第一代TRK抑制劑拉羅替尼關(guān)鍵手性胺中間體(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的合成工藝研究

裴超,陳玉琴,吳筱斐,柴文靜,楊愛青,王磊磊,劉團(tuán)偉,魏金建,*,孫洪宜*,張志德*

(1.中瀚(齊河縣)生物醫(yī)藥科技有限公司,山東 德州 251114;2.山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014;3.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院),山東省科學(xué)院生態(tài)研究所,山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250014)

Tropomycin-related kinase (TRK)為神經(jīng)營養(yǎng)因子酪氨酸激酶受體,隸屬于受體酪氨酸激酶家族[1-3]。大量的研究表明TRK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有很強(qiáng)的相關(guān)性,在神經(jīng)細(xì)胞瘤、前列腺癌、乳腺癌等中均發(fā)現(xiàn)了活化的TRK信號蛋白,近幾年來多種TRK融合蛋白的發(fā)現(xiàn)更顯示了其促進(jìn)腫瘤發(fā)生的生物學(xué)功能[4-5]。如果能抑制激酶活性,就能抑制癌癥生長,TRK抑制劑的原理就是抑制激酶的活性[6]。

美國Loxo Oncology公司開發(fā)的第一代TRK抑制劑拉羅替尼(圖1a)可有效治療17種腫瘤,針對多種基因融合的患者有效率高達(dá)76%,包括12%的患者腫瘤完全消失,該藥于2018年被FDA批準(zhǔn)上市,2022年4月13日獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)正式上市[5-6]。拉羅替尼具有口服、針對17種不同腫瘤均可使用的廣譜靶向抗癌藥,臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明拉羅替尼對不限年齡的TRK融合癌癥患者具有持久的抗腫瘤作用、良好的耐受性和很小的副作用等優(yōu)勢,是TRK基因突變癌癥患者的第一選擇[6]。然而拉羅替尼的價(jià)格非常昂貴,成人服用拉羅替尼膠囊30 d的費(fèi)用約為32 800美元(約合人民幣20萬元),兒童服用其口服液的費(fèi)用每月至少11 000美元?；颊吣[瘤部位的表面積越大,使用劑量越大,費(fèi)用越高,一般患者根本望塵莫及,而科技的進(jìn)步無法惠及萬千患者的根本在于原料藥的產(chǎn)業(yè)化工藝。拉羅替尼工業(yè)化的一個(gè)難點(diǎn)在于其關(guān)鍵手性胺片段(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(圖1b)的低成本制備,目前已報(bào)道的該中間體合成路線均通過手性誘導(dǎo)試劑或格氏試劑參與的反應(yīng)合成[7-10],通用的合成工藝路線如圖2所示。

圖1 拉羅替尼和其關(guān)鍵手性片段(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

路線1:

圖2 已報(bào)道的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的合成路線

路線1和2均采用手性誘導(dǎo)試劑(S)-2-叔丁基磺酰胺合成手性胺中間體,該試劑昂貴且具有難聞的臭味,不符合現(xiàn)有的環(huán)保要求,難于規(guī)模化應(yīng)用;此外,路線1使用昂貴的三乙基硼氫化鋰(LiBEt3)還原脫除叔丁基亞磺酰亞胺,需在-78 ℃下進(jìn)行,總收率僅為36%,生產(chǎn)成本極高,難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[7];路線2使用昂貴的2,5-二氟苯甲醛及2-(2-溴乙基)-1,3-二氧雜環(huán)己烷,且需要危險(xiǎn)的格氏反應(yīng)工藝,難于實(shí)現(xiàn)安全化,該路線原材料生產(chǎn)成本極高,難以規(guī)?；a(chǎn)[8];路線3采用昂貴的手性試劑誘導(dǎo)手性中間體的合成,且用到硼烷二甲硫醚,具有難聞的臭味,不符合現(xiàn)有的環(huán)保要求,該路線也使用危險(xiǎn)的格氏反應(yīng)工藝,難以實(shí)現(xiàn)操作安全化和規(guī)?；瘧?yīng)用[9-10]。以上報(bào)道的三條工藝路線雖然使用手性誘導(dǎo)催化劑,但所得的光學(xué)純度(ee值)較低,仍需對手性胺進(jìn)行化學(xué)拆分才能達(dá)到≥98% ee值的質(zhì)量要求,生產(chǎn)成本極高。

為解決以上報(bào)道合成路線中存在的共性問題,本論文研究了拉羅替尼關(guān)鍵手性胺中間體(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的創(chuàng)新合成路線(圖3),該路線以廉價(jià)的2,5-二氟甲苯為起始原料,經(jīng)氧化得到中間體1,經(jīng)酯化生成中間體2,后經(jīng)親核取代、酸解、脫羧和環(huán)合一步法得到中間體3,后經(jīng)還原得到消旋化物中間體4,再經(jīng)化學(xué)拆分得到手性胺目標(biāo)物,總收率為23%。該路線避免使用昂貴的原材料和試劑如手性誘導(dǎo)試劑、低溫和無水無氧環(huán)境,更適合拉羅替尼關(guān)鍵手性胺中間體(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的產(chǎn)業(yè)化。

圖3 本論文報(bào)道的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的新合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

400 MHz核磁共振譜儀(Bruker,Bruker Advance Ⅱ),高效液相色譜(Waters e2695)。

2,5-二氟甲苯、過硫酸鈉、乙腈、氯化亞砜、甲醇、N-甲基吡咯酮、鹽酸、硼氫化鈉、N-乙?；?D-半胱氨酸均為分析純試劑,來源于國藥集團(tuán)。

1.2 化合物的合成

1.2.1 2,5-二氟苯甲酸(中間體1)的合成

將2,5-二氟甲苯(20 g,0.16 mol)溶于100 mL乙腈中,室溫下緩慢加入過硫酸鈉(45.7 g,0.19 mol),緩慢升溫至60 ℃,TLC監(jiān)測至反應(yīng)完全(展開劑:正己烷),緩慢滴加水,析出淡黃色固體,抽濾、干燥得到23.5 g中間體1,收率95%,mp 132～134.1H NMR (400 MHz,d6-DMSO),δ: 13.54 (brs,1H,CO2H),7.60～7.63 (m,1H,Ar-H),7.51～7.55 (m,1H,Ar-H),7.37～7.42 (m,1H,Ar-H).19F NMR (372 MHz,d6-DMSO),δ: -116.07～-116.18 (m,1F),-118.04～-118.15 (m,1F)。

1.2.2 2,5-二氟苯甲酸甲酯(中間體2)的合成

將中間體1(22 g,0.14 mol)加入至110 mL甲醇中,室溫?cái)嚢柘戮徛渭勇然瘉嗧?20.2 g,0.17 mol),滴加完畢后,升溫至70 ℃反應(yīng)5 h,TLC檢測反應(yīng)結(jié)束(展開劑:乙酸乙酯/甲醇,體積比100∶1),減壓蒸出溶劑,攪拌降溫至0～5 ℃,滴加飽和NaHCO3(aq)調(diào)節(jié)pH值=7～8,加入二氯甲烷萃取(100 mL×2),有機(jī)相干燥,減壓蒸干得到23 g中間體2,收率:95.8%。1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 7.60～7.65 (m,1H,Ar-H),7.19～7.25 (m,1H,Ar-H),7.09～7.15 (m,1H,Ar-H),3.94 (m,3H,OCH3).19F NMR (372 MHz,d6-DMSO),δ: -115.42～-115.32 (m,1F),-118.12～-118.01 (m,1F)。

1.2.3 5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氫-2H-吡咯(中間體3)的合成

將N-甲基吡咯烷酮(13.8 g,0.14 mol)溶于100 mL乙腈中,降溫至-5～0 ℃,緩慢加入叔丁醇鉀(14.6 g,0.13 mol),攪拌10～15 min,將中間體2(20 g,0.12 mol)緩慢加入至上述反應(yīng)液中,滴加完畢后,室溫反應(yīng),TLC監(jiān)測中間體2消失(展開劑:乙酸乙酯/正己烷,體積比1∶5),降溫至室溫后,向上述反應(yīng)液中緩慢滴加15 mL濃鹽酸,升溫至70 ℃后保溫反應(yīng)6 h,調(diào)堿,減壓去除溶劑,二氯甲烷萃取、干燥,減壓除去溶劑得到淺黃色液體13.7 g,收率65.2%。1H NMR(400 MHz,CDCl3),δ: 7.22～7.27 (m,1H,Ar-H),6.91～6.97 (m,1H,Ar-H),6.83～6.87(m,1H,Ar-H),4.40(t,3H,J=7.6,CH2),3.13～3.22(m,1H),3.02～3.08 (m,1H),2.21～2.30 (m,1H),1.80～1.93 (m,1H),1.57～1.66 (m,1H).19F NMR (372 MHz,d6-DMSO),δ: -119.08～-118.98(m,1F),-124.87～-124.81 (m,1F)。

1.2.4 2-(2,5-二氟苯基)四氫吡咯(中間體4)的合成

將中間體3(13 g,0.07 mol)的甲醇溶液(130 mL)降溫至0～5 ℃,分批加入NaBH4(3.4 g,0.09 mol)后室溫反應(yīng),TLC監(jiān)控反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后,向體系中滴加水破壞NaBH4,減壓蒸出溶劑,二氯甲烷萃取,干燥有機(jī)相,蒸干得到12 g中間體4,收率92%。1H NMR(400 MHz,CDCl3),δ: 7.63～7.68(m,1H,Ar-H),7.02～7.10(m,2H,Ar-H),4.00～4.03(m,2H,CH2),2.70～3.02(m,2H,CH2),2.00～2.08(m,2H,CH2).19F NMR(372 MHz,d6-DMSO),δ: -118.89～-118.71 (m,2F)。

1.2.5 (R)-2-(2,5-二氟苯基)四氫吡咯(手性胺目標(biāo)物)的合成

將中間體4(10 g,0.05 mol)加入到50 mL異丙醇中,加入N-乙?；?D-半胱氨酸(8.1 g,0.05 mol),升溫80 ℃攪拌反應(yīng)5 h,降溫析晶,抽濾得到白色固體,將固體加入到水中,用2 mol/L NaOH(aq)調(diào)節(jié)堿性,二氯甲烷萃取,有機(jī)相干燥蒸干,重復(fù)上述操作一次,得到4.2 g淺黃色油狀手性胺目標(biāo)物,收率42%,經(jīng)衍生方法HPLC檢測得ee值為99.5%。

1.3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的液相檢測方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱:Xtimate?C18,4.6 mm×250 mm,5 μm P/N:00101-21043。

以0.01 mol/L乙酸銨/乙腈(體積比40∶60)為流動相,檢測波長為254 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2 溶液配制

1.3.2.1 制備溶液

向1.0 g(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷中加入30%氫氧化鈉溶液,樣品溶液pH值≥14,加入甲叔醚劇烈搖勻,靜置分層,將上層溶液轉(zhuǎn)移至干凈的旋蒸瓶,加壓濃縮除去甲叔醚,作為制備溶液。

1.3.2.2 供試品溶液

取制備溶液10 mg,加入20 mg衍生試劑N-α-(2,4-硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酸,加20 mL乙醇溶解,90 ℃下加熱回流2 min,濃縮除去乙醇,加入10 mL乙腈溶解,作為供試品溶液。

1.3.2.3 空白溶液

精密稱定20 mg衍生試劑N-α-(2,4-硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酸,加20 mL乙醇溶解,90 ℃下加熱回流2 min,濃縮除去乙醇,加入10 mL乙腈溶解,作為空白溶液。

1.3.3 樣品測試

取供試品溶液、空白溶液,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。按公司內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn),面積歸一化計(jì),ee值應(yīng)不低于99.5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成

與前期報(bào)道的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷工藝路線相比,本文報(bào)道的新路線避免了使用危險(xiǎn)的格氏反應(yīng)、昂貴的手性誘導(dǎo)試劑、低溫和無水無氧操作。以廉價(jià)的起始原料2,5-二氟甲苯經(jīng)氧化得到中間體1,采用無機(jī)鹽過硫酸鈉作為氧化劑,避免使用了重金屬氧化劑,簡化了后處理步驟。第二步甲酯化采用傳統(tǒng)的SOCl2/MeOH方法,為除去少量的中間體1,反應(yīng)后處理需用弱堿如飽和NaHCO3溶液調(diào)劑pH值至7～8,pH值過高會導(dǎo)致中間體2的水解。本工藝路線的關(guān)鍵在于中間3的合成,借鑒最新報(bào)道的尼古丁合成路線,采用親核取代、酸解、脫羧和環(huán)合反應(yīng)一步法生成中間體3。N-甲基吡咯酮在強(qiáng)堿叔丁醇鉀的存在下,形成碳負(fù)離子,進(jìn)攻中間體2羰基,形成1,3-二羰基化物,該中間態(tài)無需進(jìn)行分離,加酸導(dǎo)致吡咯酮開環(huán),加熱條件下脫羧,而在酸性條件下,羰基和胺基發(fā)生分子內(nèi)環(huán)合生成中間體3。中間體4的合成采用經(jīng)典的NaBH4還原即可高效實(shí)現(xiàn),消旋體中間體4在N-乙酰基-D-半胱氨酸存在下經(jīng)化學(xué)拆分即可高效得到單一光學(xué)手性的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷。

2.2 核磁共振氫譜分析

中間體1的1H NMR顯示7.0～8.0為苯環(huán)上三個(gè)氫的特征峰,13.5為羧基氫特征峰,說明中間體1被成功合成;而中間體2的1H NMR 顯示除7.0～7.5為苯環(huán)上的三個(gè)氫的特征峰外,3.8為甲酯甲基氫特征峰,中間體11H NMR中對應(yīng)的13.5處羧基氫消失,說明甲酯化反應(yīng)成功;中間體3的1H NMR在2.0～4.0范圍內(nèi)為吡咯環(huán)的三組亞甲基氫特征峰,與中間體2的1H NMR進(jìn)行對照,環(huán)合反應(yīng)發(fā)生且形成了中間體3;中間體4的1H NMR 在7.0～7.5為苯環(huán)上的三個(gè)氫的特征峰,4.2為與苯環(huán)相連的芐位氫特征峰,2.7為氨基氫特征峰,其他為吡咯環(huán)的三組亞甲基氫特征峰,說明還原反應(yīng)順利進(jìn)行,且生成了中間體4,目標(biāo)R型手性胺的1H NMR與中間體4相同。

2.3 純度分析

經(jīng)本文工藝路線合成的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的HPLC譜圖如圖4所示,6.8 min處對應(yīng)目標(biāo)R構(gòu)型,純度為99.82%,7.7 min為雜質(zhì)S異構(gòu)體,純度為0.18%,總體ee值為99.64%,遠(yuǎn)大于現(xiàn)有技術(shù)中的98%ee值的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),完全符合現(xiàn)有的原料藥申報(bào)質(zhì)量規(guī)范對異構(gòu)體限度的控制要求。

圖4 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的HPLC檢測結(jié)果,6.825 min處對應(yīng)的

化合物為R型異構(gòu)體的純度,7.758min處對應(yīng)的雜質(zhì)為S型異構(gòu)體

3 結(jié)論

報(bào)道了拉羅替尼關(guān)鍵手性片段(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的新合成工藝路線,即以廉價(jià)的2,5-二氟甲苯為起始原料,經(jīng)氧化、甲酯化、后經(jīng)親核取代、酸解、脫羧和環(huán)合一步法得到亞胺環(huán)合物,經(jīng)還原得到消旋化物,再經(jīng)化學(xué)拆分得到手性胺目標(biāo)物,總收率為23%,所得(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的光學(xué)純度為99.64%,遠(yuǎn)大于現(xiàn)有技術(shù)中的98%ee值的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),完全符合現(xiàn)有的原料藥申報(bào)質(zhì)量規(guī)范對異構(gòu)體限度的控制要求。該路線避免了使用危險(xiǎn)的格氏反應(yīng)、昂貴的手性誘導(dǎo)試劑、低溫和無水無氧操作,更適合拉羅替尼關(guān)鍵。