葛根素對D-半乳糖誘導衰老小鼠心臟的保護作用?

宋 沖,杜 青,李心亮△

(1.長沙民政職業(yè)技術學院醫(yī)學院,長沙 410004;2.湖南中醫(yī)藥研究院中藥研究所,長沙 410006)

衰老是一個持續(xù)的生理過程,伴隨著細胞、組織和器官的物質(zhì)、形態(tài)和功能退化[1]。然而,衰老癥狀直到一個人到了特定的年齡階段才會出現(xiàn)。由于人口的快速增長以及平均壽命的增長,人口老齡化已成為全球趨勢,衰老正成為一個嚴重的社會經(jīng)濟問題。臨床數(shù)據(jù)表明,老年人心臟病的發(fā)病率和病死率明顯高于青年人[2]。在過去的幾十年,研究人員發(fā)現(xiàn)心臟衰老往往會導致心血管疾病,如心肌缺血、動脈粥樣硬化和心臟纖維化,最終導致心力衰竭。此外,衰老也被認為是心血管手術的危險因素[3]。因此,迫切需要尋找新的抗衰老藥物,以減輕與衰老相關的心臟損傷,改善老年人的健康。

新近研究表明,從植物中分離出的天然活性物質(zhì)或成分可能是預防和治療衰老相關疾病的候選藥物,如銀杏葉提取物、白藜蘆醇和風流草總醇提物等[4-6]。葛根是一種具有生物活性的中草藥,在食品和醫(yī)藥行業(yè)有廣泛的應用。其中葛根素是從葛根中分離得到的主要藥理活性成分,廣泛應用于心血管疾病的治療[7-8]。然而,迄今為止尚未研究葛根素對D-半乳糖誘導的心臟衰老的影響。因此,本研究擬通過建立D-半乳糖誘導的心臟衰老和損傷模型,進一步明確葛根素的抗衰老活性及其潛在的可能機制。實驗方案經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院醫(yī)學動物福利委員會批準,編號:SYXK-2016/0002。

1 材料和方法

1.1 動物

雄性昆明小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量為18～22 g,購自北京維通利華實驗動物中心,實驗動物許可證號:SYXK(湘)2020-0024。所有實驗均根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南進行,所有實驗小鼠于湖南省中醫(yī)藥研究院動物中心飼養(yǎng),相對濕度55%,溫度25 ℃,分籠喂養(yǎng)于光照/黑暗為12 h/12 h的恒溫環(huán)境,自由攝食和飲水,適應性飼養(yǎng)1 周后進行實驗。

1.2 藥物、主要試劑和儀器

葛根素購自元燁生物科技有限公司,貨號:P111270;D-半乳糖購自美國Sigma公司,貨號:V900922;總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司,貨號:S0109;丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司,貨號:S0131S;活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司,貨號:S0033S;p21、p53、4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)一抗均購自英國Abcam公司,貨號分別為:ab109199、ab131442、ab46545;Western blot二抗購自北京全式金生物技術公司,貨號:HS231-01。

C8000自動生化分析儀,美國Abbott Pharmaceutical公司;MULTISKANMK3型全自動多功能酶標儀、ST16R高速冷凍離心機,美國賽默飛世爾科技公司;CX33型光學顯微鏡,日本奧林巴斯有限公司;RM2235型石蠟組織切片機,德國徠卡公司。

1.3 分組與造模

24只小鼠隨機分為4組,每組6只:對照組,D-半乳糖組,葛根素低劑量組(200 mg/kg,灌胃60 d),葛根素高劑量組(400 mg/kg,灌胃60 d)。除對照組外,其余各組小鼠均給予連續(xù)60 d每日頸部皮下注射D-半乳糖0.9%氯化鈉溶液500 mg/kg,對照組頸部皮下注射等體積0.9%氯化鈉溶液。除對照組外,其他3組小鼠逐漸出現(xiàn)毛色晦暗,易脫落,皮膚彈性差,精神萎靡,倦怠嗜睡,進食明顯減少,體質(zhì)量增加緩慢,呈現(xiàn)明顯衰老體征,表明衰老小鼠模型構(gòu)建成功。

1.4 給藥方法

葛根素混懸液的制備:取葛根素干粉200 mg, 加入0.5%的羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose sodium,CMC-Na)溶液10 mL,配制成20 mg/mL的葛根素混懸液。葛根素低劑量組與高劑量組每日分別灌胃低劑量(200 mg/kg)和高劑量(400 mg/kg)的葛根素混懸液一次,對照組和D-半乳糖組在相同時間點灌服等量的0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)灌胃60 d,每周稱量體質(zhì)量,灌胃給藥的實際劑量根據(jù)小鼠體質(zhì)量的變化實時調(diào)整。葛根素的劑量根據(jù)預實驗確定。

1.5 處死與取材

所有動物均通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉。通過眼眶采血獲得血樣。解剖心臟并用冷0.9%氯化鈉溶液沖洗。一部分心臟置于10%福爾馬林溶液中固定保存,用于組織病理學觀察。剩余部分心臟在液氮中快速凍存,然后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?用于進一步的生化分析。

1.6 肌酸激酶(creatine kinase,CK)和心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)測量

從動物身上采集的血樣在4 ℃下離心獲得血清。采用自動生化分析儀檢測血清cTnT和CK生化指標。CK和cTnT測定按照試劑說明書進行。

1.7 ELISA法檢測MDA含量和SOD活性

將心肌組織和0.9%氯化鈉溶液按1:9比例通過超聲處理制備10%的心臟組織勻漿,之后,將裂解的組織勻漿離心取上清液配制成適當?shù)臐舛?嚴格按照試劑盒說明書步驟操作,測定MDA和SOD活性的含量。

1.8 活性氧測量

取心肌組織快速置于-20 ℃冰箱凍存,冰凍切片機切片,之后取二氫乙錠(dihydroethidium,DHE)置于冰凍切片孵育,檢測細胞內(nèi)ROS水平。細胞內(nèi)DHE被氧化成乙錠,乙錠與DNA結(jié)合,使細胞核染成明亮的熒光紅色。心肌組織切片ROS水平的檢測按照試劑盒說明書進行。

1.9 免疫組織化學染色

將心肌組織包埋在石蠟中并切片(5 μm)。通過用0.3% H2O2處理淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性,然后用1% Triton X-100 和1%正常兔血清孵育2 h。切片用對應的一抗(8-OHdG,1:500)4 ℃孵育過夜,然后滴加山羊抗小鼠二抗(1:1 000)孵育約2 h。通過二氨基聯(lián)苯胺引起的顯色反應檢測出陽性信號。熒光顯微鏡下觀察免疫組織化學圖像。

1.10 Western blot

用放射免疫沉淀法緩沖液(Radioimmunoprecipitation assay buffer,RIPA緩沖液)[含0.1% 苯甲磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride,PMSF)]研磨心肌組織以提取蛋白質(zhì)。將等量的蛋白質(zhì)通過10%或12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜中。之后5%脫脂牛奶封閉膜1 h,4 ℃一抗孵育過夜,之后二抗室溫下孵育1 h。采用ImageJ 1.43分析軟件檢測分析化學發(fā)光信號和條帶強度。一抗的稀釋比例如下:p21 (1:1 000)、p53 ( 1:1 000)、4-HNE (1:1 000) 和GAPDH (1:2 000)。

1.11 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 葛根素減輕 D-半乳糖誘導的衰老小鼠的心肌損傷

4-半乳糖誘導的心肌損傷是用于研究心臟衰老的常見模型。本研究采用蘇木精-伊紅( hematoxylin-eosin,HE)染色觀察心肌形態(tài)學改變。結(jié)果顯示,與對照組比較,D-半乳糖組小鼠心肌組織炎癥浸潤和心肌纖維排列紊亂,心肌纖維結(jié)構(gòu)破壞嚴重,與D-半乳糖組比較,葛根素給藥組小鼠的心肌細胞排列整齊有序,心肌纖維無斷裂和結(jié)構(gòu)破壞,組織炎癥反應明顯減輕,見圖1。此外,心肌組織損傷酶的變化如CK和cTnT,如圖1所示,與對照組比較,D-半乳糖組小鼠血漿CK和cTnT水平升高,而與D-半乳糖組比較,葛根素給藥組小鼠血漿中這些特異性心肌酶水平明顯降低,表明葛根素可減弱D-半乳糖誘導的心肌損傷。

注:與對照組比較**P<0.01;與D-半乳糖組比較#P<0.05;心肌肌鈣蛋白T(cTnT),肌酸激酶(CK)A.心肌組織HE染色典型圖(×200);B、C.葛根素對心肌組織損傷酶CK和cTnT含量影響的定量分析圖1 葛根素對D-半乳糖誘導的心肌損傷的影響(n=3)

2.2 葛根素抑制D-半乳糖誘導的衰老小鼠心臟相關指標

文獻認為,衰老與p21和p53表達上調(diào)密切相關[9]。因此,本研究對心肌組織進行了p21和p53蛋白表達檢測來反映心臟衰老水平。結(jié)果顯示,與對照組比較,D-半乳糖組小鼠心肌組織p21和p53表達上調(diào),與D-半乳糖組比較,葛根素給藥組可以逆轉(zhuǎn)這些改變,見圖2。這些結(jié)果表明心臟衰老模型的建立是成功的,同時葛根素可以抑制D-半乳糖誘導的心臟衰老。

注:與對照組比較**P<0.01;與D-半乳糖組比較#P<0.05A.葛根素對p21和p53表達影響的典型圖;B.葛根素對心肌組織p21和p53表達影響的定量分析圖2 葛根素對D-半乳糖誘導的心肌p21和p53表達的影響(n=3)

2.3 葛根素抑制D-半乳糖誘導的衰老小鼠心肌氧化應激

氧化應激在心臟衰老過程中起關鍵作用,ROS的過度產(chǎn)生被認為是典型特征。如圖3所示,使用ROS熒光探針DHE測量心肌中的ROS水平,結(jié)果顯示D-半乳糖組小鼠心肌ROS水平升高。抗氧化酶SOD負責氧化應激過程中促氧化劑和抗氧化劑的平衡,脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA也反映了氧化應激水平。結(jié)果表明,與對照組比較,D-半乳糖組小鼠MDA含量顯著提高,SOD活性降低,表明動物心肌組織氧化應激水平升高。然而與D-半乳糖組比較,葛根素給藥組抑制D-半乳糖誘導的心肌氧化應激,表現(xiàn)為ROS水平和MDA含量降低,以及SOD含量增加。

注:與對照組比較**P<0.01;與D-半乳糖組比較#P<0.05;活性氧(ROS),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)A、B.葛根素對ROS的影響(×200);C.葛根素對心肌組織MDA含量的影響; D.葛根素對心肌組織SOD含量的影響圖3 葛根素對D-半乳糖誘導的心肌氧化應激的影響(n=6)

2.4 葛根素減輕D-半乳糖誘導的衰老小鼠氧化應激誘導的心肌脂質(zhì)過氧化和DNA損傷

增加的氧化應激誘導組織脂質(zhì)過氧化和DNA損傷,最終導致心臟老化和損傷。為了進一步證實葛根素對D-半乳糖誘導的心臟衰老和損傷的保護作用,本研究檢測了脂質(zhì)過氧化和DNA損傷相關指標。4-HNE和8-OHdG分別是代表脂質(zhì)過氧化和DNA損傷的典型標志物。如圖4所示,免疫組化結(jié)果表明,與對照組比較,D-半乳糖組小鼠心肌組織8-OHdG上調(diào),而與D-半乳糖組比較,葛根素給藥組減輕D-半乳糖對心肌組織8-OHdG的影響。Western blot結(jié)果顯示4-HNE蛋白表達與前述指標一致的趨勢。這些結(jié)果表明葛根素可以減輕D-半乳糖誘導的小鼠心肌組織氧化應激誘導的脂質(zhì)過氧化和DNA損傷。

注:與對照組比較**P<0.01;與D-半乳糖組比較#P<0.05;4-羥基-2-壬烯醛(4-HNE)A.葛根素對8-OHdG表達的影響(×20);B.4-HNE蛋白表達情況;C.4-HNE表達定量統(tǒng)計圖4 葛根素對D-半乳糖誘導的心肌損傷脂質(zhì)氧化和DNA損傷的影響(n=3)

3 討論

葛根素是從中藥干燥根莖葛根提取獲得的藥理活性成分,是一類異黃酮類化合物,已被證實具有抗衰老、抗炎、神經(jīng)保護和抗氧化、促進成骨細胞分化和保肝等多種作用[10-13]。新近研究發(fā)現(xiàn),葛根素通過14-3-3γ/蛋白激酶Cε(14-3-3γ/protein kinase Cε,14-3-3γ/PKCε)通路激活適用性自噬保護阿奇霉素誘導的心肌毒性,表明葛根素對心臟具有保護作用[14]。

近年來,越來越多的研究表明,心血管疾病的發(fā)病率和病死率隨著老齡化而增加,公眾對老年人潛在健康風險的關注度不斷提高。為了研究個體衰老的機制并評估抗衰老藥物在整體器官和組織水平上的療效,許多學者建立了多種實驗性衰老動物模型,其中D-半乳糖誘導的衰老動物模型是公認的較為理想的衰老模型[15]。文獻報道,低劑量的D-半乳糖注射液可誘導小鼠衰老加速作用[16-17]。D-半乳糖在體內(nèi)形成晚期糖基化終產(chǎn)物,升高的晚期糖基化終產(chǎn)物可能加速衰老過程[18],在D-半乳糖處理的小鼠中觀察到自由基紊亂、線粒體功能障礙和細胞損傷,這與自然衰老的小鼠相似。此外,D-半乳糖處理導致衰老相關基因包括p16和p21表達上調(diào)[19]?？傊?來自D-半乳糖的晚期糖基化末端衍生產(chǎn)物對衰老過程的促進可能歸因于其對氧化應激和衰老相關基因的影響。

本研究通過持續(xù)60 d皮下注射D-半乳糖建立衰老模型小鼠。與對照組比較,D-半乳糖引起動物出現(xiàn)明顯的運動頻率降低和毛皮粗糙,表明D-半乳糖損傷具有促衰老作用。CK和cTnT被認為是在臨床評估心臟損傷可靠的心肌損傷標志物[20]。本研究在D-半乳糖處理的小鼠中發(fā)現(xiàn)心肌纖維不規(guī)則排列和血漿CK和cTnT水平升高。細胞周期停滯也是不可逆衰老的重要指標。端粒功能障礙和 DNA 損傷被證明是細胞周期停滯的開始[21]。作為DNA損傷的下游效應因子之一,腫瘤抑制因子p53上調(diào)細胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21以將細胞阻滯在細胞周期的G1期[22-23]。Western blot結(jié)果顯示,D-半乳糖組p53和 p21的表達上調(diào),表明D-半乳糖成功誘導小鼠心臟衰老。進一步結(jié)果表明,葛根素可減輕D-半乳糖誘導的心臟衰老和損傷。據(jù)報道,葛根素通過上調(diào)糖皮質(zhì)激素受體,減輕氧化應激,抑制炎癥反應,延緩大腦、腎臟等組織的衰老[24-25]。然而,葛根素抑制心臟衰老的機制仍不清楚。眾所周知,ROS主要是由線粒體中發(fā)生的呼吸反應中的電子傳遞產(chǎn)生的。ROS積累引起的DNA損傷被認為是衰老的重要原因。ROS可以靶向核苷酸庫,提高p21、p53和p16的表達,最終加速細胞衰老過程[26]。此外,過度的氧化應激會破壞線粒體的氧化還原平衡,誘導脂質(zhì)過氧化,并破壞線粒體的膜結(jié)構(gòu)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞本身,逐漸導致衰老和功能退化[27]。本研究發(fā)現(xiàn)葛根素可以抑制D-半乳糖誘導的衰老小鼠心臟脂質(zhì)過氧化和DNA損傷,進一步證實葛根素通過抑制氧化應激來減輕心臟衰老。

然而,本研究仍有一些局限。盡管葛根素總體上對身體有益,但缺乏葛根素單獨組可能會引起對葛根素安全性的懷疑。此外,還沒有進行體外實驗來驗證體內(nèi)結(jié)論,抗衰老作用的詳細機制也沒有進行。值得在體外進行探索,這將是課題組進一步研究的重點。

總之,本研究首先證明了葛根素對D-半乳糖誘導的天然衰老模型小鼠的保護作用,其機制與抑制心肌組織的氧化應激有關。這些結(jié)果可能為支持葛根素在抗衰老治療中的作用提供科學依據(jù)。