健脾滲濕解毒湯對(duì)高尿酸血癥大鼠的作用及機(jī)制探討?

葉文靜,楊文奎,符蕓瑜,吳小翠,邱曉堂

(海南省中醫(yī)院,?？?570203)

近年來,由于生活水平提高及飲食習(xí)慣改變,高尿酸血癥(hyperuricemia, HUA)的患病率在我國呈顯著上升趨勢(shì)[1-2]。HUA是由嘌呤代謝障礙,血清中尿酸積聚過多所致。由于尿酸在血清中的溶解度低,導(dǎo)致其在關(guān)節(jié)及其他組織中沉積形成痛風(fēng)[3-4]。HUA在痛風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。中醫(yī)認(rèn)為HUA證屬本虛標(biāo)實(shí),主要與先天不足或后天飲食不節(jié),造成脾運(yùn)失常,水谷不能化生精微而釀生濁邪,久之脾損及腎,腎之泌濁氣化功能受損,濁毒排泄障礙相關(guān)。本病以脾虛為本,濕熱、痰濁、瘀血為標(biāo)[5]。本課題組結(jié)合HUA“濕濁內(nèi)阻、壅滯血脈”的中醫(yī)病機(jī),擬健脾益氣、泄?jié)釢B利、化瘀解毒為法,以四妙散為底方,創(chuàng)立“健脾滲濕解毒湯”,前期在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)該方有一定的降尿酸功效。本研究擬在探討健脾滲濕解毒湯對(duì)HUA大鼠血尿酸、肝腎功能和病理學(xué)變化作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察其對(duì)腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(urate transporter,URAT)1和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(organic anion transporter,OAT)3表達(dá)的影響,以期為臨床使用該方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究計(jì)劃已通過海南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn),編號(hào):IACUC-HPHCM-2203010。

1 材料

1.1 動(dòng)物

普通雄性SD大鼠 60只,6～8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購自長沙天勤生物科技有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0014。所有大鼠均飼養(yǎng)于海南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,每日12 h照明,室溫25 ℃,不限食水,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 藥品與試劑

土茯苓、蒼術(shù)、綿萆薢、薏苡仁、黃柏、威靈仙、木瓜、當(dāng)歸、丹參、雞血藤,以上藥材均由海南省中醫(yī)院中藥房制作成中藥顆粒散劑使用。苯溴馬隆購自宜昌東陽光長江藥業(yè)股份有限公司(貨號(hào):006208020);腺嘌呤、氧嗪酸鉀及羧甲基纖維素鈉粉末均購自上海麥克林生化科技有限公司(貨號(hào)分別為:C10921809、C12740420、C11402786);異氟烷購自河北一品制藥股份有限公司(貨號(hào):2011103);4%多聚甲醛固定液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自蘇州新賽美生物科技有限公司(貨號(hào)分別為:22242687、202120320);蛋白裂解液(強(qiáng))、蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司(貨號(hào)分別為:P0013B、P0012);RNA提取試劑購自美國ThermoFisher Scientific公司(貨號(hào):15596026);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司(貨號(hào):X01787);實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司(貨號(hào):64435437);URAT1兔單克隆抗體購自美國Immunoway公司(貨號(hào):YN3803);OAT3兔單克隆抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司(貨號(hào):A14575);內(nèi)參β-actin鼠單克隆抗體購自美國CST公司(貨號(hào):3700S);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔和兔抗小鼠二抗購自美國Jackson公司(貨號(hào)分別為:111-035-003、315-035-003);蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào):G1121)。

1.3 主要儀器

BSH-C2型組織研磨儀和FC-1100型超微量紫外可見分光光度計(jì),杭州逐真生物技術(shù)有限公司;SUNRISE型酶標(biāo)儀,瑞士Tecan公司;4600SF型化學(xué)發(fā)光儀,上海天能科技有限公司;CFX Connec型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和Mini-PROTEAN Tetra型電泳儀,美國Bio-Rad公司;AU5800型全自動(dòng)生化分析儀,美國貝克曼庫爾特有限公司;R540LP型麻醉機(jī),深圳瑞沃德生命科技有限公司;Pannoramic MIDI型切片掃描儀,匈牙利3DHISTECH公司。

2 方法

2.1 分組與造模

將60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、苯溴馬隆組和健脾滲濕解毒湯低、中、高劑量組,每組各10只。除空白對(duì)照組外,其余各組大鼠均以腺嘌呤50 mg/kg +氧嗪酸鉀1.5 g/kg灌胃,1次/d,共灌胃21 d建立HUA大鼠模型[6]。

2.2 給藥方法

按照成人體質(zhì)量60 kg換算出大鼠等效劑量,健脾滲濕解毒湯低、中、高組給藥劑量分別為9.5 g/kg、18.9 g/kg、3.78 g/kg,苯溴馬隆組給藥劑量為5.25 mg/kg。健脾滲濕解毒湯(土茯苓30 g、蒼術(shù)15 g、萆薢20 g、薏苡仁30 g、黃柏15 g、威靈仙30 g、木瓜20 g、當(dāng)歸15 g、丹參15 g、雞血藤20 g)顆粒散劑用加熱后的蒸餾水溶解,配制成低(0.95 g/mL)、中(1.89 g/mL)、高(3.78 g/mL)3個(gè)不同濃度的溶液。苯溴馬隆片研磨成粉末狀后,于蒸餾水中溶解制成濃度為0.525 mg/mL的溶液。各藥物治療組大鼠在模型制備1 h后分別予苯溴馬隆溶液及不同濃度的健脾滲濕解毒湯灌胃,空白對(duì)照組和模型組大鼠予蒸餾水灌胃,1次/d,共持續(xù)21 d。

2.3 標(biāo)本采集

第21天末次給藥2 h后,異氟烷麻醉各組大鼠,腹主動(dòng)脈取血,收集血清保存于-80 ℃中用于血清生化指標(biāo)的檢測(cè)。取大鼠左腎液氮速凍后于-80 ℃保存用于總蛋白和總RNA提取,右腎及部分肝臟組織于4%多聚甲醛中固定用于腎臟及肝臟HE染色。

2.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

將收集的血清置于全自動(dòng)生化分析儀中檢測(cè)血尿酸(serum uric acid,SUA)、血肌酐(serum creatinine,SCR)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)含量。

2.5 腎臟及肝臟組織形態(tài)觀察

對(duì)腎臟和肝臟組織進(jìn)行固定后,進(jìn)行脫水和石蠟包埋處理,制成厚度為4 μm的切片,并根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行HE染色,在顯微鏡下觀察其病理變化。

2.6 Western blot檢測(cè)腎臟組織中URAT1和OAT3蛋白表達(dá)

取腎臟組織,加入適量蛋白裂解液提取組織蛋白質(zhì),蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,每組取30 μg總蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后,加入U(xiǎn)RAT1(1:1 000)、OAT3(1:1 000)、β-actin(1:1 000)一抗,4 ℃冰箱孵育過夜,次日加入二抗(1:5 000)常溫孵育1 h。洗膜后滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)液,化學(xué)發(fā)光成像儀中成像。利用Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析,并用目的蛋白與內(nèi)參的比值來表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腎臟組織中URAT1和OAT3 mRNA表達(dá)

取腎臟組織,提取總RNA,使用超微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法計(jì)算 URAT1和OAT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物由北京擎科生物科技有限公司合成,各引物序列見表1。

表1 引物序列表

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 健脾滲濕解毒湯對(duì)大鼠SUA、SCR、BUN水平的影響

如表2所示,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠SUA和SCR水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,苯溴馬隆組和健脾滲濕解毒湯低劑量組大鼠SUA水平明顯下降(P<0.01),健脾滲濕解毒湯中劑量和高劑量組大鼠SUA、SCR、BUN水平均明顯下降(P<0.05)。

表2 健脾滲濕解毒湯對(duì)大鼠SUA、SCR、BUN水平的影響

3.2 健脾滲濕解毒湯對(duì)大鼠AST、ALT水平的影響

如表3所示,各組大鼠血清AST、ALT水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 健脾滲濕解毒湯對(duì)大鼠AST、ALT水平的影響

3.3 健脾滲濕解毒湯對(duì)大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果表明各組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰;肝細(xì)胞排列規(guī)則,未見腫脹或壞死;肝竇間隙正常,未見擠壓或擴(kuò)張,同時(shí)未見明顯炎癥組織浸潤,見圖1。

A.空白對(duì)照組;B.模型組;C.苯溴馬隆組;D.健脾滲濕解毒湯低劑量組;E.健脾滲濕解毒湯中劑量組;F.健脾滲濕解毒湯高劑量組圖1 大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察(HE ×200)

3.4 健脾滲濕解毒湯對(duì)大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果表明空白對(duì)照組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)基本正常,模型組大鼠可見腎小球萎縮并呈現(xiàn)顆粒樣變性,腎小管擴(kuò)張,腎小管上皮細(xì)胞空泡變性;與模型組比較,各藥物治療組大鼠腎臟病理損傷均有所減輕,其中健脾滲濕解毒湯高劑量組大鼠改善較為明顯,見圖2、圖3。

A.空白對(duì)照組;B.模型組;C.苯溴馬隆組;D.健脾滲濕解毒湯低劑量組;E.健脾滲濕解毒湯中劑量組;F.健脾滲濕解毒湯高劑量組圖2 大鼠腎小球形態(tài)學(xué)觀察(HE ×400)

A.空白對(duì)照組;B.模型組;C.苯溴馬隆組;D.健脾滲濕解毒湯低劑量組;E.健脾滲濕解毒湯中劑量組;F.健脾滲濕解毒湯高劑量組圖3 大鼠腎小管形態(tài)學(xué)觀察(HE ×400)

3.5 健脾滲濕解毒湯對(duì)大鼠腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1、OAT3表達(dá)的影響

如圖4所示,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠腎臟組織中URAT1的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),OAT3的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01);與模型組比較,苯溴馬隆組和健脾滲濕解毒湯高劑量組大鼠腎臟組織中URAT1的蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.01),OAT3的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。

注:與空白對(duì)照組比較 ##P<0.01;與模型組比較*P<0.05,**P<0.01;尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(URAT1),有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(OAT3)A.空白對(duì)照組;B.模型組;C.苯溴馬隆組;D.健脾滲濕解毒湯低劑量組;E.健脾滲濕解毒湯中劑量組;F.健脾滲濕解毒湯高劑量組;圖4 健脾滲濕解毒湯對(duì)腎臟組織URAT1、OAT3蛋白表達(dá)的影響 (n=3)

3.6 健脾滲濕解毒湯對(duì)大鼠腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1、OAT3 mRNA表達(dá)的影響

如圖5所示,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠腎臟組織中URAT1的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),OAT3的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01);與模型組比較,苯溴馬隆組和健脾滲濕解毒湯高劑量組大鼠腎臟組織中URAT1的mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05),OAT3的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

注:與空白對(duì)照組比較 ##P<0.01;與模型組比較*P<0.05,**P<0.01;尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(URAT1),有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(OAT3)A.空白對(duì)照組;B.模型組;C.苯溴馬隆組;D.健脾滲濕解毒湯低劑量組;E.健脾滲濕解毒湯中劑量組;F.健脾滲濕解毒湯高劑量組;圖5 健脾滲濕解毒湯對(duì)腎臟組織URAT1、OAT3 mRNA表達(dá)的影響 (n=3)

4 討論

尿酸由嘌呤代謝產(chǎn)生,并通過尿酸酶氧化成更易溶于水的尿囊素,不通過腎小管的吸收而直接排出體外。與大多數(shù)哺乳動(dòng)物不同,人類缺乏尿酸酶,因此腎臟排泄是維持人體尿酸鹽水平穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。正常情況下人體每日約有90%的尿酸鹽經(jīng)腎臟過濾后從尿液中排出,尿酸的排出主要與腎臟的濾過、吸收、分泌及分泌后重吸收相關(guān),而近端小管是尿酸重吸收和排泄的主要部位[7-8]。尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如尿酸重吸收蛋白和尿酸分泌蛋白主要分布于腎臟近端小管內(nèi),對(duì)尿酸重吸收與排泄起著至關(guān)重要的作用[9]。

尿酸重吸收蛋白URAT1主要由SLC22A12編碼,位于近端腎小管上皮細(xì)胞的頂膜,通過介導(dǎo)管腔內(nèi)的尿酸與近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)無機(jī)陰離子、有機(jī)陰離子交換從而將尿酸從管腔內(nèi)重吸收至上皮細(xì)胞內(nèi)。URAT1是重要的尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在維持人體尿酸穩(wěn)態(tài)中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn),大鼠在高嘌呤負(fù)荷下, URAT1表達(dá)上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)尿酸的重吸收,導(dǎo)致尿酸排泄減少[10]。而通過藥物干預(yù)可使URAT1表達(dá)下調(diào),減少尿酸的重吸收,從而促進(jìn)尿酸排泄,降低HUA的發(fā)生[11-12]。隨著研究的深入,目前已有多個(gè)URAT1抑制劑被批準(zhǔn)用于HUA的臨床治療[13]。因此,URAT1是治療HUA的重要藥物靶點(diǎn)。

OAT3是尿酸分泌蛋白,由SLC22A8基因編碼,位于近端小管上皮細(xì)胞的基底外側(cè),主要功能是將尿酸從近端腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至腎小管腔。有研究證實(shí),敲除OAT3 后小鼠腎小管的尿酸鹽分泌下降,尿酸的排出減少,表明OAT3的基本功能是促進(jìn)尿酸鹽的排泄[14]。同時(shí)近期多項(xiàng)研究表明,在HUA中OAT3的表達(dá)是下調(diào)的,通過藥物干預(yù)使OAT3表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)尿酸排泄,進(jìn)而降低HUA的發(fā)生[15-16]。以上研究提示,OAT3在尿酸的排泄中發(fā)揮重要作用。

目前,HUA在我國患病率逐年升高,而民眾對(duì)HUA了解程度低,起始治療晚,極大地降低了病人的生活質(zhì)量及預(yù)期壽命,亦為家庭及社會(huì)帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。西醫(yī)治療HUA的藥物主要涉及抑制尿酸生成、促進(jìn)尿酸排泄及促進(jìn)尿酸溶解。這些藥物能有效降低血液尿酸水平,但部分患者易出現(xiàn)胃腸道刺激、皮疹、肝損害等不良反應(yīng)[17],臨床應(yīng)用受到了一定的限制。中醫(yī)藥治療以整體觀念和辨證論治為基礎(chǔ),有一藥或一方多效、作用靶點(diǎn)廣泛等優(yōu)勢(shì),在降尿酸、抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛等方面發(fā)揮重要作用[18]。健脾滲濕解毒湯方中土茯苓解毒除濕、通利關(guān)節(jié),黃柏苦寒清熱燥濕,蒼術(shù)苦辛溫燥、燥濕健脾,綿萆薢、薏苡仁利濕祛濁、宣解毒痹,威靈仙祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛,佐以木瓜、丹參、當(dāng)歸、雞血藤活血通絡(luò)利滯,共奏濕濁去、血脈通、筋脈利之效。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示健脾滲濕解毒湯可有效降低HUA大鼠血清尿酸含量,且本方對(duì)HUA引起的腎臟損傷也有一定的保護(hù)作用。其使血尿酸下降的作用機(jī)理可能與其抑制尿酸重吸收蛋白URAT1表達(dá)和上調(diào)尿酸分泌蛋白OAT3表達(dá)相關(guān)。由于健脾滲濕解毒湯是首次用于降尿酸的治療,因此對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)的安全性評(píng)價(jià)顯得尤為必要,本研究發(fā)現(xiàn)該方在發(fā)揮降尿酸作用的劑量下未見明顯肝毒性,具有一定的安全性,這也為后期對(duì)該方開展臨床研究奠定了基礎(chǔ)。