自發(fā)矮小癥雌性SD 大鼠不孕的機(jī)制初探

龍紅,霍春茂,李康,包峰云,秦廷洋,趙玉佳,張仕斌

(貴州遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,貴州遵義 563000)

本課題組偶然發(fā)現(xiàn)在封閉群SD 大鼠的繁育過程中出現(xiàn)具有自發(fā)矮小特征的大鼠,在前期的表型特征及遺傳模式鑒定過程中發(fā)現(xiàn)矮小雌性大鼠不孕[1]。 不孕不育已成為一個(gè)全球性的生殖健康問題,全世界約有15%的夫妻受到影響[2],而結(jié)婚年齡、婦科手術(shù)史、甜食和卵巢儲(chǔ)備減少等都是造成不孕的因素[3]。 筆者推測SSR 雌性不孕可能與卵巢儲(chǔ)備功能下降及卵巢低反應(yīng)有關(guān)系。 本研究通過探索SSR 雌性大鼠不孕的機(jī)制,期望為人類不孕不育的研究和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7 只SPF 級雌性SSR 大鼠和3 只SPF 級野生型雌性SD 大鼠,體重分別為188 ~ 220 g 和240 ~245 g,均為9 周齡,由遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(黔)-2021-0002】,飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(黔)-2021-0004】。 大鼠在飼養(yǎng)期間均自由采食和飲水,濕度控制在40% ~ 60%,溫度控制在20 ~ 26℃,晝夜各半明暗交替。 本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批(ZMU21-2203-575)。

1.1.2 主要試劑與儀器

革蘭氏染色液(快速法)(貝索生物技術(shù)有限公司); 人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, hCG) 和孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG)(寧波第二激素廠);大鼠雌二醇(E2)ELISA 試劑盒、大鼠促卵泡素(FSH)ELISA 試劑盒、大鼠黃體生成素(LH)ELISA 試劑盒、大鼠繆勒管抑制物質(zhì)(AMH)ELISA試劑盒、大鼠孕酮(PROG)ELISA 試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)。 普通光學(xué)顯微鏡(SDPTOP US510CA)、體視鏡(OLYMPUS SZ61)、倒置顯微鏡(SDPTOP HAL)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)情周期的觀察

將野生型SD 大鼠作為對照組(WT),SSR 雌性不孕大鼠作為實(shí)驗(yàn)組(Mut),進(jìn)行動(dòng)情周期的觀察。將每只大鼠進(jìn)行編號標(biāo)記,采用陰道拭子法[4],每天9:00 采樣制作陰道涂片,直至出現(xiàn)2 個(gè)完整動(dòng)情周期。 陰道涂片及快速染色方法[5]:用生理鹽水將消毒棉簽浸濕,插入大鼠陰道口1 ~ 2 cm,輕輕旋轉(zhuǎn)3 圈,快速均勻地涂在載玻片上,待自然風(fēng)干。 滴加1 ~ 2 滴龍膽紫溶液染色10 s,水洗后甩干;滴加適量碘溶液染色10 s,水洗后甩干;加2 滴脫色液20 s, 水洗后甩干;最后加1 ~ 2 滴沙黃溶液復(fù)染10 s, 水沖洗,自然風(fēng)干,鏡檢。

1.2.2 血清AMH、E2、FSH、LH 和PROG 水平檢測

將大鼠麻醉后,頸靜脈采血1 mL,放置30 min,離心機(jī)設(shè)置3000 r/min,時(shí)間10 min,得到大鼠血清。 隨后利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測血清中AMH、E2、FSH、LH 和PROG 五項(xiàng)指標(biāo)水平。

1.2.3 促排卵觀察

10 只大鼠腹腔注射PMSG 15 IU/100 g,48 h 后腹腔注射hCG 7.5 IU/100 g,注射24 h 后,麻醉大鼠,處死。 打開腹腔,剪斷輸卵管,移至倒置顯微鏡下定位輸卵管膨大部位置,快速用針頭劃破膨大部,卵母細(xì)胞成團(tuán)自動(dòng)涌出。 用透明質(zhì)酸酶處理卵母細(xì)胞團(tuán),除掉包裹在外的卵丘顆粒細(xì)胞,鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

取野生型SD 雌性大鼠和SSR 雌性不孕大鼠各3 只,分別編號為WT01、WT02、WT03 和Mut01、Mut02、Mut03。 將其卵巢組織送中科新生命公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序。 用DESeq2 進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析,將padj < 0.05,｜log2foldchange ｜> 2 作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。 STRING 設(shè)置連接度> 0.4 繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(protein-protein interaction network, PPI); MCODE 插件中設(shè)置Degree cut-off = 2、Node Score cut-off = 0.2 及K-Core = 2 獲取模塊。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用基迪奧生信云平臺(tái)對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多樣本計(jì)量資料選擇T檢驗(yàn)分析,P< 0. 05 則表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)情周期的比較

10 只雌性大鼠陰道涂片未見異常,動(dòng)情周期均為4 ~ 5 d。 10 只雌性大鼠陰道涂片觀察完整動(dòng)情周期變化如圖1。 實(shí)驗(yàn)組體重顯著低于對照組,卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)顯著高于對照組,卵巢和子宮則無顯著變化(圖2)。

圖1 動(dòng)情周期比較Figure 1 Comparison of estrous cycle

圖2 兩組之間體重、卵巢、子宮、卵巢指數(shù)及子宮指數(shù)的變化Note. Compared with WT, *P < 0.05, **P < 0.01. (The same in the following figures)Figure 2 Changes in body weight, ovaries, uterus, ovarian index and uterine index between the two groups

2.2 超排效果比較

在PMSG 15 IU/100 g + hCG 7.5 IU/100 g 劑量組合下,性成熟大鼠可以獲得最佳排卵效果[6-7]。排卵結(jié)果顯示,對照組平均排卵數(shù)量38 個(gè),顯著高于實(shí)驗(yàn)組(平均排卵數(shù)量3 個(gè))。

2.3 10 只大鼠血清AMH、E2、FSH、LH 和PROG水平比較

對照組大鼠血清AMH(P< 0.01)、E2(P<0.05)水平顯著高于實(shí)驗(yàn)組,對照組大鼠血清FSH(P< 0.01)、LH(P< 0.01)及FSH/LH(P< 0.05)水平顯著低于實(shí)驗(yàn)組,對照組大鼠血清PROG 與實(shí)驗(yàn)組比較不顯著,見圖3。

圖3 兩組之間AMH、E2、FSH、LH、FSH/LH、PROG激素的比較Figure 3 Comparison of AMH, E2, FSH, LH, FSH/LH,PROG hormones between two groups

2.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.4.1 樣品間相關(guān)性評估

樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標(biāo)。 樣品之間表達(dá)模式的相似度越高,則相關(guān)性系數(shù)越接近1。 本次測序樣本之間的相關(guān)性系數(shù)大于0.89(圖4),符合重復(fù)樣本的選擇。

圖4 樣品間相關(guān)系數(shù)熱圖Figure 4 Heat map of correlation coefficients between samples

2.4.2 差異基因的篩選

用DESeq2 進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析,將padj <0.05,｜log2foldchange ｜> 2 作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 差異基因分析顯示,與正常組相比,不孕組共有250 個(gè)差異表達(dá)基因,其中有190 個(gè)上調(diào)基因,60個(gè)下調(diào)基因(圖5)。

圖5 差異基因表達(dá)分布火山圖Figure 5 Volcano map of differential gene expression distribution

2.4.3 差異基因的分析

對獲得的250 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析。 挑選GO 三大分類中最顯著的20 個(gè)功能條目作圖(圖6),在生物學(xué)過程分類中,差異表達(dá)基因主要富集在磷酸化的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of phosphorylation)、磷脂酶活性的調(diào)節(jié)(regulation of phospholipase activity)、磷代謝過程的正調(diào)控(positive regulationof phosphorus metabolic process)等;在細(xì)胞組成分類中,主要富集在細(xì)胞外區(qū)(extracellular region)、細(xì)胞外間隙(extracellular space)等;在分子生物學(xué)分類中,主要富集在白細(xì)胞介素-1 受體結(jié)合(interleukin-1 receptor binding )、 細(xì)胞因子活性 ( cytokine activity)等。

圖6 差異基因KEGG 富集柱狀圖(TOP 20)Figure 6 KEGG enrichment histogram of differential genes (TOP 20)

挑選KEGG 富集中最顯著的20 條pathway 條目作圖分析,發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要富集在IL-17 信號通路(IL-17 signaling pathway)、p53 信號通路(p53 signaling pathway)和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體 相 互 作 用 ( cytokine-cytokine receptor interaction)等。

2.4.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及Hub 基因篩選

為更好地理解這些差異基因間的相互關(guān)系,應(yīng)用TRING 蛋白互作數(shù)據(jù)庫繪制PPI 圖(圖7)。

圖7 差異基因的蛋白互作圖Figure 7 Protein-protein interaction (PPI) network

使用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件創(chuàng)建分子模塊,設(shè)置分?jǐn)?shù)大于4,獲得2 個(gè)功能模塊。 在圖8 中,基因Cxcl1、Cxcl2、IL1a、IL1b、Cd80、Mmp13、Mmp8、 Fgf3、 Ptgs2 聚集在模塊1 中。 再使用CytoHubba 插件的MCC、MNC、EPC 和Degree4 種拓?fù)溆?jì)算法分別篩選前10 的重要節(jié)點(diǎn),作VEEN 圖取交集(圖9),最后獲得9 個(gè)Hub 基因,分別為Cxcl1、Cxcl2、IL1a、IL1b、Cd80、Mmp13、Mmp8、Fgf3、Ptgs2

圖8 2 個(gè)MCODE 測定分?jǐn)?shù)> 4 的關(guān)鍵模塊Figure 8 Two key modules with score > 4 were detected by MCODE

圖9 MCC、MNC、EPC 和Degree 插件的Hub基因VENN 圖Figure 9 VENN diagram screening Hub gene with MCC,MNC, EPC and Degree

基因。 模塊1 中的基因與篩選的9 個(gè)Hub 基因完全重疊,推測該模塊的9 個(gè)基因是SSR 雌性大鼠不孕的關(guān)鍵基因。

3 討論

本課題在研究過程中發(fā)現(xiàn),SSR 大鼠部分雌性大鼠不孕,為探究其不孕機(jī)理展開了研究。 動(dòng)情周期檢測結(jié)果顯示,不孕大鼠和正常大鼠的動(dòng)情周期未見異常,但超排后,不孕大鼠的排卵數(shù)顯著低于正常組。 因此,本研究結(jié)果提示SSR 雌性不孕大鼠的卵巢儲(chǔ)備功能發(fā)生障礙。

目前,臨床上將AMH、FSH、LH、E2 作為卵巢功能評估的常用指標(biāo)。 AMH 是臨床上評估卵巢儲(chǔ)備功能和卵巢反應(yīng)性的首選生物標(biāo)志物,其值大小與卵母細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)[8-9]。 本研究中SSR 雌性不孕大鼠血清AMH 水平顯著低于正常組,對應(yīng)排卵數(shù)也顯著低于正常組。 有研究結(jié)果表明,與空白對照組相比,卵巢儲(chǔ)備功能減退大鼠的血清AMH 和E2 水平顯著降低,FSH 和LH 水平顯著增加[6-10],與本研究結(jié)果相符。 有研究表明FSH/LH 能夠預(yù)測卵巢的反應(yīng)性,并評估不孕患者卵巢儲(chǔ)備功能[11]。王紫微等[12]研究表明,隨著FSH/LH 的升高,卵巢低反應(yīng)的發(fā)生率也隨之增加。 周洪梅等[13]的研究發(fā)現(xiàn),FSH/LH 在卵巢高反應(yīng)、卵巢正常反應(yīng)和卵巢低反應(yīng)中呈逐漸升高的趨勢。

為探究SSR 雌性不孕大鼠的病理機(jī)制,本課題組采用轉(zhuǎn)錄組測序方法來分析其不孕機(jī)理。 結(jié)果顯示,與對照組相比,不孕組獲得250 個(gè)差異表達(dá)基因,其中有190 個(gè)上調(diào)基因,60 個(gè)下調(diào)基因。 將差異基因作富集分析,發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要富集在IL-17 信號通路、p53 信號通路和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等。 有研究報(bào)道,在美洲長春花小肽(small peptides from periplaneta americana,SPPA)改善過氧化氫誘導(dǎo)的人類顆粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn),S100A7、S100A9、RELA 和IL17RE參與IL-17 信號通路,在抵抗細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用[14]。

本研究篩選的Hub 基因中,IL1a、IL1b 主要由受刺激的單核細(xì)胞產(chǎn)生,是炎癥過程的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子,被推測在慢性炎癥疾病中發(fā)揮作用[15]。 衰老的Nlrp3-/-小鼠和同齡的野生型小鼠相比,卵巢中主要的促炎癥基因IL1a、IL1b 表達(dá)水平降低,巨噬細(xì)胞浸潤減少,卵泡儲(chǔ)備量增加[16]。 本研究中,IL1a、IL1b 表達(dá)上調(diào),可能導(dǎo)致卵泡儲(chǔ)備減少。

Cxcl1 和Cxcl2 屬于CXC 類趨化因子家族中的成員之一,能與單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞等表面受體結(jié)合,參加細(xì)胞毒效應(yīng)。 子宮內(nèi)膜中的Cxcl1 可使B 淋巴細(xì)胞選擇性外滲到子宮內(nèi)膜間質(zhì),從而引起子宮內(nèi)膜和輸卵管的炎癥[17]。 李兆萍等[18]在輸卵管阻塞性不孕的臨床治療研究中發(fā)現(xiàn),經(jīng)治療后,不孕患者的血清Cxcl1 水平降低了。

Mmp8 和Mmp13 基因是編碼單核細(xì)胞來源的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的基因,MMPs 參與卵泡發(fā)生、卵泡閉鎖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的重塑過程[19],是人類排卵的關(guān)鍵因素[20]。 研究報(bào)道,MMP、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)等相互協(xié)調(diào)作用紊亂會(huì)破壞ECM 的合成與降解的穩(wěn)態(tài),形成卵巢纖維化[21],導(dǎo)致不孕。 本研究中,SSR 雌性不孕大鼠中MMP 均上調(diào),推測ECM 穩(wěn)態(tài)失衡,引起卵巢纖維化發(fā)展。

Ptgs2 是前列腺素合成過程中的限速酶,在炎癥和有絲分裂過程中被誘導(dǎo),其表達(dá)影響卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張、成熟、分化等,并在DOR 患者中表達(dá)上調(diào)[22]。黃龍[23]的研究發(fā)現(xiàn),Ptgs2 在閉鎖卵泡中高表達(dá),并且促進(jìn)了豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。

綜上所述,SSR 雌性大鼠不孕可能是由卵巢儲(chǔ)備功能減退和卵巢低反應(yīng)引起的。 250 個(gè)表達(dá)差異基因主要富集在IL-17 信號通路、p53 信號通路和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等通路。 蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果顯示,Cxcl1、Cxcl2、IL1a、IL1b、Cd80、Mmp13、Mmp8、Fgf3、Ptgs2 可能是SSR 雌性大鼠不孕的關(guān)鍵蛋白。 本研究結(jié)果提示SSR 雌性大鼠不孕可能與卵巢顆粒細(xì)胞纖維化或凋亡有關(guān),進(jìn)一步的具體機(jī)制研究需深入探索。