基于生物信息學(xué)分析干燥綜合征伴發(fā)疲勞機(jī)制及中藥預(yù)測研究?

王夢潔,劉 英,黃 迪

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),濟(jì)南 250300;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,濟(jì)南 250000)

干燥綜合征(sj?gren syndrome,SS)是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病,其組織學(xué)特征為外分泌腺的淋巴細(xì)胞浸潤,主要通過小唇唾液腺活檢確定。SS是僅次于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的第2大自身免疫性疾病,其臨床特征除口眼干燥之外,大多還伴有疲勞、關(guān)節(jié)疼痛和全身癥狀[1],約2%～5%的患者可并發(fā)淋巴瘤[2],這是SS患者死亡的主要原因。單純的SS主要影響患者的生活質(zhì)量,很少致死,其中疲勞癥狀的影響尤為嚴(yán)重。目前SS的主要治療原則為降低疾病活動度,緩解和預(yù)防并發(fā)癥。治療藥物主要分為局部治療藥物、免疫抑制劑、激素及生物制劑。局部緩解口眼干燥常用淚液和唾液替代品、刺激唾液分泌藥物,如匹羅卡品、塞維米林等。臨床常用的免疫抑制劑為羥氯喹[3],疾病累及多個系統(tǒng)時可加用糖皮質(zhì)激素。近年來生物制劑也是治療SS的新方法,包括TNF抑制劑英夫利昔單抗(infliximab)、依那西普(etanercept)。抗CD20單抗利妥昔單抗(rituximab)、抗B細(xì)胞活化因子(B-cell activating factor of the TNF family,BAFF)的單克隆抗體貝利尤單抗(belimumab)及托珠單抗(tocilizumab)也是潛在的有效治療藥物。但生物制劑治療SS的效果尚不明確,仍需更多的臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證[4]。

疲勞作為SS最常見的癥狀,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,研究表明SS的疲勞和生活質(zhì)量下降程度遠(yuǎn)高于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[5],但其潛在的病理生理學(xué)機(jī)制尚未充分闡明[6],并且對于疲勞程度的評估尚無公認(rèn)客觀的評價標(biāo)準(zhǔn)。有研究顯示降低SS疾病活動度可以改善患者的疲勞癥狀,但無明確證據(jù)表明疾病活動度與疲勞癥狀的相關(guān)性。SS疲勞的緩解是臨床亟待解決的問題,中醫(yī)藥治療可能會發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此未來的研究應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)關(guān)注患者生活質(zhì)量水平,深入探討SS疲勞的發(fā)生機(jī)制,最大程度從“人”出發(fā),擴(kuò)展有效治療方案。本研究通過分析SS伴發(fā)疲勞患者與健康對照人群的差異表達(dá)基因,結(jié)合中藥預(yù)測,可能為SS伴發(fā)疲勞患者的早期診斷和中藥個體化治療提供潛在的基因靶標(biāo)和思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GSE66795數(shù)據(jù)集,該數(shù)據(jù)集包含133例不同程度疲勞的SS患者和29例健康者的外周血樣本。根據(jù)患者報告的異常疲勞程度,對他們進(jìn)行0～100的視覺模擬評分[7],評分>75分被認(rèn)為是重度疲勞,<25為輕度疲勞,余為中度疲勞。隨后進(jìn)行RNA全基因組芯片分析,以研究基因的差異表達(dá)情況。

1.2 篩選差異表達(dá)基因

將全基因組芯片分析結(jié)果中的相關(guān)數(shù)據(jù)整理形成表達(dá)矩陣,進(jìn)行質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)化歸一化處理。同時基于GPL10558平臺的基因注釋信息,將探針I(yè)D轉(zhuǎn)化為基因名稱。將所有基因表達(dá)量用R/Bioconductor package limma進(jìn)行差異表達(dá)分析[8],篩選出差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。篩選條件:差異變化倍數(shù)(fold change,FC)>1.5倍,矯正后的P值(adjust.P.Value,adj.P.Val)<0.05。使用R/Bioconductor package ggplot2繪制火山圖[9],使用R/Bioconductor package pheatmap繪制熱圖[10]。

1.3 功能富集分析

為說明DEGs參與的生物學(xué)功能和信號通路,應(yīng)用R/Bioconductor package clusterProfiler對DEGs進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析[11],使用R/Bioconductor package ggplot2繪制氣泡圖[9]。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵基因

STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)是用于研究基因編碼蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)及挖掘核心調(diào)控關(guān)鍵基因的數(shù)據(jù)庫。用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEGs編碼的蛋白間相互作用(protein protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)[12],分別使用Cytoscape插件CytoHubba中的最大集團(tuán)中心度(maximal clique centrality,MCC)算法[13],選出得分排名前10位的基因作為關(guān)鍵(Hub)基因。

1.5 靶點(diǎn)對接及中藥預(yù)測

將篩選出的關(guān)鍵基因與醫(yī)學(xué)本體信息檢索平臺(Coremine Medical)(https://coremine.com/medical/)相互映射,篩選出核心基因相關(guān)的常見治療中藥(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理結(jié)果

通過R語言對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化處理,見圖1,得到探針表達(dá)矩陣。

圖1 GSE66795數(shù)據(jù)集樣本表達(dá)校正前后箱式圖

2.2 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

通過limma包分析得出,SS伴疲勞與正常對照組間共有DEGs 48個,其中2個表達(dá)下調(diào),46個表達(dá)上調(diào),見圖2,聚類分析圖中可見DEGs的變化情況,見圖3。

圖2 干燥綜合征伴發(fā)疲勞的外周血中差異表達(dá)基因的火山圖

圖3 干燥綜合征伴發(fā)疲勞的外周血中差異表達(dá)基因的聚類熱圖

2.3 GO和KEGG富集分析結(jié)果

DEGs主要涉及的生物學(xué)過程(biological process,BP)主要包括對病毒的反應(yīng)、對共生體的防御反應(yīng)、病毒生命周期的調(diào)控、病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控、對I型干擾素的反應(yīng)等;參與的分子功能(molecular function,MF)主要包括:雙鏈RNA結(jié)合、腺苷酸轉(zhuǎn)移酶活性、RNA解旋酶活性、ATP依賴性活性,作用于RNA、單鏈RNA結(jié)合等;細(xì)胞學(xué)組分(cellular component,CC)分析顯示DEGs主要參與晚期內(nèi)體膜、宿主細(xì)胞、線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶復(fù)合物(translocase of inner mitochondrial,TIM)23、主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)蛋白復(fù)合物、MHC Ⅱ類蛋白復(fù)合物、肌球蛋白絲等的組成,見圖4A、圖4B、圖4C。

圖4 干燥綜合征伴發(fā)疲勞差異表達(dá)基因的GO及KEGG富集分析結(jié)果

進(jìn)行KEGG通路分析后發(fā)現(xiàn)DEGs主要涉及甲型流感、丙型肝炎、麻疹、冠狀病毒-COVID-19、核酸結(jié)合與寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)信號通路、維甲酸誘導(dǎo)基因I樣受體 (retinoic acid-inducible gene-I-like receptors,RLRs)信號通路、單純皰疹病毒I型感染、人乳頭瘤病毒感染等多種病毒感染信號通路,見圖4D。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Hub基因篩選結(jié)果

將上述48個差異表達(dá)基因上傳至STRING在線數(shù)據(jù)庫,形成PPI網(wǎng)絡(luò),見圖5,下載相關(guān)TSV格式文件,獲取蛋白相互作用文件;使用Cytoscape軟件的CytoHubba插件進(jìn)一步分析,以發(fā)現(xiàn)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵目標(biāo)和子網(wǎng)絡(luò),從中篩選出Hub基因(圖6)并進(jìn)行功能注釋,見表1。

表1 干燥綜合征伴發(fā)疲勞Hub基因的縮寫、全稱及功能

圖5 干燥綜合征伴發(fā)疲勞差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)中最顯著的模塊

圖6 干燥綜合征伴發(fā)疲勞Hub基因的篩選

2.5 基于Hub基因的中藥預(yù)測結(jié)果

應(yīng)用Coremine Medical數(shù)據(jù)庫篩選出治療SS伴發(fā)疲勞的常見中藥,見表2,作為治療SS伴發(fā)疲勞藥物的潛在來源。這些藥物中鱉甲、淫羊藿、鹿茸、鹿角膠、生地黃、熟地黃屬于清肝補(bǔ)腎類藥物;黃芩、水牛角、茶樹根、藤梨根屬清熱解毒類藥物。還包括杏仁、萊菔子等理氣降氣藥物;浮小麥、白果等收澀藥物,干姜、茴香等溫中藥物。這些藥物及其功效可為SS伴發(fā)疲勞的中醫(yī)病因病機(jī)研究及臨床治療提供參考。

表2 基于干燥綜合征伴發(fā)疲勞關(guān)鍵基因的中藥預(yù)測結(jié)果

3 討論

本研究通過分析GSE66795數(shù)據(jù)集,獲取SS伴發(fā)疲勞與正常人的48個DEGs,進(jìn)行KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)其主要涉及多條病毒相關(guān)通路,如甲型流感、丙型肝炎、麻疹、冠狀病毒-COVID-19等病毒感染的通路,反映出SS伴發(fā)疲勞的機(jī)制與病毒密切相關(guān)。文獻(xiàn)報道,EB病毒(epstein-barr virus,EBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis c Virus,HCV)、人類嗜 T淋巴細(xì)胞病毒1型(human T-lymphtropic virus 1, HTLV-1)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)和人類免疫缺陷病毒(immunodeficiency virus, HIV)等[14]與SS發(fā)病相關(guān),與上述分析結(jié)果基本吻合。

大量研究證明EBV DNA在SS患者外分泌腺尤其是唾液腺中有高表達(dá)[14]。EBV通過引起上皮細(xì)胞損傷、激活先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)導(dǎo)致SS的發(fā)生[15]。Gallo等[16]證實(shí)了EBV microRNA可以從B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到唾液上皮細(xì)胞,下調(diào)基質(zhì)相互作用分子(stromal interaction molecule,STIM)1蛋白,影響Ca2+的激活,進(jìn)而影響腺體分泌。EBV產(chǎn)生病毒白細(xì)胞介素(virus interleukin,vIL)-10,抑制巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及干擾素的抗病毒活性。HCV也是與自身免疫疾病相關(guān)的病毒之一。HCV感染在中國的發(fā)病率約為3.2%[17],Ramos-Casals等[18]發(fā)現(xiàn)HCV感染繼發(fā)SS的患者調(diào)節(jié)輔助性T1(T-helper 1 lymphocyte,Th1)細(xì)胞與Th2細(xì)胞因子比率失衡。此外基于SS的臨床、免疫學(xué)和組織學(xué)特征,HCV繼發(fā)SS的肝外表現(xiàn)常常被錯認(rèn)為是慢性HCV感染的肝外特征[14]。

IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFI44L、OASL、OAS2、MX1、USP18、ISG15、RSAD2為篩選出來的Hub基因。通過分析發(fā)現(xiàn)這些基因大多為干擾素(interferon,IFN)誘導(dǎo)基因,與SS的IFN通路相關(guān)。IFN通路激活是細(xì)菌和病毒感染的關(guān)鍵過程[19-20],即細(xì)菌或者病毒作用于人體后,先天免疫會被激活[21]。I型IFN則通過Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)7信號通路誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖和分化。另外,I型IFN誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也能引起不同細(xì)胞產(chǎn)生BAFF,促進(jìn)B細(xì)胞的活化[21],從而激活后天免疫。因此IFN的激活是SS先后天免疫過程中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。本研究通過SS伴發(fā)疲勞與正常人之間的差異分析,表明SS伴發(fā)疲勞與病毒感染所致的IFN通路激活相關(guān)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素、傳統(tǒng)的抗風(fēng)濕藥物(disease-modifying antirhrumatic drugs,DMARDs)或生物制劑等對于SS疲勞的改善有一定的作用,但仍缺少大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究來證實(shí)這些藥物的有效性[22]。羥氯喹可能是通過干預(yù)Toll樣受體抑制I型IFN通路潛在改善疲勞癥狀[3]。一項(xiàng)Meta分析顯示利妥昔單抗并不能明顯改善SS患者的疲勞情況[6]。另一項(xiàng)研究認(rèn)為白介素(interleukin,IL)-1可能參與疲勞進(jìn)展,但是anakinra(IL-1受體拮抗劑)應(yīng)用評估顯示第4周時患者的疲勞評分并未發(fā)生顯著變化[23]。此外,還有研究表明疲勞與IFNγ呈負(fù)相關(guān)[24]。IFN通路的激活是SS中疲勞的主要免疫學(xué)特征之一[4],約2/3的SS患者表現(xiàn)出高水平的IFN活性[25]。靶向IFN可能是治療SS伴發(fā)疲勞的方法之一[26],但未來仍需要大量的臨床試驗(yàn)去證實(shí)。本研究進(jìn)一步對SS輕度疲勞與重度疲勞進(jìn)行了差異分析,但并未發(fā)現(xiàn)差異基因,這一結(jié)果從側(cè)面提示疲勞的發(fā)生可能與SS本身的發(fā)病機(jī)制相關(guān),因此緩解疲勞需關(guān)注疾病本身的治療。

此外,本研究篩選出具有干預(yù)SS伴發(fā)疲勞潛在靶點(diǎn)作用的中藥,大致可分為6類:清熱解毒類(黃芩、水牛角、茶樹根、藤梨根等),清肝平肝類(鱉甲、珍珠母等),補(bǔ)腎類(淫羊藿、地黃、鹿茸、鹿角膠等),理氣降氣類(杏仁、萊菔子),收澀類(浮小麥、白果),溫中類(干姜、茴香)。這些藥物的篩選分類體現(xiàn)出了治療SS伴疲勞的配伍原則,也間接反映了SS伴疲勞的中醫(yī)病因病機(jī)。清熱解毒、清肝平肝及補(bǔ)腎類藥最多,可能發(fā)揮主要作用,其他類藥物較少故不予論述。治療SS疲勞不僅要重視先天不足(腎虛),還需關(guān)注肝臟的陰陽平衡。補(bǔ)腎益腎是治療SS的根本,調(diào)肝以助腎,可平其先天失衡。有研究總結(jié)了SS的中醫(yī)證候規(guī)律,結(jié)合多數(shù)醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SS最常見證型為肝腎陰虛證,可兼見氣虛、氣滯、熱毒等證[27]。疾病初起或疾病高度活動時,加用清熱解毒藥物黃芩等,可祛后天之邪,使先后天協(xié)調(diào),病祛邪退,內(nèi)外和調(diào),如周彩云教授臨床辨治SS時喜用黃芩等苦寒之品[28]。楊少寧等[29]也從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出發(fā)研究了清熱解毒藥物雷公藤治療SS的有效成分及作用靶點(diǎn)。路志正教授善從腎出發(fā),從陰火論治SS[30],以平衡腎之陰陽。閻小萍則創(chuàng)制經(jīng)驗(yàn)方“補(bǔ)腎清熱育陰湯”治療SS,善用地黃、山茱萸等藥物補(bǔ)腎陰、腎陽[31]。朱良春教授提出補(bǔ)腎陰腎陽之法治療SS[32]?；诜鲫査枷?馬燕渝等[33]在SS后期應(yīng)用四逆法以培本填精,溫腎固陽。也有研究從乙癸同源理論出發(fā)采用一貫煎加減治療SS,取得了不錯的療效[34]。此外,一項(xiàng)臨床研究顯示一貫煎聯(lián)合硫酸羥氯喹治療SS也取得了較好療效,其機(jī)制可能是通過Th17與調(diào)節(jié)性T(regulatory T, Treg)細(xì)胞比率而改善口眼干燥癥狀、提高生活質(zhì)量[35]。這些名家用藥經(jīng)驗(yàn)和治療思路與本研究所篩選出來的中藥及預(yù)測的病因病機(jī)理論相符。

綜上所述,本文通過生物信息學(xué)方法對SS伴疲勞的機(jī)制進(jìn)行探討,得出48個DEGs與10個關(guān)鍵基因,并繼而分析可能導(dǎo)致其發(fā)生的信號通路。結(jié)果顯示SS疲勞涉及多條病毒感染通路,隨后又篩選出了具有潛在治療作用的中藥,為治療SS伴疲勞提供新思路,為中藥的研究提供理論依據(jù),未來還應(yīng)通過臨床及實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)相關(guān)中藥的治療作用。