葛花菊花水煎液中總黃酮含量的測定方法研究

權(quán)春梅,李金富,馬省委,曹帥,修慧迪,李媛媚,李揚(yáng),汪蘭蘭

(1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院,安徽 亳州 236800;2.安徽萬花草生物技術(shù)公司,安徽 亳州 236800;3.亳州學(xué)院 中藥學(xué)院,安徽 亳州 236800;4.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,安徽 合肥 230000)

葛花是豆科植物野葛(PuerariaLobata(Willd.)Ohwi)或甘葛藤(Pueraria.thom-soiiBeeth.)的未開放的干燥花。《神農(nóng)本草經(jīng)》等記載葛花是傳統(tǒng)的中藥解酒藥物,具有解酒醒脾的功效,主要治療酒后引起的嘔逆吐酸、發(fā)熱煩渴、吐血、 腸風(fēng)下血等癥狀。常用于傷酒煩熱口渴、頭痛頭暈、嘔吐吞酸、脘腹脹滿、不思飲食、吐血,腸風(fēng)下血等癥狀[1]。從古至今葛花被廣泛地應(yīng)用于解酒領(lǐng)域,在解酒方面可謂是有著獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷的地位。在《圣濟(jì)總錄》中記載葛花散:葛花一兩。上一味,搗為散,沸湯點(diǎn)一大錢匕,不拘時(shí)候,亦可煎服[2],來治飲酒中毒?！秳e錄》也有:“主消酒[3]?！苯┠昕蒲泄ぷ髡邔?duì)葛花的研究越來越多,發(fā)現(xiàn)葛花在解酒方面具有很高的藥用價(jià)值,葛花所含的化學(xué)成分較多,目前發(fā)現(xiàn)的主要有黃酮類、皂苷類、揮發(fā)油類、甾醇類、生物堿和氨基酸等,其中黃酮類化合物的含量相對(duì)最高[4]。葛花含有豐富的皂角苷、異黃酮能有效地抑制腸胃對(duì)酒精的吸收,促進(jìn)血液中酒精代謝和排泄[5]。此外,葛花中的鳶尾素可以抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性,并且能恢復(fù)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽的活性,起到保護(hù)肝臟的作用[6]。

菊花為菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)的干燥頭狀花序,性味甘、苦,微寒;歸肺、肝經(jīng),具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒;常用于頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒等[7]癥狀。其化學(xué)成分較復(fù)雜,最主要的有效成分為黃酮類、揮發(fā)油和三萜類化合物;具抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老耐疲勞、肝保護(hù)等作用[8-10]。

明代醫(yī)家杜文夑撰在《藥鑒》記載醫(yī)方“(菊花)…解醉漢昏迷,易醒,共干葛(宜葛花)煎湯?！贝朔绞菍⒏鸹ê途栈ㄔ谝黄鹩盟宸ㄖ苽涓鸹ň栈ㄋ逡?口服,來治療醉酒。而在葛花和菊花中,黃酮類物質(zhì)是兩者共有的成分,也是解酒的關(guān)鍵成分,因此,研究葛花菊花水煎液中總黃酮的含量對(duì)于研究該方的解酒機(jī)理和功效具有重要的意義。

目前適用于葛花總黃酮的含量測定方法有:分光光度法[11]、高效液相色譜法[12]、薄層色譜法[13]、毛細(xì)管電泳法[14]。分光光度法又包括可見分光光度法和紫外分光光度法。該法無需特別復(fù)雜的儀器設(shè)備,操作快捷方便,應(yīng)用廣泛。本文主要是利用分光光度法對(duì)葛花菊花水煎液中總黃酮含量的測定方法進(jìn)行研究,通過對(duì)比測量葛花水煎液中總黃酮濃度的不同方法,選擇適宜的測量葛花菊花水煎液中總黃酮濃度的方法。該研究為利用古方開發(fā)葛花菊花解酒功能飲料打下了基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)器材與試劑

1.1 材料和試劑

葛花(購自亳州康美中藥材市場),經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院程翔老師鑒別為野葛的花;亳菊花采收于安徽省亳州市譙城區(qū)小李村,經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院程翔老師鑒定為亳菊的花,并將其陰干儲(chǔ)存?zhèn)溆谩ＬJ丁標(biāo)準(zhǔn)品:江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司( 批號(hào): 200226-210404z);鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品:江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司(批號(hào):200153-160806);無水乙醇(國藥集團(tuán)有限公司); 純凈水(合肥娃哈哈飲料有限公司)。其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

全自動(dòng)煎藥鍋(廣東萌圈科技有限公司);UV-5900PC型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);天平(上海菁海儀器有限公司,FA21048);AE224C型電子計(jì)重計(jì)數(shù)天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器科技有限公司);移液器。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 可見分光光度法(顯色法)測定

2.1.1 樣品溶液的制備

稱取葛花和菊花各10 g,置于全自動(dòng)煎藥鍋中,加水700 mL浸泡30 min,設(shè)置煎煮時(shí)間為42 min,水煎后得到葛花菊花水煎液,過濾,即制得樣品原溶液。由于樣品原溶液的顏色較深,因此,需要稀釋。準(zhǔn)確取樣品原溶液1.00 mL置于100 mL容量瓶中,加純化水稀釋至刻度,即得樣品溶液。

2.1.2 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

稱取15.3 mg蘆丁對(duì)照品置100 mL容量瓶,用70%乙醇溶解至刻度處,即得0.153 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 顯色溶液的配制及顯色

10%硝酸鋁:精密稱量5 g的Al(NO3)3,在小燒杯中用純化水溶解,移至50 mL容量瓶中定容至刻度線處。

5%亞硝酸鈉:量取2.5 g的NaNO2,在小燒杯中用純化水溶解,移至50 mL容量瓶定容至刻度線處。

4%氫氧化鈉:量取2 g的NaOH,在小燒杯中用純化水溶解,至50 mL容量瓶定容至刻度線處。

樣品溶液和對(duì)照品溶液的顯色:準(zhǔn)確量取樣品溶液和對(duì)照品溶液各1 mL,按NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法,在10 mL容量瓶中依次添加顯色劑,然后在可見光范圍內(nèi)分別對(duì)樣品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描。

2.2 紫外分光光度法

2.2.1 以蘆丁為對(duì)照品的紫外分光光度法測定

蘆丁對(duì)照品溶液的制備:準(zhǔn)確取“2.1.2”中的蘆丁對(duì)照品溶液1.00 mL置10 mL容量瓶,用70%乙醇溶液定容至刻度。

樣品溶液的制備:同“2.1.1”樣品溶液的制備。

將蘆丁對(duì)照品溶液和樣品溶液在紫外光范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

2.2.2 以鳶尾苷為對(duì)照品的紫外分光光度法

鳶尾苷對(duì)照品溶液的制備:取鳶尾苷對(duì)照品2.0 mg用50%乙醇制成每1 mL含0.04 mg的溶液,得鳶尾苷對(duì)照品溶液。

樣品溶液的制備:同“2.1.1”樣品溶液的制備。

將樣品溶液和鳶尾苷對(duì)照品溶液在紫外光范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

3 結(jié)果與分析

3.1 可見分光光度法(顯色法)試驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)比蘆丁對(duì)照品溶液和樣品溶液顯色后在可見光區(qū)波長范圍內(nèi)的吸收曲線的特征(見圖1),來確定以蘆丁對(duì)照品的顯色法是否合適測定樣品溶液中總黃酮的含量。結(jié)果表明蘆丁對(duì)照品顯色后在506 nm處有吸收峰位,而樣品溶液在可見光范圍內(nèi)無吸收峰位。由此判斷該可見分光光度法中不適用于測定樣品溶液中總黃酮的含量。

圖1 蘆丁與樣品顯色后的溶液吸收光譜圖

3.2 紫外分光光度法試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 以蘆丁為對(duì)照品的試驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)比圖2中蘆丁對(duì)照品溶液與樣品溶液在紫外光的波長范圍內(nèi)是否具有共同的峰位,確定蘆丁對(duì)照品的紫外分光光度法是否適用于測定葛花菊花水煎液中的總黃酮。結(jié)果表明蘆丁對(duì)照品溶液在258 nm處有最大峰值,而樣品溶液在264 nm處有最大吸收峰值。兩者的吸收峰位相差6 nm。因此,如果以蘆丁對(duì)照品的紫外分光光度法來測定葛花菊花水煎液中的總黃酮,可能會(huì)因?yàn)閮烧呶辗逦坏牟罹嘣斐蓽y定誤差的增大。

圖2 蘆丁對(duì)照品溶液、鳶尾苷對(duì)照品額與樣品溶液的吸收光譜圖

3.2.2 以鳶尾苷為對(duì)照品的試驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)比圖2中鳶尾苷對(duì)照品溶液與樣品溶液在紫外-可見光區(qū)范圍內(nèi)的光譜吸收,得知鳶尾苷對(duì)照品溶液和樣品溶液在波長264 nm有吸收峰,兩者吸收峰位一致。表明了以鳶尾苷對(duì)照品的紫外分光光度法最適用于葛花菊花水煎液中的總黃酮含量的測定(見圖2)。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 入射光波長的確定

通過圖2得知鳶尾苷對(duì)照品溶液和樣品溶液均在波長264 nm有吸收峰,因此,把264 nm作為入射光的波長。

3.3.2 精密度試驗(yàn)

用“2.1.1”樣品溶液,以純化水作參比溶液,在最大波長264 nm處連測6次樣品溶液的吸光度,并記錄每次測量結(jié)果,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。試驗(yàn)結(jié)果如表1,經(jīng)過精密度實(shí)驗(yàn),RSD為0.11%(<5%)。表明用該方法測定葛花水煎液具有良好的精密度,符合含量分析的要求。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下的鳶尾苷對(duì)照品溶液和“2.1.1”樣品溶液,在最大波長264 nm處每隔10 min分別各測定一次吸光度,共測6次,并將測量的吸光度值記錄下來,以此計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),具體數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)鳶尾苷對(duì)照品溶液與葛花菊花水煎液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均為0.05 (<5% ) ,本實(shí)驗(yàn)說明該對(duì)照品溶液與葛花菊花水煎液在60 min內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.1.1”下樣品溶液,在最大波長264 nm處該樣品溶液的吸光度值。并記錄每次測量結(jié)果,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測試,發(fā)現(xiàn)這種方法的準(zhǔn)確度為0.11% ,表明其重復(fù)性較好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

4 結(jié)論

通過對(duì)比以上三種方法,結(jié)果表明NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色的可見分光光度法不適用葛花菊花水煎液中總黃酮的含量測定;紫外分光光度法中蘆丁對(duì)照品與樣品溶液吸收峰位存在一定的差距,也不是特別適合用來測定葛花菊花水煎液中總黃酮的含量。而鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品與樣品溶液的吸收峰基本一致,通過精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)證明該法符合方法學(xué)考察的要求,由此確定以鳶尾苷作為對(duì)照品的紫外分光光度法比較適合測定葛花菊花水煎液中總黃酮的含量。