針刺干預(yù)對(duì)VaD大鼠Caspase-3通路相關(guān)蛋白的影響?

陳 洋,徐子絢,宋 杰△,王 平,畢天威,張曉明,王 非

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院,武漢 430065;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所,武漢 430065;3.武漢市中醫(yī)醫(yī)院,武漢 430000)

血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是腦血管因素引起的以高級(jí)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙為主的臨床綜合征,是神經(jīng)內(nèi)科的常見(jiàn)病。VaD作為僅次于阿爾茨海默病的癡呆亞型,患者數(shù)約占癡呆總數(shù)的20%,2019年全球癡呆癥患者的護(hù)理費(fèi)用約為1.3萬(wàn)億美元,到2030年可能上升至1.7萬(wàn)億美元,給社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān),是當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)界亟待攻克的疾病之一[1-3]。神經(jīng)炎癥異常、細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡等造成的神經(jīng)元損傷或丟失是VaD的主要病理機(jī)制,其中凋亡發(fā)揮重要作用[4]。半胱天冬酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-3通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通路,參與包括VaD在內(nèi)的多種疾病的發(fā)展,可能是治療VaD的靶點(diǎn)之一[5]。多項(xiàng)研究證實(shí)針刺對(duì)改善VaD癥狀有積極作用[6-8]。研究表明,電針百會(huì)、腎俞等穴位可以通過(guò)抑制外周炎性因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18的生成來(lái)改善VaD大鼠的認(rèn)知功能[9]。臨床運(yùn)用合谷和豐隆穴能夠改善癡呆患者的認(rèn)知障礙[10]。本研究從Caspase-3通路的角度觀察針刺百會(huì)、腎俞、豐隆穴對(duì)VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,探究其改善VaD認(rèn)知功能障礙的可能作用機(jī)制,探索針刺防治VaD的新靶點(diǎn)。本研究獲得湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批號(hào):82130119。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)2月齡健康雄性SD大鼠36只,體質(zhì)量(250±20)g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001,飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所,大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,6只/籠,自由攝食、飲水,室溫(24±2)℃,濕度恒定,正常晝夜節(jié)律采光。

1.2 主要儀器和試劑

包埋機(jī)(型號(hào):JB-P5)、凍臺(tái)(型號(hào):JB-L5),武漢俊杰電子有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào):D3024R),北京DragonLab公司;高速低溫組織研磨儀(型號(hào):KZ-Ⅲ-F)、脫色搖床(型號(hào):TSY-B),武漢Servicebio公司;化學(xué)發(fā)光儀(型號(hào):6300),上海CLINX公司;病理切片機(jī)(型號(hào):RM2016),上海徠卡儀器有限公司;熒光定量PCR儀(型號(hào):Quant Studio 3),美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;顯微鏡(型號(hào):E100),日本Nikon公司;一次性無(wú)菌毫針(型號(hào):0.25 mm×25 mm),北京中研太和醫(yī)療器械有限公司。

HE染色試劑盒(貨號(hào):G1003)、DAB顯色劑(貨號(hào):G1212)、BCA蛋白檢測(cè)盒(貨號(hào):G2026)、β-actin抗體(貨號(hào):GB12001)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(貨號(hào):GB13439)、Caspase-3抗體(貨號(hào):GB11532)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)抗體(貨號(hào):GB11690)、山羊抗兔二抗(貨號(hào):GB23303)、山羊抗小鼠二抗(貨號(hào):GB23301)、RNA提取液(貨號(hào):G3013)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):G3330),武漢Servicebio公司。

1.3 分組與造模

36只大鼠按隨機(jī)數(shù)表分為假手術(shù)組、模型組和針刺組,每組12只。模型組與針刺組大鼠采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)分次結(jié)扎法制備VaD模型。術(shù)前12 h內(nèi)禁食,正常飲水,腹腔注射6%水合氯醛(0.5 mg/100 g)麻醉,將大鼠仰臥固定于鼠臺(tái),暴露頸部,備皮,75%酒精消毒,沿大鼠頸部正中線做1 cm切口,暴露和分離左側(cè)CCA,注意避開(kāi)迷走神經(jīng),利用4號(hào)手術(shù)線分別結(jié)扎左側(cè)CCA遠(yuǎn)心端和近心端,予以0.5 g紅霉素軟膏混合0.1 g青霉素粉劑涂擦傷口預(yù)防感染,術(shù)后注意保溫。3 d后在相同條件下,對(duì)右側(cè)CCA進(jìn)行同樣結(jié)扎處理。假手術(shù)組僅分次行CCA分離,不予結(jié)扎處理。

1.4 模型評(píng)價(jià)

手術(shù)結(jié)束1周后,應(yīng)用Morris水迷宮進(jìn)行定位航行測(cè)試。計(jì)算針刺組和模型組大鼠的逃避潛伏期,即大鼠從4個(gè)象限入水點(diǎn)爬上目標(biāo)平臺(tái)所消耗時(shí)間,將4次均值作為參考值。計(jì)算大鼠造模后的平均逃避潛伏期與參考值的比值,比值≥120%為造模成功。

1.5 針刺干預(yù)

模型評(píng)價(jià)結(jié)束后對(duì)針刺組大鼠進(jìn)行針刺干預(yù)。取穴:百會(huì)、腎俞(雙)、豐隆(雙),依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]定位。百會(huì):向后平刺3～5 mm;腎俞:向后下方斜刺5 mm,與皮膚呈45°;豐隆:直刺3～5 mm。每日針刺1次,每次20 min,干預(yù)6 d后休息1 d,共干預(yù)2周。其余兩組不做處理,模擬同等抓取。

1.6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

針刺結(jié)束后第2天開(kāi)展,評(píng)估大鼠的空間定位及學(xué)習(xí)記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn):本實(shí)驗(yàn)連續(xù)開(kāi)展5 d,先令大鼠于水池中自由游行60 s以適應(yīng)環(huán)境,分別在水池4個(gè)象限邊緣中點(diǎn)作標(biāo)記,平臺(tái)低于水面2 cm,固定于同一象限。將大鼠面向池壁依次從4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)放入水中,間隔5 min。設(shè)置最長(zhǎng)時(shí)間為90 s,在此期間內(nèi)爬上平臺(tái)的大鼠,記錄對(duì)應(yīng)時(shí)間并令其在臺(tái)上停留30 s。對(duì)于規(guī)定時(shí)間內(nèi)尋找平臺(tái)失敗的大鼠,將其帶至平臺(tái),同樣于平臺(tái)上熟悉30 s,時(shí)間直接記為90 s。以4次時(shí)間的均值計(jì)算最終結(jié)果?？臻g探索實(shí)驗(yàn):第6天移除池中平臺(tái),將大鼠面向池壁從非平臺(tái)所在的同一象限位置入水,記錄其90 s內(nèi)穿過(guò)原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。

1.7 取材與指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 處死與取材 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后第2天取材。大鼠采用3%戊巴比妥鈉(0.5 mg/100 g)腹腔注射麻醉后斷頸處死,取腦,冰面上剝離雙側(cè)海馬,液氮速凍左側(cè)海馬并于-80 ℃保存,用于后續(xù)定量PCR及Western blot檢測(cè)。石蠟切片制備:4%多聚甲醛溶液固定右側(cè)海馬體,脫水、透明后置于石蠟中浸泡后包埋,冷卻后作5 μm厚度的冠狀切片,供后續(xù)HE染色及免疫組化檢測(cè)。

1.7.2 HE染色檢測(cè)大鼠海馬區(qū)形態(tài)學(xué)變化 石蠟切片脫蠟水化后按HE染色試劑盒說(shuō)明步驟依次蘇木精(3 min)、伊紅(5 min)染色、脫水、透明,干燥后以中性樹(shù)膠封閉切片,在400倍光鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)并拍照記錄。

1.7.3 免疫組化檢測(cè)海馬組織Bcl-2、Caspase-3的陽(yáng)性表達(dá) 組織切片脫蠟水化,用檸檬酸緩沖液(pH 6.0)加熱修復(fù),洗滌后與3% H2O2消毒液避光孵育,洗滌、封閉,分別滴加一抗Bcl-2(稀釋1∶200)、Caspase-3(稀釋1∶500),4 ℃過(guò)夜。次日與二抗(稀釋1∶200)孵育50 min,洗片后滴加DAB,顯色后沖洗,蘇木精染核后脫水封片,400倍光鏡下觀察并收集圖像。Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)定圖像的平均光密度,并以該值半定量分析蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。

1.7.4 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3的蛋白表達(dá) 稱取冷凍海馬組織勻漿,裂解、離心后測(cè)定上清中蛋白濃度,電泳、轉(zhuǎn)膜,TBST沖洗后5%脫脂牛乳封閉30 min。分別滴加一抗Bax(稀釋1∶200)、Bcl-2(稀釋1∶200)、Caspase-3(稀釋1∶500)及β-actin(稀釋1∶1 000),4 ℃過(guò)夜。次日洗滌后與對(duì)應(yīng)二抗(稀釋1∶200)混合后進(jìn)行2 h孵育,洗膜后暗室顯影、定影,Image Pro Plus 6.0軟件完成目標(biāo)條帶光密度的測(cè)定,以β-actin為內(nèi)參,分析蛋白的表達(dá)水平。

1.7.5 熒光定量PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達(dá) 取約20 mg的海馬組織,與1 mL的RNA提取液勻漿后依次行離心、沉淀、洗滌,于沉淀液中加入約15 μL RNA溶解液,提取海馬組織總RNA,測(cè)定RNA含量及濃度后,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在cDNA中加入上、下游引物進(jìn)行定量PCR,以GAPDH為內(nèi)參。引物擴(kuò)增序列見(jiàn)表1。最終數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行定量。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較

與假手術(shù)組比較,模型組平均逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01),平均穿臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01);與模型組比較,針刺組平均逃避潛伏期顯著縮短(P<0.01),平均穿臺(tái)次數(shù)明顯增多(P<0.01),見(jiàn)表2、表3。

表2 各組大鼠平均逃避潛伏期

表3 各組大鼠平均穿越平臺(tái)次數(shù)

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)改變

假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元排列緊密有序,形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,核仁清晰。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元排列無(wú)序,細(xì)胞間隙增大,輪廓不清,形態(tài)不規(guī)則,核仁深染固縮,膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多,神經(jīng)細(xì)胞大量損傷、丟失。與模型組比較,針刺組海馬CA1區(qū)的病理形態(tài)明顯改善,細(xì)胞排列尚齊,形態(tài)較規(guī)整,核仁較清楚,膠質(zhì)細(xì)胞減少,見(jiàn)圖1。

A.假手術(shù)組;B.模型組;C.針刺組圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)改變(HE ×400)

2.3 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達(dá)水平

根據(jù)免疫組化測(cè)定Bcl-2及Caspase-3表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞百分比,Western blot測(cè)定Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值,結(jié)果顯示,與假手術(shù)組大鼠比較,模型組海馬區(qū)Bax、Caspase-3的相對(duì)表達(dá)增加(P<0.01),Bcl-2的相對(duì)表達(dá)減少(P<0.01);與模型組比較,針刺組海馬區(qū)Bax、Caspase-3的相對(duì)表達(dá)減少(P<0.01),Bcl-2的相對(duì)表達(dá)增加(P<0.01),見(jiàn)圖2、3、4。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.針刺組;與假手術(shù)組比較**P<0.01;與模型組比較##P<0.01;B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2),半胱天冬酶-3(Caspase-3),Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)圖4 各組大鼠海馬區(qū)Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較

2.4 各組大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達(dá)結(jié)果

與假手術(shù)組比較,模型組海馬區(qū)Caspase-3和Bax二者mRNA的表達(dá)均明顯上升(P<0.01),Bcl-2 mRNA的表達(dá)下降(P<0.01)。針刺干預(yù)后,與模型組比較,針刺組海馬區(qū)Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯上升(P<0.01),Caspase-3和Bax mRNA的表達(dá)均明顯減少(P<0.01),見(jiàn)圖5。

注:與假手術(shù)組比較**P<0.01;與模型組比較##P<0.01;B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2),半胱天冬酶-3(Caspase-3),Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)圖5 各組大鼠海馬區(qū)Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達(dá)(n=3)

3 討論

針刺百會(huì)穴提高VaD患者認(rèn)知功能的療效在多項(xiàng)臨床研究中得到證實(shí)[6-7],文獻(xiàn)研究顯示百會(huì)穴為針刺治療VaD及血管相關(guān)認(rèn)知障礙等病的核心腧穴[12-13]。VaD的發(fā)病為多種病理因素共同作用的結(jié)果,虛實(shí)夾雜是其主要病理特點(diǎn),患者多有腎精虧虛證候[14-15]。腎俞穴為補(bǔ)腎填精的經(jīng)典穴位,現(xiàn)代研究表明通過(guò)電針百會(huì)和腎俞穴可提高阿爾茨海默模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[16-17]。VaD屬于中醫(yī)“呆病”范疇,清代著名醫(yī)家陳士鐸認(rèn)為“痰積于胸中,盤踞于心外,使神明不清,而成呆病矣”(《辨證錄·呆病門》),“痰勢(shì)最盛,呆氣最深”(《石室秘錄》)。痰濁為“呆病”的重要病理因素。明代《針灸大成》中收錄的針灸經(jīng)典歌賦《玉龍歌》中記載“痰多宜向豐隆尋”,豐隆穴多用于化痰去濁。文獻(xiàn)研究顯示豐隆穴為高脂血癥臨床治療的核心腧穴之一[18],實(shí)驗(yàn)證實(shí)電針豐隆穴對(duì)血脂的多項(xiàng)成分均有良性調(diào)節(jié)作用[19-20],而血脂異常及其導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化是VaD發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[21]。

海馬體是邊緣系統(tǒng)中與空間定位及學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系最為密切的區(qū)域[22],對(duì)缺血低灌注高度敏感[23]。本研究對(duì)大鼠海馬組織HE染色顯示,模型組海馬組織的病理形態(tài)與假手術(shù)組相比,細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次紊亂,核固縮深染,膠質(zhì)細(xì)胞增多,神經(jīng)元大量損傷、丟失,行為學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示模型組大鼠穿臺(tái)次數(shù)減少,逃避潛伏期顯著延長(zhǎng),空間學(xué)習(xí)和記憶功能明顯障礙,提示海馬神經(jīng)元損傷是VaD認(rèn)知障礙的可能機(jī)制。干預(yù)后,針刺組大鼠海馬組織的病理改變較模型組明顯減輕,空間學(xué)習(xí)記憶障礙明顯改善,說(shuō)明針刺對(duì)于VaD大鼠的腦損傷具有保護(hù)作用。

現(xiàn)代研究顯示缺血缺氧造成的海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡與認(rèn)知障礙密切相關(guān),是VaD重要的病理基礎(chǔ)[24]。細(xì)胞凋亡是指在各種生理或病理因素刺激下介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡,對(duì)于內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持有著重要意義。Bcl-2家族主要參與細(xì)胞凋亡中的線粒體途徑[25]。Bax和Bcl-2同屬Bcl-2家族,二者功能相互拮抗,主要通過(guò)調(diào)控線粒體外膜的通透性來(lái)傳遞凋亡信號(hào)[26]。在正常狀態(tài)下,Bax和Bcl-2保持相對(duì)穩(wěn)定[27]。在各種生理病理因素的刺激下,分布于線粒體外膜的Bax寡聚并形成線粒體外膜通透孔,進(jìn)而激活線粒體外膜透性化(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP),促使包括細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)在內(nèi)的多種凋亡因子從細(xì)胞內(nèi)釋放,引發(fā)細(xì)胞凋亡[28-29]。與Bax相反,Bcl-2主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度來(lái)抑制MOMP,從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的功能[30]。多項(xiàng)研究顯示Bcl-2和Bax參與了缺血、缺氧誘發(fā)的海馬神經(jīng)元凋亡,二者異常表達(dá)激活的細(xì)胞凋亡參與了VaD的發(fā)展[31-32]。

Caspase家族是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶,受上游凋亡信號(hào)的調(diào)控,其活化后可啟動(dòng)相關(guān)酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng),介導(dǎo)細(xì)胞死亡[33]。凋亡型Caspases可分成啟動(dòng)型和效應(yīng)型兩大類,其中,Caspase-3被認(rèn)為是關(guān)鍵的效應(yīng)酶,可在內(nèi)源性或外源性凋亡啟動(dòng)后被激活,通過(guò)切割細(xì)胞基質(zhì)直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡[34-35]。Caspase-3的表達(dá)受通路中上游Bcl-2家族的調(diào)控,Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可以顯著降低Caspase-3的水平,而B(niǎo)ax可以通過(guò)促進(jìn)Cyt-C等凋亡因子的釋放,進(jìn)一步活化啟動(dòng)者Caspase-9,從而激活Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[28]。另一方面,Caspase-3又可將Bcl-2裂解成具有類Bax促凋亡活性的功能片段,加快凋亡進(jìn)程[25]。李曼玲等[36]的研究證實(shí),應(yīng)用Caspase-3抑制劑可顯著降低腦缺血再灌注損傷模型的細(xì)胞凋亡水平,而電針足三里、合谷等穴可以發(fā)揮與Caspase-3抑制劑相同的作用。高玲等[37]的研究顯示抑制Caspase-3的表達(dá)可以減輕缺血缺氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡,進(jìn)而改善VaD大鼠的認(rèn)知障礙。因此,抑制Caspase-3通路的激活在VaD的防治中有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Bax和Caspase-3在造模大鼠的海馬組織中呈現(xiàn)高表達(dá),抗凋亡蛋白Bcl-2則呈現(xiàn)低表達(dá)水平,提示VaD的發(fā)病機(jī)制可能與Caspase-3通路異常激活介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān),與既往研究一致[31,37]。經(jīng)針刺干預(yù)后,大鼠海馬區(qū)Caspase-3和Bax的表達(dá)水平均較模型組顯著降低,Bcl-2的表達(dá)顯著增加,結(jié)合行為學(xué)實(shí)驗(yàn)及HE染色結(jié)果分析,針刺百會(huì)、腎俞、豐隆穴可能通過(guò)促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)和抑制Bax的過(guò)度表達(dá)來(lái)拮抗Caspase-3的活化,降低VaD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡水平,減輕海馬組織損傷,進(jìn)而改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。

綜上所述,針刺百會(huì)、腎俞、豐隆穴能提高VaD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,改善認(rèn)知功能障礙,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)水平,抑制Caspase-3通路激活介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)。