表達(dá)PEDV S蛋白重組仙臺病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究

鄒靜嫻, 孟 慧, 潘朔楠, 陳振海,2, 牟春曉,2*

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 江蘇揚州 225009; 2. 揚州大學(xué)江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚州 225009)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是一種腸道冠狀病毒,能引起感染豬嚴(yán)重嘔吐、水樣腹瀉、脫水等癥狀[1]。各年齡段豬均易感PEDV, 感染仔豬后發(fā)病急,病死率高達(dá)100%。1970年在歐洲首先發(fā)現(xiàn)PEDV G1型[2], 2010年一種高致病性PEDV突變體(G2型)在中國出現(xiàn),隨后快速傳播至北美、歐洲和亞洲等許多國家[3]。目前,變異PEDV已成為導(dǎo)致仔豬腹瀉和高病死率的主要病原體,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV ORF2編碼的纖突糖蛋白(spike, S)屬于亞穩(wěn)態(tài)的Ⅰ類融合蛋白,主要負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞的吸附和膜融合,包括受體結(jié)合片段S1 (1～789 aa)和膜融合片段S2 (790～1 383 aa) 2個部分。S1包含優(yōu)勢抗原COE區(qū)域(499～638 aa)及2個B淋巴細(xì)胞位點(744～755和756～771 aa), S2的胞外區(qū)有胰酶切割位點[4]。S蛋白在與宿主細(xì)胞受體的相互作用以及進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用,還與病毒的體外適應(yīng)性生長及體內(nèi)毒力衰減密切相關(guān)[5]。更重要的是, S蛋白是誘導(dǎo)機體發(fā)生中和抗體反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白,因此S蛋白是設(shè)計開發(fā)PEDV疫苗的首選抗原蛋白。

2011年以來,我國大部分地區(qū)的豬場大規(guī)模暴發(fā)PED, 新生仔豬病死率達(dá)90%以上,說明以CV777毒株為基礎(chǔ)的商品化PEDV滅活、弱毒等傳統(tǒng)疫苗和免疫方式難以控制變異株的流行。因此,利用基因工程技術(shù)研發(fā)新型疫苗成為當(dāng)前的熱點。隨著哺乳動物細(xì)胞中的基因傳遞和表達(dá)技術(shù)在現(xiàn)代生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用,先進(jìn)的基因傳遞工具,如反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和陽離子脂質(zhì)試劑等,對基因治療和核酸疫苗起到重要的推動作用[6]。盡管目前已開發(fā)出多種DNA載體復(fù)合物,但重組病毒載體因為其基因表達(dá)能力強和感染宿主效果好等優(yōu)勢,仍是傳遞靶標(biāo)基因的主要選擇。

仙臺病毒(Sendai virus, SeV)又稱乙型副流感病毒,屬于副黏病毒屬, 1953年在日本分離獲得。近年來學(xué)者對仙臺病毒在細(xì)胞生物學(xué)和工業(yè)上有著廣泛的研究,發(fā)現(xiàn)仙臺病毒能作為重組病毒載體用于核酸疫苗的研發(fā)。仙臺病毒作為病毒載體的優(yōu)勢在于免疫原性強; 與細(xì)胞表面受體的識別、吸附、融合時間短,感染過程不受細(xì)胞周期的影響; 外源基因表達(dá)效率高且可調(diào)控; 病毒復(fù)制周期完全在胞質(zhì)中,安全性高; 基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA, 重組概率大大降低; 可在多種宿主的組織中表達(dá)[6]。目前,應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)開發(fā)的新一代仙臺病毒載體,不僅可進(jìn)一步提高載體的安全性,還可增加載體的容量,降低機體抗病毒免疫反應(yīng)。另外,仙臺病毒經(jīng)呼吸道黏膜感染,能誘導(dǎo)良好的黏膜免疫反應(yīng),由于機體的“共同黏膜免疫系統(tǒng)”, 使得仙臺病毒更適合作為黏膜免疫的重組疫苗載體,有效地抵抗黏膜感染的病毒。

本研究擬將PEDV流行株S蛋白全長基因插入仙臺病毒基因組P基因與M基因之間,構(gòu)建能表達(dá)PEDV S蛋白的重組仙臺病毒; 利用大腸埃希菌原核表達(dá)純化PEDV截短S蛋白(64～1 140 bp)作為對照,以小鼠為模型評價并比較重組仙臺病毒表達(dá)和大腸埃希菌表達(dá)的S蛋白所誘導(dǎo)的PEDV特異性免疫反應(yīng),為評價該重組仙臺病毒在豬體上的免疫原性和免疫效力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、病毒和試驗動物

原核表達(dá)載體pET-30(a)、仙臺病毒(SeV)載體系統(tǒng)包括病毒基因組骨架載體pBeloBAC-SeV以及輔助質(zhì)粒pCAGGS-T7-opt、pCAGGS-SeV-NP、pCAGGS-SeV-P、pCAGGS-SeV-L和對照質(zhì)粒pBeloBAC-SeV-GFP為本實驗室保存; 豬睪丸細(xì)胞(ST)、乳倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)由本實驗室保存;E.coliTop 10和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室制備并保存; PEDV-GX6/2021毒株(GenBank登錄號為OP603897)、SeV毒株為本實驗室保存; 6周齡BALB/c小鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.1.2 主要試劑

病毒RNA提取試劑盒、DNA聚合酶PrimeStar Max、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶等為日本TaKaRa公司產(chǎn)品; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒為北京全式金生物技術(shù)公司產(chǎn)品; PCR純化試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均為美國Omega公司產(chǎn)品; 超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為蘇州新賽美生物科技公司產(chǎn)品; His單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、Dylight 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為上海生工生物工程公司產(chǎn)品; DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均為美國Gibco公司產(chǎn)品; Lipofectamine 3000和CFSE熒光染料為美國Invitrogen公司產(chǎn)品; RIPA組織細(xì)胞裂解液、IPTG、淋巴細(xì)胞分離液、脫脂牛奶等為北京索萊寶生物科技公司產(chǎn)品; PVDF膜和弗氏佐劑為美國Sigma公司產(chǎn)品; SeV P蛋白單克隆抗體、PEDV S蛋白單克隆抗體為本實驗室保存。

1.2 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)PEDV-GX6/2021毒株全基因序列,設(shè)計擴增截短的PEDV S 基因(64～1 140 bp)的特異性引物, 引物F1為5′-CTGGGATCCGATGTCACCAGGTGCTCAG-3′, 引物R1為5′-CCGGGAATTCGTAAGTGTCACTTTAAG-3′, 在上游引物5′端引入酶切位點BamHⅠ, 在下游引物5′端引入酶切位點EcoRⅠ, 用于構(gòu)建原核表達(dá)S蛋白的重組質(zhì)粒; 另設(shè)計擴增全長PEDV S 基因(4 140 bp)的特異性引物, 引物F2為5′-GCTTTCACGGCGCGCCACCATGAAGTCTTTAACCTACTTCTGGTTGTTCTTACC-3′, 引物R2為5′-AGGATGGGACGTCTTAAACTTCGTAAGGTTGAAGTCTAGGAC-3′, 在上游引物5′端引入酶切位點AscⅠ, 在下游引物5′端引入酶切位點AatⅡ, 用于構(gòu)建重組表達(dá)S蛋白的SeV感染性克隆質(zhì)粒。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 原核表達(dá)PEDV S蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建

使用病毒RNA提取試劑盒提取PEDV-GX6/2021毒株全基因組RNA,并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA為模板、F1和R1為引物PCR擴增截短的S基因。將擴增的S基因進(jìn)行膠回收純化,利用酶切位點BamHⅠ和EcoRⅠ連入載體pET-30(a), 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30(a)-PEDV-S, PCR鑒定和序列測定驗證后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 原核表達(dá)PEDV S蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET-30(a)-PEDV-S轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,挑取單菌落培養(yǎng)過夜,按照1∶100 的比例擴大培養(yǎng),當(dāng)細(xì)菌D600 nm值達(dá)到0.4～0.6時,加入0.2 mmol·L-1IPTG于16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h; 5 000 r·min-1離心10 min收集菌體并超聲破碎,分別收集全菌、上清、沉淀,加入5×蛋白質(zhì)電泳緩沖液煮沸,經(jīng)SDS-PAGE檢測,驗證S蛋白表達(dá)位置及可溶性,同時設(shè)置pET-30(a)空載體作為陰性對照。

將收集的重組蛋白樣品進(jìn)一步切膠純化, SDS-PAGE電泳后將蛋白膠轉(zhuǎn)至預(yù)冷的KCl溶液(0.25 mmol·L-1)中5 min, 使蛋白質(zhì)條帶呈現(xiàn)白色。根據(jù)先前實驗室確定的S蛋白表達(dá)的位置,切下含目的蛋白的膠條與PBS溶液混合裝入透析袋中, SDS-PAGE電泳液進(jìn)行電洗脫, 3 h后去掉膠塊,上清裝入透析袋中并透析過夜。次日,檢測原核表達(dá)的S蛋白濃度并濃縮至1 mg·mL-1。同時取少量純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測蛋白質(zhì)純度。

1.5 重組仙臺病毒感染性克隆的構(gòu)建

以方法1.3中獲得的PEDV cDNA為模板, F2和R2為引物進(jìn)行PCR擴增全長S基因。將擴增的S基因進(jìn)行膠回收純化,用AscⅠ和AatⅡ?qū)基因片段和載體pBeloBAC-SeV進(jìn)行雙酶切,并用T4 DNA連接酶構(gòu)建重組SeV感染性克隆質(zhì)粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S, PCR鑒定和序列測定驗證后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組仙臺病毒的拯救與鑒定

將pBeloBAC-SeV-PEDV-S及其輔助質(zhì)粒,按pCAGGS-T7-opt 0.4 μg、pCAGGS-SeV-NP 0.2 μg、pCAGGS-SeV-P 0.2 μg、pCAGGS-SeV-L 0.6 μg、pBeloBAC-SeV-PEDV-S 1.1 μg的比例,利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中,同時設(shè)置轉(zhuǎn)染pBeloBAC-SeV-GFP及輔助質(zhì)粒作為陽性對照; 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至陽性對照細(xì)胞出現(xiàn)明顯的綠色熒光時,收獲轉(zhuǎn)染pBeloBAC-SeV-PEDV-S的細(xì)胞上清,獲得SeV-PEDV-S重組病毒。

將重組病毒SeV-PEDV-S進(jìn)一步感染ST細(xì)胞,并設(shè)置未感染病毒的細(xì)胞為對照, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng),觀察細(xì)胞病變并進(jìn)行間接免疫熒光染色(IFA)。細(xì)胞單層用4%多聚甲醛進(jìn)行室溫固定10 min, PBS清洗后, 將0.2% Triton X-100和4% BSA按1∶1的比例混勻加入細(xì)胞單層進(jìn)行細(xì)胞膜打孔和封閉孵育30 min; 隨后,運用SeV P蛋白單克隆抗體作為一抗37 ℃孵育1 h, Dylight 488標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗室溫避光孵育1 h; 最后使用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光,以檢測重組病毒SeV-PEDV-S是否成功拯救。

1.7 重組仙臺病毒生長曲線的測定

將ST細(xì)胞鋪于6孔板中,以MOI=0.01分別感染SeV和SeV-PEDV-S, 同時設(shè)置未接毒細(xì)胞作為對照; 置于37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h后, 棄去上清并加入含2%血清的培養(yǎng)基; 繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、36、48、60 h, 分別收集病毒液并進(jìn)行病毒效價測定,將ST細(xì)胞鋪于96孔板中, 收集的病毒液用含2%血清的培養(yǎng)基梯度稀釋后感染ST細(xì)胞, 每孔100 μL, 每個梯度設(shè)置4個重復(fù); 置于37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h, 每孔補加50 μL含2%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng); 觀察細(xì)胞病變情況并標(biāo)記,按照Karber法計算病毒效價。

1.8 PEDV S蛋白表達(dá)的Western blot鑒定

將重組病毒SeV-PEDV-S感染ST細(xì)胞,并設(shè)置未接毒細(xì)胞作為對照, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后, RIPA緩沖液裂解細(xì)胞,取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將分離膠的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h, TBST清洗后, 以PEDV S蛋白單克隆抗體作為一抗孵育過夜, HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗室溫孵育2 h, 最后使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影,觀察條帶。

取純化后的原核表達(dá)S蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,同時設(shè)置對照。按照上述Western blot試驗方法,以S蛋白單克隆抗體作為一抗, HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗檢測原核表達(dá)S蛋白的特異性。

1.9 小鼠的免疫與抗S蛋白特異性抗體的鑒定

取36只6周齡BALB/c雌性小鼠,隨機均分為4組, 分別以滴鼻和每只皮下注射250 μL的方式免疫SeV-PEDV-S組(106.2TCID50·mL-1)、SeV組(107TCID50·mL-1)、PEDV-S蛋白組(1 mg·mL-1+弗氏佐劑)和DMEM組。首免后第3、5周分別加強免疫。第3次免疫后10 d對各組小鼠進(jìn)行采血,并運用分離的血清作為一抗進(jìn)行IFA和Western blot試驗,鑒定小鼠血清中特異性抗體產(chǎn)生情況。

以方法1.6中IFA試驗鑒定小鼠血清中特異性抗體的產(chǎn)生情況, PEDV按MOI=0.05感染Vero細(xì)胞, 48 h后棄去培養(yǎng)基,以小鼠血清作為一抗(1∶200稀釋), Dylight 488標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗分別進(jìn)行孵育,最后觀察特異性綠色熒光。以分離的SeV-PEDV-S組小鼠血清作為一抗, HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗,以方法1.7中Western blot試驗檢測血清中特異性抗體的產(chǎn)生情況。

1.10 免疫后小鼠血清中和抗體的測定

對第3次免疫后10 d的小鼠血清進(jìn)行中和抗體滴度測定,將PEDV (100 TCID50)與倍比稀釋的血清等體積混合, 37 ℃作用1 h后加到96孔板培養(yǎng)的Vero細(xì)胞單層上, 37 ℃、5% CO2吸附2 h后棄去上清,加入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d; 顯微鏡下觀察并記錄病變產(chǎn)生情況,血清抗體中和PEDV的滴度按照Karber方法計算。

1.11 免疫后小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的檢測

第3次免疫后10 d每組選取5只小鼠,處死并無菌分離小鼠脾臟,并研磨成單細(xì)胞懸液,利用淋巴細(xì)胞分離液分離T淋巴細(xì)胞并計數(shù)。按照107個·mL-1的濃度加入CFSE熒光染色液, 37 ℃避光孵育10 min, 隨后加入預(yù)冷且含10%血清的培養(yǎng)基終止染色反應(yīng), PBS清洗后獲得綠色熒光標(biāo)記的T淋巴細(xì)胞。分別向每個免疫組的T淋巴細(xì)胞中加入105TCID50的PEDV, 置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4～5 d, 收集細(xì)胞并用流式細(xì)胞術(shù)檢測每組中T淋巴細(xì)胞的增殖情況。采用FCS Express 4軟件對流式細(xì)胞檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)PEDV S蛋白重組質(zhì)粒的鑒定

使用S基因特異性引物,以PEDV cDNA為模板,成功擴增出目的基因片段1 077 bp (圖1)。將該片段克隆至pET-30(a)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30(a)-PEDV-S, 酶切重組質(zhì)粒鑒定,根據(jù)核酸電泳結(jié)果,得到了重組質(zhì)粒(圖1)。

圖1 原核表達(dá)PEDV S蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建*Fig.1 The construction of recombinant plasmid pET-30(a)-PEDV-S* M1. DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn), 1. 截短S基因PCR擴增; M2. DL5000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn), 2. 重組質(zhì)粒pET-30(a)-PEDV-S酶切鑒定, 3. 重組質(zhì)粒pET-30(a)-PEDV-S電泳鑒定。* M1. DL2000 DNA marker, 1. PCR amplification of truncated S gene; M2. DL5000 DNA marker, 2. identification of pET-30(a)-PEDV-S by reconstriction enzymes, 3. identification of pET-30(a)-PEDV-S by agarose gel electrophoresis.

2.2 原核表達(dá)PEDV S蛋白的表達(dá)純化與鑒定

重組質(zhì)粒pET-30(a)-PEDV-S轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中, 使用IPTG低溫誘導(dǎo)蛋白表達(dá),收集細(xì)菌并超聲破碎。根據(jù)SDS-PAGE電泳結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),截短的S蛋白主要在細(xì)菌裂解沉淀中表達(dá),蛋白質(zhì)大小約為39.3 ku, 融合6×His標(biāo)簽后大小約為45 ku, 符合預(yù)期結(jié)果。經(jīng)過切膠純化后,獲得純度和濃度較高的重組PEDV S蛋白(圖2.A)。對原核表達(dá)S蛋白的特異性進(jìn)行Western blot檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),原核表達(dá)S蛋白泳道出現(xiàn)特異條帶,融合蛋白分子量約為45 ku, 符合預(yù)期結(jié)果,而對照樣品泳道中未出現(xiàn)特異條帶(圖2.B)。

圖2 原核表達(dá)PEDV S蛋白的表達(dá)純化與鑒定*Fig.2 The expression, purification, and identification of PEDV S protein* A圖中, M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn), 1. pET-30(a)全菌, 2. pET-30(a)上清, 3. pET-30(a)沉淀, 4. pET-30(a)-PEDV-S全菌, 5. pET-30(a)-PEDV-S上清, 6. pET-30(a)-PEDV-S沉淀, 7. 純化的S蛋白; B圖中, M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn), 1. BL21(DE3)上清, 2. 純化的S蛋白。* In figure A, M. protein marker, 1. pET-30(a) whole cell, 2. pET-30(a) supernatant, 3. pET-30(a) precipitation, 4. pET-30(a)-PEDV-S whole cell, 5. pET-30(a)-PEDV-S supernatant, 6. pET-30(a)-PEDV-S precipitation, 7. purified S protein; In figure B, M. Protein marker, 1. BL21(DE3) supernatant, 2. purified S protein.

2.3 重組仙臺病毒感染性克隆的鑒定

將擴增得到的全長S基因克隆于pBeloBAC-SeV, 構(gòu)建重組質(zhì)粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S并進(jìn)行PCR擴增鑒定重組質(zhì)粒。根據(jù)核酸電泳結(jié)果,成功擴增出4 140 bp的S基因片段(圖3.B), 鑒定發(fā)現(xiàn),成功得到重組質(zhì)粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S (圖3.C)。

圖3 重組仙臺病毒感染性克隆的構(gòu)建與鑒定*Fig.3 The construction and identification of the recombinant SeV plasmid* A圖中, 重組質(zhì)粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S構(gòu)建示意圖; B圖中, M1. DL5000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 1. 全長S基因PCR擴增(4 140 bp); C圖中, M2. DL15000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 2. 重組質(zhì)粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S電泳鑒定, 3. 重組質(zhì)粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S的PCR鑒定。* In figure A, the construction diagram of recombinant plasmid pBeloBAC-SeV-PEDV-S; In figure B, M1. DL5000 DNA marker, 1. PCR amplification of S gene (4 140 bp); In figure C, M2. DL15000 DNA marker, 2. identification of pBeloBAC-SeV-PEDV-S by agarose gel electrophoresis, 3. identification of pBeloBAC-SeV-PEDV-S by PCR.

2.4 重組仙臺病毒的鑒定

為獲得SeV-PEDV-S重組病毒,將pBeloBAC-SeV-PEDV-S及其輔助質(zhì)粒按比例轉(zhuǎn)染細(xì)胞,同時轉(zhuǎn)染pBeloBAC-SeV-GFP和輔助質(zhì)粒作為陽性對照。逐日觀察陽性對照的綠色熒光強度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)第4天陽性對照有明顯的綠色熒光,收集轉(zhuǎn)染pBeloBAC-SeV-PEDV-S的細(xì)胞上清接種ST細(xì)胞,經(jīng)觀察轉(zhuǎn)染pBeloBAC-SeV-PEDV-S的細(xì)胞上清能引起細(xì)胞病變,且IFA檢測有特異性熒光,而對照細(xì)胞中未出現(xiàn)特異性熒光和細(xì)胞病變(圖4.A), 說明成功獲得SeV-PEDV-S重組病毒。運用Western blot試驗對SeV-PEDV-S重組病毒中S蛋白的特異性進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn), SeV-PEDV-S重組病毒感染的細(xì)胞樣品泳道出現(xiàn)特異條帶,分子量約為180 ku, 而對照樣品泳道中未出現(xiàn)特異條帶(圖4.B)。通過對重組仙臺病毒生長曲線的測定,發(fā)現(xiàn)該SeV-PEDV-S重組病毒與野生型SeV生長趨勢一致,且毒價為106.2TCID50·mL-1(圖4.C)。

圖4 重組仙臺病毒的鑒定和生長曲線的測定*Fig.4 The determination and growth curve of recombinant SeV* A. SeV-PEDV-S感染后的細(xì)胞病變觀察和IFA鑒定, 標(biāo)尺為50 μm; B. Western blot試驗檢測SeV-PEDV-S中S蛋白的表達(dá), M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn), 1. SeV感染的ST細(xì)胞樣品, 2. SeV-PEDV-S感染的ST細(xì)胞樣品; C. 重組仙臺病毒的生長曲線測定。* A. the cytopathological observation and IFA identification after SeV-PEDV-S infection, bar is 50 μm; B. detection of S protein expression in SeV-PEDV-S by Western blot, M. protein marker, 1. SeV infected ST cells, 2. SeV-PEDV-S infected ST cells; C. the growth curve of recombinant SeV.

2.5 免疫后小鼠血清特異性抗體的產(chǎn)生

以各免疫組小鼠第3次免疫10 d后采集的血清作為一抗,對PEDV感染的Vero細(xì)胞進(jìn)行IFA和Western blot試驗,以驗證各組免疫后小鼠體內(nèi)是否產(chǎn)生S蛋白的特異性抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn), SeV-PEDV-S免疫的小鼠血清作為一抗,在IFA和Western blot試驗中均具有較好的特異性(圖5.A、B)。PEDV-S蛋白組血清在IFA試驗中出現(xiàn)特異性熒光(圖5.A), 而其他免疫組的小鼠血清均沒有特異性熒光和特異性條帶出現(xiàn)。這說明SeV-PEDV-S免疫能顯著的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗PEDV S蛋白的特異性抗體。

圖5 免疫后小鼠血清中特異性抗體的檢測*Fig.5 The anti-PEDV S antibody in immunized mice* A. IFA試驗鑒定血清中特異性抗體, 標(biāo)尺為50 μm; B. Western blot檢測血清中特異性抗體, M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn), 1. 對照小鼠血清, 2. SeV-PEDV-S免疫的小鼠血清。* A. identification of S-specific antibodies by IFA, bar is 50 μm; B. detection of S-specific antibodies by Western blot, M. protein marker, 1. serum of control mice, 2. SeV-PEDV-S immunized mouse serum.

2.6 免疫后小鼠血清中和抗體效價的評價

為比較不同組免疫小鼠產(chǎn)生的抗S蛋白抗體對流行毒株P(guān)EDV-GX6/2021的中和活性,對第3次免疫后10 d的小鼠血清中和抗體滴度進(jìn)行測定,結(jié)果顯示, SeV-PEDV-S免疫組血清對PEDV-GX6/2021毒株有中和作用,平均中和滴度為1∶80, 而其他免疫組血清均沒有中和活性(圖6), 說明SeV-PEDV-S誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗PEDV S蛋白的特異性抗體能有效地發(fā)揮中和活性。

圖6 免疫后小鼠血清中和抗體效價☆Fig.6 The neutralization activities of immunized mice serum☆ T1. DMEM; T2. SeV; T3. SeV-PEDV-S; T4. PEDV-S。** P<0.01。圖7 免疫后小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖☆Fig.7 The T lymphocyte proliferative activity in immunized mice☆ T1. DMEM; T2. SeV; T3. SeV-PEDV-S; T4. PEDV-S。** P<0.01。A. 流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞增殖; B. 淋巴細(xì)胞增殖的統(tǒng)計。A. The detection of T lymphocyte proliferation on by flow cytometry; B. Statistics on the lymphocyte prolif-eration.

2.7 免疫后小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖

為檢測不同組小鼠的特異性T細(xì)胞免疫,對免疫后的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離和標(biāo)記,PEDV病原刺激后,檢測T淋巴細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn), SeV-PEDV-S組T細(xì)胞的增殖活性顯著高于其他組(圖7), 說明SeV-PEDV-S能有效激活小鼠的特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。

3 討論

近年來,以PEDV為主要病原的豬腹瀉疫情在中國、意大利、德國和美國等國家大規(guī)模發(fā)生,其中仔豬病死率達(dá)100%, 給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。控制PED疫情最重要的方法之一是接種疫苗,亞洲國家常規(guī)使用的是PEDV減毒疫苗和滅活疫苗。在母豬分娩前進(jìn)行疫苗接種,誘導(dǎo)母豬體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體并分泌到乳汁中,通過乳汁將母源抗體傳遞給新生仔豬而獲得免疫保護(hù)作用[7]。滅活疫苗雖然安全性高,但免疫有效期短,且需要適當(dāng)?shù)淖魟┎拍苷T導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)[8]。PEDV野毒株進(jìn)行連續(xù)傳代獲得的減毒活疫苗,雖然對同源毒株有一定的防控作用,但難以控制變異株,且研發(fā)周期長,還存在重組的安全性問題[9]。因此,探究新型高效的疫苗是目前防控PEDV的關(guān)鍵策略。

合適的抗原靶標(biāo)是疫苗研發(fā)的首要因素。在冠狀病毒編碼的蛋白質(zhì)中, S蛋白含有多個中和表位,是其主要的免疫原。多項研究指出,基于S蛋白不同結(jié)構(gòu)域的抗原在免疫動物后顯示出良好的免疫反應(yīng)。利用豬細(xì)胞真核表達(dá)的重組S1蛋白免疫懷孕母豬后,可通過被動免疫保護(hù)新生仔豬免受PEDV的感染[10]。表達(dá)S蛋白的復(fù)制型重組人腺病毒免疫小鼠后能刺激小鼠產(chǎn)生特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。重組PEDV COE區(qū)域的益生菌(乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌)在免疫動物后,發(fā)現(xiàn)S蛋白均有良好的免疫原性[5,11]。此外,昆蟲細(xì)胞表達(dá)的帶有S、M和E蛋白的包膜病毒樣顆粒也能有效地誘導(dǎo)與滅活PEDV疫苗相同的中和抗體滴度[12]。本研究選用PEDV流行毒株的S蛋白全長和截短的多肽免疫小鼠,能誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。

仙臺病毒載體已在減毒活疫苗和基因治療等領(lǐng)域進(jìn)行了臨床使用檢驗,其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用依賴于高效的外源基因表達(dá)、廣泛的宿主細(xì)胞特異性、低致病性和強免疫原性等優(yōu)勢。仙臺病毒與人副流感病毒1型(hPIV-1)具有相同的抗原性,能作為一種異種減毒活疫苗鼻內(nèi)免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生抗hPIV-1的免疫反應(yīng),且對人體無不良影響[6]。表達(dá)H5N1流感病毒M2蛋白的重組仙臺病毒鼻內(nèi)免疫小鼠,不僅能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),還能對其他物種的流感病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)作用[13]。表達(dá)口蹄疫病毒(FMDV) P1蛋白的重組仙臺病毒能有效誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α和IFN-β, 免疫后可誘導(dǎo)較高水平的FMDV特異性ELISA抗體、中和抗體和γ干擾素表達(dá)[14]。

一個組織部位的黏膜感染或黏膜免疫可在機體其他的黏膜表面產(chǎn)生SIgA并提供免疫保護(hù),這種現(xiàn)象稱為“共同黏膜免疫系統(tǒng)”[16]。由于并非所有的黏膜表面都是相互連接的,機體的黏膜表面可細(xì)化為“分隔”或“整合”的黏膜免疫系統(tǒng)[17]。例如,鼻腔接種疫苗可保護(hù)陰道,通過氣管上皮的免疫可賦予腸道免疫力[18]。不同黏膜表面之間由黏膜淋巴結(jié)中活化的淋巴細(xì)胞遷移或“歸巢”到黏膜表面來進(jìn)行相互連接[19]。這種組織特異性遷移是由細(xì)胞上特異性黏附分子和趨化因子受體(α4β7, CCR9)結(jié)合僅存在于黏膜組織上的配體完成[20]。本研究中PEDV通過腸道黏膜感染機體,其疫苗能有效誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng),對PEDV的防控至關(guān)重要。仙臺病毒從呼吸道黏膜感染,作為誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)的適合重組疫苗載體[15]。本研究中構(gòu)建的重組仙臺病毒(SeV-PEDV-S)經(jīng)Western blot驗證發(fā)現(xiàn),全長S蛋白的理論大小為150.8 ku, 而實際表達(dá)的大小約為180 ku, 說明仙臺病毒可有效表達(dá)PEDV S蛋白并能對S蛋白進(jìn)行糖基化修飾,從而保證S蛋白的正確折疊和發(fā)揮正常的生物學(xué)功能。SeV-PEDV-S在小鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)顯著的PEDV特異性免疫反應(yīng),包括特異性抗體、中和抗體和細(xì)胞免疫水平。這證明SeV作為一種預(yù)防PEDV感染的新型疫苗載體具有巨大的潛力。

4 結(jié)論

本研究中構(gòu)建并拯救了表達(dá)PEDV S蛋白的重組仙臺病毒(SeV-PEDV-S), 經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn), SeV-PEDV-S能成功表達(dá)全長PEDV S蛋白,并能有效地對S蛋白進(jìn)行修飾,確保S蛋白的正常生物學(xué)功能。此外, SeV-PEDV-S能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生PEDV特異性體液免疫、細(xì)胞免疫和中和抗體反應(yīng),為防控PEDV的新型疫苗研究提供新的方向。