué)及條銹病抗性鑒定

探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-1RNOR相結(jié)合能夠識(shí)別小麥1B染色體和小麥-黑麥1BL.1RS易位染色體。探針Oligo-1RNOR 能夠特異性地在黑麥1RS臂的核仁組織區(qū)產(chǎn)生信號(hào)[10]。根據(jù)這兩個(gè)探針的信號(hào)，可以看出小麥品系F6718 含1 對1B 染色體（圖1A），而21T248-21 含1 對1BL.1RS 易位染色體（圖1B）。來自F6718×21T248-21的F1植株含1條1B染色體和1條1BL.1RS易位染色體（圖1C）。田間條銹病抗性鑒定表明，親本F6718和雜交F1植株高抗條銹?。▓D1D），親本21T248-21高感條銹?。▓D1D）。

圖1 親本F6718、21T248-21以及雜交F1的根尖中期染色體ND-FISH分析和條銹病抗性鑒定Figure 1 ND-FISH analysis of the root-tip metaphase chromosomes of F6718,F1 plant and 21T248-21,and stripe rust resistance test

2.2 F2代植株細(xì)胞學(xué)及條銹病抗性鑒定

以O(shè)ligo-1RNOR為探針，用簡便ND-FISH方法對F6718 和21T248-21 的雜交F2植株進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。共鑒定了188 個(gè)單株。其中46 個(gè)單株沒有Oligo-1RNOR 信號(hào)，表明這些植株含1 對1B 染色體，不含1BL.1RS 易位染色體（圖2A）。106 個(gè)單株中都只觀察到1個(gè)Oligo-1RNOR信號(hào)（圖2B），表明這些植株含1條1B染色體和1條1BL.1RS易位染色體。在36 個(gè)單株中觀察到2 個(gè)Oligo-1RNOR 信號(hào)（圖2C），因而這些植株含1對1BL.1RS易位染色體。由此可以看出，利用寡核苷酸探針Oligo-1RNOR和ND-FISH技術(shù)對葉片間期核進(jìn)行分析，能夠排除分離群體中含Yr15基因的雜合個(gè)體。F2分離群體中，凡是含1對1BL.1RS易位染色體的植株都高感條銹病，其余的都高抗條銹?。▓D2D，E）。隨機(jī)選取3株含1對1B染色體植株套袋自交，從每株自交后代中隨機(jī)選取60 粒種子種于溫江，經(jīng)接種鑒定，都高抗條銹病，沒有發(fā)現(xiàn)抗感分離的情況。這表明這些植株含純合的抗病基因。

圖2 簡便ND-FISH技術(shù)分析F2植株的葉片間期細(xì)胞及植株條銹病抗性鑒定Figure 2 Simple ND-FISH analysis of interphase cells derived from leaves of F2 plants and stripe rust resistance test

2.3 確定F6718中的抗病基因

根據(jù)F2分離群體的染色體組成和抗病情況，可以推測F6718的1B染色體攜帶條銹病抗性基因，估計(jì)該基因?yàn)閅r15的可能性較大。因此利用Yr15特異的功能標(biāo)記對參試材料進(jìn)行了擴(kuò)增。在F6718、20828-11、雜交F1植株以及含1B 的F2植株中都擴(kuò)增出了目標(biāo)條帶，而在21T248-21、綿陽11和含1對1BL.1RS 易位染色體的F2植株中沒有擴(kuò)增出條帶（圖3）。這一結(jié)果表明F6718含有Yr15基因，該基因來源于20828-11。

圖3 用特異分子標(biāo)記檢測供試材料中的Yr15基因Figure 3 Detecting the presence of gene Yr15 in the materials used in this study using its specific marker

3 討論

條銹病抗性基因Yr15對當(dāng)前流行的條銹菌生理小種仍具有很好的抗性[1]。本研究所用的小麥品系F6718 含Yr15基因，可以用作條銹病抗性育種的親本。小麥育種過程中，通過有性雜交進(jìn)行抗病基因的轉(zhuǎn)育仍然是小麥抗病育種的主要途徑。為此，盡早在F2分離群體中確定純合抗病個(gè)體可減少后續(xù)選擇的盲目性，從而減少選擇的工作量。分子標(biāo)記是檢測小麥植株是否含有目標(biāo)基因的常用方法[6-8]。然而，利用分子標(biāo)記進(jìn)行篩選時(shí)，會(huì)出現(xiàn)含有抗性標(biāo)記目標(biāo)條帶的材料不一定含有相應(yīng)抗病基因的情況[2,16]。而且，Yr15的功能標(biāo)記不能鑒別分離群體中的雜合個(gè)體和純合個(gè)體。就Yr15基因而言，本研究利用1BL.1RS 易位染色體和簡便NDFISH技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確地鑒別分離群體中含Yr15基因的雜合個(gè)體和純合個(gè)體，從而針對純合Yr15個(gè)體進(jìn)行選擇。其原理為：F1植株的減數(shù)分裂過程中，1B 染色體長臂（1BL）能與1BL.1RS 易位染色體中的1BL臂配對重組，確保F1植株中的1B染色體和1BL.1RS 易位染色體能在減數(shù)分裂過程中正常分離。而1BS 和1RS 不會(huì)發(fā)生重組，這就保證1BS 染色體臂攜帶的Yr15基因不會(huì)被重組掉。繼而通過簡便ND-FISH 方法，快速準(zhǔn)確排除F2群體中含1BL.1RS 易位染色體的植株，確定含1 對1B 染色體的植株，這些植株中Yr15基因處于純合狀態(tài)，其條銹病抗性在后續(xù)世代中不會(huì)出現(xiàn)分離，這就減少了選擇的工作量。就1BL.1RS 易位染色體而言，盡管目前已有分子標(biāo)記能對其進(jìn)行鑒定，而且也能區(qū)分植株含1條還是1對1BL.1RS易位染色體[17]。然而，以上所述基于分子標(biāo)記的方法都涉及基因組DNA提取、PCR 和電泳過程，略顯繁瑣。本研究基于寡核苷酸探針的簡便ND-FISH 方法，不需要基因組DNA 的提取、PCR 和電泳過程，能快速鑒定植株中的目標(biāo)染色體，其方便快捷的特點(diǎn)已發(fā)文詳述[10]。當(dāng)從不同雜交組合的F2群體中鑒定出純合抗病個(gè)體后，它們還可以作為親本相互雜交，一方面增加了遺傳多樣性，同時(shí)也保證了目標(biāo)基因在雜交后代中也處于純合狀態(tài)。

這一方法也可以用于其他染色體攜帶的抗病基因。目前已創(chuàng)制了不少小麥-黑麥易位染色體[18]，都可以加以利用。比如，為了利用位于2B 染色體長臂上的條銹病抗性基因Yr5，可以用感病的小麥2B 染色體長臂（2BL）與黑麥染色體形成的易位系為親本，與含Yr5的抗病材料雜交，用同樣的原理和方法從F2分離群體中排除含小麥-黑麥易位染色體的植株，保留不含小麥-黑麥易位染色體的植株，就獲得了含Yr5基因的純合個(gè)體。為此，在今后的小麥-黑麥遠(yuǎn)緣雜交后代的鑒定中，可以保留不抗病的小麥-黑麥易位系。這些易位系不但可以幫助驗(yàn)證抗病基因染色體定位的正確性，還可以從F2分離群體中快速篩選純合抗病個(gè)體。事實(shí)上，就鑒定含Yr15基因的純合個(gè)體而言，只要明確了某一材料含有Yr15基因，用作親本的1BL.1RS易位系也可以是抗病的，因?yàn)檫@不影響判斷植株是否含有1 對1B 染色體，因而也不影響判斷植株是否含1對Yr15基因。用其他小麥-黑麥易位染色體選擇相應(yīng)染色體攜帶的抗病基因也是如此。然而，該方法的缺陷在于：為了增加小麥背景的遺傳多樣性，需要事先將小麥-黑麥易位染色體轉(zhuǎn)移到不同的小麥背景。

4 結(jié)論

利用小麥-黑麥1BL.1RS 易位系，借助基于寡核苷酸探針的簡便ND-FISH 技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確地從F2分離群體中鑒定出含Yr15的純合抗病個(gè)體。此方法也適用于其他抗病基因的純合個(gè)體的篩選。