開心散改善小鼠肥胖相關(guān)認知障礙的機制研究?

李 炎,劉鵬飛,劉學(xué)偉,張 博,黃樹明

(1. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇揚州 225009;2. 揚州大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇揚州 225012;3. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,哈爾濱 150040)

肥胖已成為當(dāng)今社會嚴重的健康問題,除了人們熟知的肥胖能增加多種疾病如糖尿病、心腦血管疾病和某些癌癥等的患病風(fēng)險外,越來越多的研究證明肥胖還與認知功能下降密切相關(guān)[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)肥胖者腦體積較小,尤其在與認知功能相關(guān)的海馬區(qū)更為明顯[2-3]。實驗證明,長期高脂飲食誘發(fā)的肥胖不僅導(dǎo)致動物認知功能下降,還會造成海馬區(qū)突觸可塑性下降、樹突小棘密度降低,以及誘發(fā)氧化應(yīng)激和促進神經(jīng)炎癥等病理變化[4-5]。研究還表明,不論年齡大小,肥胖均能誘發(fā)認知功能下降,而當(dāng)肥胖動物被施以脂肪切除術(shù)或跑步訓(xùn)練減少體質(zhì)量后,其認知功能、突觸可塑性及神經(jīng)炎癥水平均能得到改善[6-7]。進一步研究發(fā)現(xiàn)肥胖相關(guān)的認知功能下降與腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞向促炎表型(M1型)轉(zhuǎn)化密切相關(guān),M1型小膠質(zhì)細胞可通過吞噬突觸及釋放炎性因子干擾突觸功能,從而導(dǎo)致認知功能下降[8]。因此調(diào)控小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化向抗炎/神經(jīng)保護表型(M2型)傾斜是治療肥胖相關(guān)認知障礙的潛在靶點。

開心散出自孫思邈的《備急千金要方》,“主好忘”,大量研究證明其對多種癡呆動物模型的認知功能下降有明顯的治療作用[9-12]。還有研究發(fā)現(xiàn)開心散能夠改善氟西汀耐藥的抑郁動物的異常行為,具體機制與抑制海馬區(qū)神經(jīng)炎癥,即升高海馬區(qū)白細胞介素(interleukin,IL)-10水平、降低腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平有關(guān)[13]。在此基礎(chǔ)上提出假說:開心散可能具有通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化、抑制神經(jīng)炎癥改善肥胖相關(guān)認知下降的作用。為了驗證這一假說,本研究應(yīng)用長期高脂飲食復(fù)制肥胖相關(guān)認知障礙動物模型,觀察開心散的改善作用并進一步探究其機制,以期為肥胖相關(guān)認知功能下降的中醫(yī)藥防治及開心散的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。實驗設(shè)計遵循國際動物福利標準并通過揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會審查,編號:YXYLL-2021-10。

1 材料

1.1 動物

6周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量(22±2)g,由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供,動物許可證號:SCXK(蘇)2022-0009。實驗動物提前1周購入,于標準動物房內(nèi)飼養(yǎng),每天光照與黑暗時間均為12 h,室溫22～25 ℃,相對濕度50%～60%。

1.2 主要藥物與試劑

開心散由人參、茯苓、石菖蒲、遠志組成,中藥飲片均購于揚州市中醫(yī)院;小鼠IL-6 ELISA試劑盒(貨號:F11836)、TNF-α ELISA試劑盒(貨號:F12044)、IL-10 ELISA試劑盒(貨號:F11829)及轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1 ELISA試劑盒(貨號:F12041),均購自上海研謹生物有限公司;兔抗小鼠CD16+CD32抗體(貨號:ab228971)、兔抗小鼠CD206抗體(貨號:ab64693),購自英國Abcam公司;免疫熒光染色試劑盒-抗兔Alexa Fluor 555(貨號:P0179)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)染色液(貨號:C1005),購自上海碧云天生物有限公司;小鼠單克隆Arg-1抗體(貨號:MA5-31577)購自德國Thermo Fisher科技公司;內(nèi)參 GAPDH抗體(貨號:AB-P-R001)購自中國賢至生物有限公司;辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(貨號:ZB-2305)購自中杉金橋生物有限公司;辣根酶標記山羊抗兔IgG(貨號:ab6721)購自英國Abcam公司。

1.3 主要儀器

SuperMaze型Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng),上海欣軟科技有限公司;5804R型冷凍離心機,德國EPPENDORF公司;ELX800型酶標儀,美國伯騰儀器有限公司;NI-U型正置熒光顯微鏡,日本尼康公司;Citadel 2000型組織脫水機、包埋機,美國Thermo Fisher科技公司;SM2010R型切片機,德國徠卡公司;小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、PowerPac HC型高電流電源、ChemiDoc XRS+型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),均購自美國BIO-RAD科技公司。

2 方法

2.1 分組與造模

將小鼠隨機分為普通飲食組、高脂飲食組及開心散高(開心散-高)、低劑量(開心散-低)組,共4組,每組10只。普通飲食組小鼠給予普通飼料(含4%的脂肪,購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司,批號:MD17121)喂養(yǎng)。其余各組均給予高脂飼料(含45%的脂肪,購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司,批號:MDDZ001)和酥糖(由花生、蔗糖和葡萄糖組成,含13.2%的脂肪、73.6%的碳水化合物,購自齊齊哈爾市泰來縣鑫源食品廠)喂養(yǎng),實驗周期為16周,以建立肥胖相關(guān)認知障礙小鼠模型。每周記錄各組小鼠體質(zhì)量。

2.2 給藥

造模13～16周期間,開心散高、低劑量組小鼠分別灌胃高、低劑量的開心散溶液。開心散(人參、茯苓、遠志、石菖蒲,按3:3:2:2的質(zhì)量比組成)經(jīng)60%乙醇提取后制備成凍干粉,干燥避光保存[14]。以成人(體質(zhì)量70 kg)每日服用生藥劑量50 g換算出小鼠等效劑量6.5 g/kg,作為開心散低劑量,其2倍藥量作為開心散高劑量。普通飲食組和高脂飲食組小鼠灌胃等體積的0.9%氯化鈉溶液。灌胃體積均為10 mL/kg。

2.3 Morris水迷宮實驗

第16周進行Morris水迷宮實驗,包括定位航行實驗與空間探索實驗。定位航行實驗:水池被分為4個象限,水溫控制在(26±1)℃,在第2象限中央放置平臺。每只小鼠連續(xù)訓(xùn)練6 d,每天在同一時間進行訓(xùn)練。每次訓(xùn)練需確保小鼠分別從4個不同的位點下水以避免偏差,訓(xùn)練時間為60 s,記錄它們找到平臺所需的時間(逃離潛伏期),60 s內(nèi)未找到平臺則計為60 s,并幫助該小鼠游到平臺上后停留20 s?？臻g探索實驗:在完成第6天的定位航行實驗后2 h,移除第2象限中央的平臺,進行空間搜索實驗。每只小鼠只測試1次,時間60 s,從同一起點下水,記錄各組小鼠穿越平臺區(qū)次數(shù)及在各象限的游泳時間。

2.4 處死與取材

行為學(xué)實驗后,小鼠經(jīng)脫頸處死并迅速冰上取腦,將腦組織切分為左右兩半,一半腦組織浸泡于4%多聚甲醛中,4 ℃固定24 h后用于免疫熒光實驗,另一半腦組織迅速投入液氮內(nèi)凍存,用于ELISA和Western blot實驗。

2.5 ELISA法檢測全腦及海馬區(qū)細胞因子

應(yīng)用ELISA法測定全腦及海馬區(qū)促炎因子IL-6、TNF-α及抗炎因子IL-10、TGF-β1含量。具體實驗步驟嚴格按試劑盒說明書操作。

2.6 免疫熒光法標記海馬區(qū)M1/M2型小膠質(zhì)細胞

經(jīng)4%多聚甲醛固定后的腦組織經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋及切割,制作成5 μm厚的石蠟切片。再經(jīng)脫蠟、抗原熱修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶封閉、8%脫脂奶粉封閉,4 ℃下孵育一抗(兔抗小鼠CD16+CD32抗體或兔抗小鼠CD206抗體,稀釋比例均為1:1 000)過夜,室溫下避光孵育熒光標記二抗(1:1 000) 60 min,DAPI染色液覆蓋3 min后封片,正置熒光顯微鏡下拍照并對小鼠海馬CA1區(qū)與齒狀回之間460 μm2×700 μm2區(qū)域內(nèi)CD16+CD32及CD206免疫熒光標記的細胞進行計數(shù)。每個樣本均由3人計數(shù)后取平均值。

2.7 Western blot法測定海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞Arg-1表達

海馬組織經(jīng)細胞裂解、總蛋白提取、蛋白定量及變性后,取各樣本等量蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜及脫脂奶粉封閉,4 ℃孵育小鼠單克隆Arg-1抗體(1:1 000)過夜,次日室溫下孵育二抗(1:7 000)40 min,增強化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)成像,以Arg-1條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度比值作為結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 開心散對肥胖小鼠體質(zhì)量的影響

圖1A示小鼠造模16周期間體質(zhì)量增長百分數(shù)變化趨勢。圖1B示,與普通飲食組比較,高脂飲食喂養(yǎng)12周時高脂飲食組、開心散低劑量組及開心散高劑量組小鼠體質(zhì)量均明顯增加(P<0.001),且高脂飲食的各組小鼠間比較體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。圖1C示,灌胃給藥4周后,與普通飲食組比較,高脂飲食組小鼠體質(zhì)量仍明顯高于普通飲食組(P<0.001);與高脂飲食組比較,開心散低劑量和高劑量組小鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.05),且體質(zhì)量增加百分數(shù)呈下降趨勢,見圖1A。圖1D示,灌胃給藥4周后,與高脂飲食組比較,開心散低劑量和高劑量組小鼠體質(zhì)量的變化值較大(P<0.05)。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns代表差異無統(tǒng)計學(xué)意義圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化

3.2 開心散對肥胖小鼠認知能力的影響

圖2示,與普通飲食組比較,高脂飲食組小鼠在定位航行實驗第6天逃離潛伏期明顯延長(P<0.01),見圖2B,空間搜索實驗中在平臺區(qū)象限游泳時間百分數(shù)及穿越平臺期次數(shù)明顯減少(P<0.01),見圖2C、圖2D;與高脂飲食組比較,開心散高劑量組小鼠逃離潛伏期減短(P<0.05),見圖2B,平臺區(qū)象限游泳時間百分數(shù)及穿越平臺區(qū)次數(shù)均增加(P<0.05),見圖2C、圖2D;與高脂飲食組比較,開心散低劑量組小逃離潛伏期、平臺區(qū)象限時間百分數(shù)及穿越平臺區(qū)次數(shù)雖然均有改善趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖2 各組小鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較

3.3 開心散對肥胖小鼠全腦和海馬區(qū)IL-6、TNF-α、IL-10及TGF-β1含量的影響

圖3示,與普通飲食組比較,高脂飲食組小鼠全腦和海馬區(qū)的IL-6、TNF-α含量均明顯升高(P<0.001),而IL-10、TGF-β1含量均明顯降低(P<0.01);與高脂飲食組比較,開心散高劑量組小鼠全腦和海馬區(qū)的IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01),而IL-10、TGF-β1含量均明顯升高(P<0.05);與高脂飲食組比較,開心散低劑量組小鼠全腦和海馬區(qū)IL-6、TNF-α含量均明顯降低(P<0.05),海馬區(qū)IL-10、全腦和海馬區(qū)TGF-β1含量均明顯升高(P<0.05),而全腦IL-10含量變化不顯著,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns代表差異無統(tǒng)計學(xué)意義;白細胞介素6(IL-6),腫瘤壞死因子α(TNF-α),轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF- β1)圖3 各組小鼠腦內(nèi)IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1含量比較

3.4 開心散對肥胖小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的影響

圖4示,與普通飲食組比較,高脂飲食組小鼠海馬區(qū)M1型小膠質(zhì)細胞(CD16+CD32蛋白免疫熒光標記,見圖4D)的數(shù)量明顯增多(P<0.01);與高脂飲食組比較,開心散高劑量組小鼠M1型小膠質(zhì)細胞明顯減少(P<0.05)。與普通飲食組比較,高脂飲食組小鼠M2型小膠質(zhì)細胞(CD206蛋白免疫熒光標記,見圖4E)的數(shù)量明顯減少(P<0.05);與高脂飲食組比較,開心散低劑量組和開心散高劑量組小鼠M2型小膠質(zhì)細胞均顯著增多(P<0.05)。

3.5 開心散對肥胖小鼠海馬區(qū)Arg-1表達的影響

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;精氨酸酶1(Arg-1)A.各組小鼠海馬區(qū)Arg-1蛋白的免疫印跡圖;B.Arg-1表達水平;圖5 各組小鼠海馬區(qū)Arg-1蛋白表達比較

圖5示,與普通飲食組比較,高脂飲食組小鼠海馬區(qū)Arg-1表達明顯減少(P<0.01);與高脂飲食組比較,開心散高劑量組和開心散低劑量組小鼠海馬區(qū)Arg-1表達明顯增多(P<0.05)。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)長期高脂飲食的小鼠體質(zhì)量快速增長,明顯高于普通飲食小鼠。Morris水迷宮實驗中,與普通飲食小鼠比較,高脂飲食小鼠逃離潛伏期變化曲線下降平緩,逃離潛伏期明顯延長,而其穿越平臺區(qū)次數(shù)及平臺區(qū)象限探索時間百分數(shù)均明顯減少。體質(zhì)量監(jiān)測和行為學(xué)實驗結(jié)果再一次證明長期高脂飲食誘發(fā)的肥胖動物伴有認知能力下降,實驗結(jié)果與近年臨床和基礎(chǔ)研究一致[15]。有研究發(fā)現(xiàn),海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞向促炎性M1型轉(zhuǎn)化及其所引起的神經(jīng)炎癥是肥胖誘發(fā)認知功能下降的核心機制。小膠質(zhì)細胞激活后主要有M1和M2兩種不同的功能表型,M1型能被炎性細胞因子激活,如脂多糖、IL-1β、IL-6、TNF-α以及干擾素γ,而M2型能夠被抗炎細胞因子激活,如IL-4和IL-10等[16]。正常情況下,小膠質(zhì)細胞的兩種轉(zhuǎn)化形式處于相對平衡的狀態(tài)[17]。肥胖被認為是一種慢性炎癥性疾病,長期的高脂飲食誘發(fā)脂肪細胞過度肥大,并釋放IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子,這些因子可進一步觸發(fā)外周的免疫反應(yīng),使巨噬細胞滲入脂肪組織中并激活,引起更多的炎性因子釋放而導(dǎo)致周身炎癥性反應(yīng),外周脂肪細胞所釋放的炎性因子可透過血腦屏障并激活腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞向M1型轉(zhuǎn)化,引起包括海馬區(qū)的腦部炎癥[18]。在本研究中亦證明高脂飲食小鼠全腦及海馬區(qū)炎性細胞因子IL-6、TNF-α濃度明顯高于普通飲食小鼠,而抗炎細胞因子IL-10、TGF-β1濃度明顯低于普通飲食小鼠,說明長期高脂飲食誘發(fā)的肥胖小鼠全腦及海馬區(qū)發(fā)生了神經(jīng)炎癥。進一步研究中,高脂飲食小鼠海馬區(qū)M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯多于普通飲食小鼠,而M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量及其標志物Arg-1表達量明顯低于普通飲食小鼠,表明高脂飲食小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化方向已向M1型傾斜。

中醫(yī)學(xué)認為,久食肥甘厚味(長期高脂飲食習(xí)慣)可誘發(fā)肥胖[19],如《素問·通評虛實論篇》曰“肥貴人,則高粱之疾也”,同時常伴有“脾”“心”等臟腑功能的失調(diào)。久食肥甘厚味傷脾,脾傷生濕,脾失健運則水濕運化失利,濕聚生痰,如《素問·至真要大論篇》所云“諸濕腫滿,皆屬于脾”。陳修圓也提出“大抵素稟之盛,從無所苦,惟是濕痰頗多”[20]。若痰濕隨氣機升降蒙蔽清竅,則神失所用,就會出現(xiàn)健忘甚則癡呆等表現(xiàn),如《名醫(yī)指掌》曰“痰迷心竅,則遇事多忘”[21],《石室秘錄》中也提到“痰勢最盛,呆氣最深”[22]。因此,肥胖相關(guān)認知障礙的中醫(yī)學(xué)病因病機為久食肥甘厚味誘發(fā)肥胖,同時脾失健運,水濕內(nèi)停,濕聚生痰,上擾清竅,腦髓失聰,則出現(xiàn)健忘、癡呆等神明失用表現(xiàn)。因此,肥胖相關(guān)認知下降可辨為痰濁蒙竅證健忘。在治療上首先要祛痰濕以利清竅;再者,善治痰者當(dāng)治生痰之源,還需健脾益氣減少痰濕的生成。開心散具有“健脾益氣,祛痰開竅”的功用,與該證治法一致。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)開心散干預(yù)后的高脂飲食小鼠體質(zhì)量減輕,認知能力出現(xiàn)明顯改善,全腦及海馬區(qū)IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1的含量變化呈現(xiàn)逆轉(zhuǎn),海馬區(qū)M1型小膠質(zhì)細胞減少,而M2型小膠質(zhì)細胞及Arg-1表達明顯增多,且上述結(jié)果均呈現(xiàn)出劑量依賴性,證明開心散能夠改善長期高脂飲食誘發(fā)的肥胖相關(guān)認知障礙,其改善機制可能為通過調(diào)控海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化向M2型傾斜,減輕海馬區(qū)神經(jīng)炎癥,進而起到神經(jīng)保護及改善認知功能的作用。開心散調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2型傾斜的作用機制可能包括兩方面途徑,一方面,開心散中的人參[23-24]、茯苓[25-26]及遠志[27]均被證明具有調(diào)節(jié)能量代謝、抑制肥胖的作用,因此,開心散可能通過控制脂肪細胞肥大、降低體質(zhì)量、減輕周身炎癥反應(yīng),進而抑制神經(jīng)炎癥及小膠質(zhì)細胞的M1型轉(zhuǎn)化;另一方面,開心散在多種非肥胖動物模型,如抑郁癥模型動物、阿爾茨海默病模型動物中均被證明具有抗神經(jīng)炎癥的作用[28],說明開心散可直接抑制小膠質(zhì)細胞的M1型轉(zhuǎn)化。因此推斷開心散可通過直接或間接的途徑調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞向M2型轉(zhuǎn)化,對抗神經(jīng)炎癥,改善肥胖相關(guān)認知障礙。開心散對小膠質(zhì)細胞的干預(yù)機制仍需進一步研究。此外,針對肥胖相關(guān)認知障礙,已報道的干預(yù)措施中還未見合適的化學(xué)藥物,僅有脂肪組織手術(shù)切除和強迫運動等措施,再者本研究的目的為證明開心散對該模型的有效性并探索其作用機制,因此實驗中未設(shè)置陽性對照藥組。

本研究證明開心散可通過減輕體質(zhì)量及促進腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞向M2型轉(zhuǎn)化、干預(yù)神經(jīng)炎癥,進而改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖相關(guān)認知下降。同時本研究也為開心散治療痰濁蒙竅證健忘奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。