高效液相色譜-手性拆分法檢查消炎鎮(zhèn)痛膏非法添加阿托品研究

任琦，許妍，袁銘銘，付輝政，羅躍華，馬雙成

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050

消炎鎮(zhèn)痛膏處方由顛茄流浸膏、薄荷腦、冰片等七味藥組成，具有抗炎消腫、快速止痛的功效，臨床應(yīng)用于神經(jīng)痛、肩痛等。其標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第八冊(cè)［1］。方中顛茄流浸膏由顛茄草加工而成［2］，具解痙、止痛之功效［3］。查閱文獻(xiàn)［4-7］，顛茄草中含有莨菪堿，其主要為左旋（-）莨菪堿（即天仙子胺），僅含微量的右旋（+）莨菪堿，而阿托品為（-）莨菪堿與（+）莨菪堿的1∶1 等量外消旋體。因此，顛茄流浸膏中應(yīng)含（-）莨菪堿，不得含阿托品。

《中國(guó)藥典》2020 年版一部顛茄流浸膏【鑒別】及【檢查】項(xiàng)采用薄層色譜斑點(diǎn)顯示出的顏色來(lái)區(qū)分硫酸天仙子胺和硫酸阿托品兩種成分［3］。但當(dāng)顛茄流浸膏與其他藥物配伍形成復(fù)方制劑（消炎鎮(zhèn)痛膏），再利用薄層色譜進(jìn)行分析時(shí)，因復(fù)方制劑中存在其他藥物成分干擾，且硫酸天仙子胺與硫酸阿托品在薄層色譜中的比移值相同［8］，難以判定日光下顯色斑點(diǎn)顏色是灰藍(lán)色還是紅棕色。因此，采用薄層色譜法檢查含顛茄流浸膏的復(fù)方制劑（消炎鎮(zhèn)痛膏）中顛茄流浸膏是否非法添加阿托品，專(zhuān)屬性不強(qiáng)。由于顛茄流浸膏生產(chǎn)企業(yè)工藝、原藥材來(lái)源等存在不可控性因素，且現(xiàn)質(zhì)控方法不能有效區(qū)分左旋（-）莨菪堿（天仙子胺）與阿托品，使得在顛茄流浸膏中廣泛存在非法添加阿托品的情況［9］。故急需建立一種能夠準(zhǔn)確判定消炎鎮(zhèn)痛膏中顛茄流浸膏非法添加［10-13］阿托品檢查方法，為有效地控制及監(jiān)管消炎鎮(zhèn)痛膏質(zhì)量提供技術(shù)參考。

本實(shí)驗(yàn)建立了以手性色譜柱對(duì)阿托品中右旋（+）莨菪堿和左旋（-）莨菪堿進(jìn)行拆分的高效液相色譜法［14-16］，計(jì)算右旋（+）莨菪堿與左旋（-）莨菪堿峰面積的比值F（以下簡(jiǎn)稱(chēng)F 值），即可判定消炎鎮(zhèn)痛膏中顛茄流浸膏是否存在非法添加阿托品的情況，為保證消炎鎮(zhèn)痛膏及其他含顛茄流浸膏制劑的臨床用藥安全提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（DAD 檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）；Milli-Q Direct 16 超純水儀（德國(guó)密理博中國(guó)有限公司）；BT 25 S 天平、BSA 124S-CW 天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 材料

樣品：36 批消炎鎮(zhèn)痛膏（來(lái)源于國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2019 年國(guó)家藥品抽檢），具體信息見(jiàn)表1。

表1 36批消炎鎮(zhèn)痛膏F值測(cè)定結(jié)果

試藥：硫酸天仙子胺對(duì)照品（批號(hào)：111982-201401，含量：96.7%），硫酸阿托品對(duì)照品（批號(hào)：100040-201011，含量：96.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。試劑：甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 消炎鎮(zhèn)痛膏中阿托品檢查薄層色譜法初篩

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取硫酸天仙子胺對(duì)照品、硫酸阿托品對(duì)照品，加無(wú)水乙醇分別制成每1 mL 各含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品700 cm2，除去蓋襯，剪成條狀，置250 mL 燒瓶中，加乙醇150 mL，加熱回流1 h，取乙醇液，蒸至近干，趁熱，加5%硫酸溶液25 mL，攪拌，濾過(guò)，濾液加濃氨試液調(diào)節(jié)pH 值至9～10，用三氯甲烷振搖提取2 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇0.5 mL 使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取陰性對(duì)照樣品，照供試品溶液制備方法制成缺顛茄流浸膏的陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 色譜條件 照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液10 μL、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以丙酮-水-濃氨試液（90∶7∶3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在105 ℃干燥5 min，放冷，依次噴以稀碘化鉍鉀試液及10%亞硝酸鈉溶液（臨用新配），放置5～10 min。

2.1.5 方法專(zhuān)屬性 供試品色譜中，在與硫酸天仙子胺相應(yīng)的位置上，顯相同的紅棕色斑點(diǎn)，并不得呈現(xiàn)與硫酸阿托品一致的灰藍(lán)色斑點(diǎn)［2］。結(jié)果陰性對(duì)照在相應(yīng)的位置上無(wú)相同顏色的斑點(diǎn)，無(wú)干擾，薄層色譜圖見(jiàn)圖1。同時(shí)進(jìn)行了耐用性試驗(yàn)考察，分別在不同溫度、不同相對(duì)濕度、不同薄層板等條件下試驗(yàn)，結(jié)果均能達(dá)到良好的分離效果。

圖1 薄層色譜圖

2.1.6 檢出限試驗(yàn) 為了探究試樣中添加多少比例的阿托品，才能使薄層斑點(diǎn)顏色由紅棕色（硫酸天仙子胺）變?yōu)榛宜{(lán)色（硫酸阿托品），本研究用天仙子胺對(duì)照品模擬試樣添加硫酸阿托品，分別配制了硫酸阿托品/天仙子胺不同比例的混合對(duì)照品。在硫酸阿托品的點(diǎn)樣量（10 μg）固定不變的情況下，結(jié)果：當(dāng)添加硫酸阿托品與天仙子胺的量比值為1∶1 時(shí)，斑點(diǎn)即開(kāi)始轉(zhuǎn)變?yōu)轱@灰藍(lán)色，故將F 值設(shè)定為0.5/（0.5+1）＞0.33 時(shí)，即可檢出硫酸阿托品。

2.1.7 樣品測(cè)定 對(duì)收集的36 批消炎鎮(zhèn)痛膏按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，通過(guò)測(cè)定結(jié)果可知，共有7 家企業(yè)14 批樣品中檢出阿托品。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行確證。

2.2 消炎鎮(zhèn)痛膏中阿托品檢查高效液相色譜法確證

2.2.1 色譜條件 手性色譜柱：以苯基氨基甲酸酯化β-環(huán)糊精鍵合硅膠為填充劑（色譜柱型號(hào)為Chiral CD-Ph，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀3.4 g 加1 L 水溶解，加三乙胺5 mL，用H3PO4調(diào)pH 值至4.0）-乙腈（95∶5）；進(jìn)樣量：10～20 μL；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液各1 mL，分別置5 mL 量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取“2.1.3”項(xiàng)下的陰性對(duì)照溶液，作為陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 方法專(zhuān)屬性 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果供試品溶液呈現(xiàn)與硫酸天仙子胺對(duì)照品色譜保留時(shí)間一致的色譜峰，未呈現(xiàn)與硫酸阿托品對(duì)照品色譜保留時(shí)間一致的色譜峰；且陰性對(duì)照溶液中未檢出硫酸天仙子胺、硫酸阿托品色譜峰，表明該試驗(yàn)具有一定專(zhuān)屬性。代表性的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖：A.硫酸天仙子胺；B.硫酸阿托品；C.正常樣品；D.陽(yáng)性樣品；E.缺顛茄流浸膏陰性樣品

2.2.6 檢出限試驗(yàn) 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下制備的硫酸阿托品溶液0.5 mL（1.022 mg/mL）和陰性樣品溶液0.5 mL，置同一25 mL 量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)瑩u勻，即得檢出限溶液（20.44 μg/mL）。再精密吸取上述溶液4 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，（+）莨菪堿信噪比為3.8、（-）莨菪堿信噪比為4.2，即檢出限（μg/100 cm2）=（對(duì)照品濃度×對(duì)照品進(jìn)樣體積×稀釋倍數(shù)）×100/（取樣量×供試品進(jìn)樣體積）=（20.44×4×0.5）×100/（700×20）=0.29（對(duì)照品進(jìn)樣量：4 μL；供試品進(jìn)樣量：20 μL；稀釋倍數(shù)：0.5；取樣量：700 cm2）。

2.2.7 樣品測(cè)定 對(duì)收集的36 批消炎鎮(zhèn)痛膏按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，通過(guò)測(cè)定結(jié)果可知，共有7 家企業(yè)14 批樣品F 值＞0.33，均檢出阿托品，表明該14 批試樣品中添加了阿托品。其中O 企業(yè)2 批樣品F 值接近1.0，提示該企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中未投顛茄流浸膏，用阿托品替代顛茄流浸膏投料。結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

3.1 手性色譜柱考察

本試驗(yàn)分別考察了色譜柱A：反相CAPCELL PAK C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；色譜柱B：手性YMC CHIRAL ART Cellulose-C 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及色譜柱C：手性Chiral CD-Ph 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。結(jié)果：在色譜柱A 中硫酸天仙子胺與硫酸阿托品對(duì)照品在同一時(shí)間出峰，無(wú)法區(qū)分兩者；色譜柱B 基本可以使硫酸阿托品中（+）莨菪堿與（-）莨菪堿達(dá)到分離，但是信號(hào)響應(yīng)低、基線(xiàn)噪音大，測(cè)定時(shí)硫酸阿托品的濃度大于1 mg/mL。而在測(cè)定消炎鎮(zhèn)痛膏試樣時(shí)，由于基質(zhì)的干擾，試樣中濃度低且基線(xiàn)噪音大，（+）莨菪堿信噪比為3.8、（-）莨菪堿色譜峰無(wú)法確認(rèn)；色譜柱C 能夠有效檢測(cè)消炎鎮(zhèn)痛膏的（-）莨菪堿的峰面積。

3.2 流動(dòng)相考察

本試驗(yàn)分別考察了流動(dòng)相①正己烷-乙醇-二乙醇胺（90∶10∶0.1）；②乙腈-0.1%磷酸溶液（30 ∶70）及③乙腈-磷酸鹽緩沖液（5∶95）。結(jié)果，流動(dòng)相①和②的色譜分離度變差，或者峰形變差，影響檢測(cè)效果，最后試驗(yàn)選擇流動(dòng)相③。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)采用手性色譜柱對(duì)阿托品中右旋（+）莨菪堿和左旋（-）莨菪堿進(jìn)行手性拆分，即當(dāng)檢出阿托品2 個(gè)色譜峰，且F 值＞0.33 時(shí)，則判定為添加阿托品；反之，則判定為未添加阿托品。該方法能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)顛茄流浸膏、消炎鎮(zhèn)痛膏以及含顛茄流浸膏制劑是否存在非法添加阿托品的情況，也可為其他含顛茄流浸膏的制劑是否存在非法添加阿托品研究提供參考依據(jù)。