桃紅四物湯誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞動(dòng)員促進(jìn)骨折修復(fù)的機(jī)制

曾 朋，陸小龍，徐無(wú)忌，向黎黎，李汪洋*，熊 輝*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

中醫(yī)骨傷科治療骨折以“三期辨證”理論為指導(dǎo)。骨折早期，骨斷筋傷，血溢脈外，治療予以活血化瘀。 既往研究從改善局部血液循環(huán)、改變血液流變及增加成骨細(xì)胞的活性等方面研究活血化瘀法促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制[1]。 隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)活血化瘀法能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC）“歸巢”[2]。 MSC“歸巢”是指MSC 離開(kāi)原有的微環(huán)境（主要是骨髓）進(jìn)入外周血循環(huán)，從外周血管遷移至組織損傷處的過(guò)程[3-4]?；钛龇ù龠M(jìn)MSC“歸巢”，包括其促進(jìn)MSC 動(dòng)員和遷移，如加味丹參飲促進(jìn)心肌損傷再灌注損傷大鼠MSC 動(dòng)員[5]；川芎提取物川芎嗪促進(jìn)MSC 向缺血腦組織遷移[6]。 “三期辨證”理論對(duì)應(yīng)中醫(yī)骨傷“瘀去、新生、骨合”，其相關(guān)因子在促骨折愈合、骨形成過(guò)程中均與MSC 相關(guān)，其中，在促骨愈合早期，MSC“歸巢”作為骨形成的先決條件，在此過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[7]。 目前，藥物促進(jìn)骨折愈合有局部注射重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（recombinant human bone mophogenetic protein, rhBMP）、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）[8]、動(dòng)物骨多肽類(lèi)[9]、神經(jīng)生長(zhǎng)因子[10]等方法。 這些藥物主要通過(guò)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor, FGF）信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）信號(hào)通路、血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor, PDGF）信號(hào)通路、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor, IGF）信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、Wnt/β-catenin 信號(hào)通路等發(fā)揮作用。 在骨折早期MSC 定向移動(dòng)時(shí)，各種生長(zhǎng)因子、趨化因子和炎性因子都發(fā)揮重要的作用[11]。采用蛋白芯片檢測(cè)骨折早期主要細(xì)胞因子的表達(dá)水平。在外周血中存在多種細(xì)胞因子，如：VEGF、CX3C趨化因子（fractalkine,FKN）、CXC 趨化因子5（lipopolysaccharide-induced CXC chemokine, LIX）、CC 趨化因子5（normal T cell expressed and presumably secreted,RANTES）、中性粒細(xì)胞趨化因子-1（cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1,CINC-1）、白細(xì)胞介素-1α（interleukin 1α, IL-1α）、細(xì)胞間黏附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1, sICAM-1）、L-選擇素（L-Selectin）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP-1）和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α, MIP-1α），這些因子及相關(guān)信號(hào)通路參與骨折修復(fù)的炎癥期、修復(fù)期、重建期[12]。

桃紅四物湯（Taohong Siwu Decoction, THSWD）是骨折早期活血化瘀法的代表方劑，臨床應(yīng)用甚為廣泛。 已有研究證實(shí)，THSWD 不僅在增加血流變、相關(guān)因子分泌方面可促進(jìn)骨愈合[13]，還能增強(qiáng)在血腫期骨痂中CNIC-1、CNIC-3、LIX、VEGF 等多種因子的表達(dá)，促進(jìn)MSC 的“歸巢”[14]。 本研究將建立右側(cè)股骨干開(kāi)放性骨折大鼠模型，觀察THSWD 在骨折早期對(duì)骨髓內(nèi)MSC動(dòng)員的影響，探究MSC 動(dòng)員與外周血細(xì)胞因子的相關(guān)性，試圖探明THSWD 影響MSC 動(dòng)員的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只5 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（120±10） g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。 動(dòng)物合格證號(hào)：430727221100472812。所有大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009。飼養(yǎng)條件：室溫20～24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，12 h 晝夜交替照明，滅菌飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。 實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：LL20191010001。

1.2 藥物制備

THSWD 的組成和臨床用量參照《醫(yī)宗金鑒·卷四十四》，組方如下：生地黃20 g，當(dāng)歸20 g，赤芍20 g，川芎10 g，桃仁20 g，紅花10 g（批號(hào)分別為：NY2001902、NG19121701、NG19122401、SL19112207、2019070204、HY19121803），購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。 按照上述藥量比例稱(chēng)取生藥材共300 g，水煎2 次濃度定容至2.4 g/mL，分裝，放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要藥物與實(shí)驗(yàn)試劑

SD 大鼠骨髓MSC 完全培養(yǎng)基、SD 大鼠骨髓MSC成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、SD 大鼠脂肪MSC 成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)分別為：RASMX-90011、RASMX-90021、RASMD-90031）；CD29 抗體（FITC）及其IgG1 kappa 同型對(duì)照、CD45抗體（PE）及其IgG1 kappa 同型對(duì)照、紅細(xì)胞裂解液（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，批號(hào)分別為：12-0291-80、11 -0291 -80、12 -0461 -80、12 -4714 -81、00 -4300-54）；CD90 抗體（Alexa Fluor 647）及其IgG1 kappa 同型對(duì)照（北京Biolegend 生物科技有限公司，批號(hào)分別為：202508、400130）；細(xì)胞因子蛋白芯片（美國(guó)R&D Systems 公司，批號(hào)：Ab78608）；戊巴比妥鈉注射液（北京寰宇化工有限公司，批號(hào)：096956-001）；PBS 緩沖液（美國(guó)西格瑪奧德里奇公司，批號(hào)：P4417）。

1.4 主要儀器

細(xì)胞流式儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，型號(hào)：MoFloAstrios EQ）；光學(xué)顯微鏡（中國(guó)摩迪克顯微鏡公司，型號(hào)：BA410T）；超凈工作臺(tái)（北京亞泰隆公司，型號(hào)：YT-CJ-2NB）；離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：ST16R/ST16）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司，型號(hào)：H1650R）；直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司，型號(hào)：DH-160I）；倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司，型號(hào)：DSZ2000X）；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（英國(guó)Syngene 公司，型號(hào)：GBOX-H12-E-M）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及藥物干預(yù)

將24 只SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、骨折組和藥物組，每組8 只。前期研究中，在采用包含陽(yáng)性對(duì)照組的試驗(yàn)中證明THSWD 早期干預(yù)下可以促進(jìn)骨折愈合[15]。 因此，本研究為T(mén)HSWD 的作用機(jī)制研究，未設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組。 除正常組大鼠外，其余兩組大鼠采用右側(cè)股骨干開(kāi)放性骨折方法造模。 術(shù)前6 h 禁食，去除腿毛，予以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，進(jìn)行動(dòng)物造模[16]。 右側(cè)大腿縱行切開(kāi)長(zhǎng)約2 cm 外側(cè)切口，沿肌肉間隙將前后肌肉群鈍性分離，暴露股骨干后；將肌肉輕輕牽開(kāi)，使用迷你型電磨機(jī)沿骨干中部橫斷；克氏針從斷端逆行插入近端，穿出大轉(zhuǎn)子；斷端對(duì)位良好后，固定，將克氏針從近端向遠(yuǎn)端推進(jìn)至股骨髁，剪掉大轉(zhuǎn)子處多余的克氏針，折彎埋入皮下。消毒縫合皮膚。術(shù)后將骨折大鼠放置恒溫墊觀察30 min，待所有大鼠復(fù)蘇后，予青霉素鈉80 000 U 腹腔注射。 術(shù)后第1 天，拍攝X線(xiàn)見(jiàn)骨折內(nèi)固定在位，斷端對(duì)位對(duì)線(xiàn)良好，判定造模成功[15]。術(shù)后第1 天開(kāi)始灌胃，每天8:00 和17:00 各灌胃1次。 藥物組予20 g/（kg·d）THSWD，正常組與骨折組予等量蒸餾水，早晚各1 次，連續(xù)灌胃5 d。 大鼠的給藥劑量按人與動(dòng)物體表面積公式折算[17]，將成人臨床等效劑量1.2 g（生藥材）定為本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的中劑量，前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)高倍率稀釋后[18]，采用藥物干預(yù)劑量為20 g/（kg·d）。

2.2 外周血和骨髓來(lái)源MSC 的分離培養(yǎng)

在藥物組中，使用抗凝真空負(fù)壓采血管進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，采血量約2 mL/只，每份血液樣本與PBS按照1∶1 比例稀釋后，經(jīng)過(guò)紅細(xì)胞裂解液2 次裂解后，離心獲得外周血單核細(xì)胞，經(jīng)PBS 洗滌1次后以完全培養(yǎng)基重懸。 從骨折組大鼠左側(cè)未予骨折的股骨干和脛骨取材，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖出骨髓，離心后得到細(xì)胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸。將外周血來(lái)源的單核細(xì)胞與骨髓來(lái)源的細(xì)胞沉淀置于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，每隔3 d 更換液1 次，至90%融合時(shí)傳代消化，收集第5 代細(xì)胞用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.3 外周血中的項(xiàng)目檢測(cè)

2.3.1 外周血CD45-CD90+CD29+MSC 數(shù)目檢測(cè) 采用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠后，使用抗凝真空負(fù)壓采血管進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血2 mL/只，進(jìn)行細(xì)胞分離、流式前處理、細(xì)胞上樣：分別吸取大鼠外周血500 μL 加入3 mL 紅細(xì)胞裂解液，4 ℃下裂解10 min；400×g 5 min 離心得到沉淀；加入3 mL 紅細(xì)胞裂解液，4 ℃下裂解10 min；400×g 5 min 離心得到沉淀；采用PBS 重懸收集細(xì)胞沉淀，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)，用PBS洗滌細(xì)胞1 次，并收集細(xì)胞；加入500 μL 的Binding Buffer 緩沖液懸浮細(xì)胞；加入CD29、CD45、CD90 抗體避光孵育30 min；PBS 洗滌2 次；進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3.2 外周血和骨髓來(lái)源的MSC 表型鑒定 通過(guò)細(xì)胞流式分析第5 代外周血和骨髓來(lái)源的MSC 的免疫表型。選擇CD90 和CD29 作為陽(yáng)性標(biāo)記，CD45作為陰性標(biāo)記。 具體如下：收集生長(zhǎng)良好的P5 代細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL 的密度重懸于PBS 中洗滌細(xì)胞1次；加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；加入CD29、CD45、CD90 抗體于溶液中避光孵育30 min，每組以純化的同型熒光標(biāo)記的小鼠IgG抗體作為對(duì)照；PBS 洗滌2 次后于流式固定液中固定30 min；每次采集不低于1×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3.3 外周血和骨髓來(lái)源的MSC 成骨分化和成脂分化誘導(dǎo) 取生長(zhǎng)良好的MSC，以3×104接種于6孔板中，24 h 后棄掉培養(yǎng)基，加入2 mL 成骨誘導(dǎo)液，每3 d 換液1 次，誘導(dǎo)21 d。取出標(biāo)本進(jìn)行茜素紅染色和油紅O 染色[19]，PBS 沖洗3 遍，每次5 min；每孔加入2 mL 4%多聚甲醛，固定30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；每孔加入1 mL 稀釋茜素紅染色液或1 mL油紅O 染色工作液，30 min 后，PBS 沖洗3次，每次5 min；顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)或脂滴情況。

2.3.4 外周血血清獲取及蛋白芯片檢測(cè) 腹主動(dòng)脈取血時(shí)，更換真空負(fù)壓采血管，每只大鼠取血4 mL/管。 分離血清條件：37 ℃水浴15 min，常溫下3 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），獲得的血清進(jìn)行蛋白芯片檢測(cè)，具體操作步驟依照說(shuō)明，檢測(cè)外周血血清中細(xì)胞因子的表達(dá)情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以“±s”表示，使用單因素的方差分析，組間差異采用Tukey's 多重比較。 以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 THSWD 可促進(jìn)CD45-CD90+CD29+MSC 的動(dòng)員

MSC 不表達(dá)CD45 抗原，表達(dá)CD90 和CD29 表面抗原。 FCM 三色標(biāo)記法檢測(cè)3 個(gè)免疫表型可間接反映MSC 數(shù)量變化。從外周血單核細(xì)胞中分離得到CD45-CD90+CD29+MSC 的單核細(xì)胞即為MSC。 與正常組比較，骨折組大鼠外周血MSC 絕對(duì)細(xì)胞數(shù)目、相對(duì)細(xì)胞數(shù)目增高（P＜0.05），藥物組外周血MSC 絕對(duì)細(xì)胞數(shù)目、相對(duì)細(xì)胞數(shù)目顯著增高（P＜0.01）；與骨折組比較，藥物組大鼠外周血MSC 絕對(duì)細(xì)胞數(shù)目、相對(duì)細(xì)胞數(shù)目增高（P＜0.05）。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 骨折大鼠CD45-CD90+CD29+MSC 在不同組別的動(dòng)員

3.2 THSWD 干預(yù)外周血來(lái)源CD45-CD90+CD29+MSC 的表型、形態(tài)和多向分化潛能的鑒定

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)：THSWD 干預(yù)大鼠骨髓來(lái)源的細(xì)胞中CD45-、CD90+、CD29+比例和CD45-中CD90+CD29+細(xì)胞比例分別為90.94%、98.57%、92.27%和94.15%；而THSWD 干預(yù)的外周血來(lái)源的細(xì)胞CD45-、CD90+、CD29+比例和CD45-中CD90+CD29+分別為90.59%、98.21%、92.03%和93.52%，詳見(jiàn)圖2A。 通過(guò)鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，外周血MSC 較骨髓MSC生長(zhǎng)周期明顯延長(zhǎng)，細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少；細(xì)胞形態(tài)基本無(wú)明顯區(qū)別；經(jīng)過(guò)成骨成脂誘導(dǎo)后，茜素紅和油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，外周血MSC 和骨髓MSC都能向成骨、成脂肪方向分化，詳見(jiàn)圖2B。

圖2 MSC 不同來(lái)源的細(xì)胞表型、細(xì)胞形態(tài)、多向分化潛能的鑒定

3.3 蛋白芯片檢測(cè)外周血細(xì)胞因子的表達(dá)

與正常組比較，骨折組外周血CINC-1 和MIP-1α蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖3。與骨折組比較，藥物組外周血CINC-1、FKN、L-Selectin、VEGF蛋白表達(dá)增高（P＜0.05），IL-1α 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。 詳見(jiàn)圖4。

圖3 蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)骨折后外周血細(xì)胞因子的表達(dá)

圖4 蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)THSWD 干預(yù)后外周血細(xì)胞因子的表達(dá)

4 討論

動(dòng)員是指MSC 受到外在刺激后其遷移出原有的微環(huán)境（主要是骨髓）進(jìn)入外周血的過(guò)程[20]。 在穩(wěn)定狀態(tài)下很難從外周循環(huán)血中培養(yǎng)MSC，之前MSC 能否動(dòng)員出現(xiàn)在外周血未經(jīng)證實(shí)[21]。 本研究表明，骨折損傷刺激能促進(jìn)骨髓內(nèi)MSC 的動(dòng)員。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，MSC 能在各種刺激下被激活而動(dòng)員進(jìn)入外周血循環(huán)[22-23]，但中醫(yī)藥在干預(yù)骨折后MSC 動(dòng)員及其分子機(jī)制尚未明確。

骨折初期，血管破壞，血腫形成，骨折處形成缺血缺氧的環(huán)境，巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)到局部，釋放各種炎性因子，誘發(fā)炎性反應(yīng)。 骨髓內(nèi)或外周血MSC 受炎性信號(hào)激活后，啟動(dòng)骨髓動(dòng)員并向骨折部位遷移[24]。 在骨折修復(fù)期，遷移的MSC 分化大量成纖維細(xì)胞出現(xiàn)在有機(jī)化血腫、骨折斷端及周?chē)M織，繼而凋亡、演變成骨祖細(xì)胞，骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞方向分化，與侵入的毛細(xì)血管相互作用形成骨痂[25-26]。 骨折重建期，骨痂的吸收和重塑在一定程度上依賴(lài)于破骨細(xì)胞的骨吸收功能，骨基質(zhì)釋放活性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β），誘導(dǎo)MSC 遷移和動(dòng)員到局部修復(fù)部位[27]。同時(shí)在低氧誘導(dǎo)因子-1α/VEGF 通路下，持續(xù)重建的新生血管提供血氧、營(yíng)養(yǎng)，破骨與成骨細(xì)胞循環(huán)耦合，骨髓腔、骨皮質(zhì)先后形成，骨折得以修復(fù)[28]。 綜上，MSC“歸巢”中的MSC 動(dòng)員、遷移與骨折修復(fù)具有緊密的內(nèi)在聯(lián)系。

MSC 表面不表達(dá)CD45 抗原，但表達(dá)CD90、CD29抗原。 本次研究，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上述抗原的表達(dá)以確定外周血MSC 的數(shù)目。 結(jié)果提示，骨折組中大鼠的外周血CD45-CD90+CD29+單核細(xì)胞明顯多于正常組；在THSWD 早期干預(yù)后，骨折組大鼠外周血CD45-CD90+CD29+單核細(xì)胞進(jìn)一步增加。 這表明THSWD 可明顯促進(jìn)MSC 動(dòng)員。 同時(shí)本研究為確定外周血中的MSC 是否來(lái)自于骨髓，對(duì)THSWD干預(yù)的外周血來(lái)源的MSC 與骨折大鼠骨髓來(lái)源的MSC進(jìn)行鑒定。 結(jié)果顯示，二者表面標(biāo)記均符合MSC“表達(dá)CD90、CD29 抗原，不表達(dá)CD45 抗原”的差異性；均為長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)；且都能向成骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞分化。 因此，本課題組推斷，THSWD 早期干預(yù)骨折大鼠后，能促進(jìn)骨髓內(nèi)MSC 動(dòng)員進(jìn)入外周血。

骨折愈合過(guò)程中大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子釋放入血，募集細(xì)胞和促進(jìn)其他細(xì)胞因子的分泌而啟動(dòng)骨折的修復(fù)過(guò)程[29]。 本研究通過(guò)蛋白芯片檢測(cè)，骨折后5 d 外周血中表達(dá)CINC-1、FKN、sICAM-1、IL-1α、LIX、L-Selectin、RANTES、TIMP-1、VEGF 和MIP-1α 等細(xì)胞因子。

CINC-1 和MIP-1α 濃度在骨折后變化顯著，與正常大鼠比較，骨折大鼠中外周血CINC-1 和MIP-1α增高。 CINC-1 能與CXC 趨化因子受體2 結(jié)合并促進(jìn)中性粒細(xì)胞動(dòng)員[30]；而MIP-1α 能與CC 趨化因子受體1 結(jié)合促進(jìn)巨噬細(xì)胞定向移動(dòng)[31]。 隨著中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞進(jìn)入外周血，當(dāng)骨髓內(nèi)靜息狀態(tài)的MSC 感知上述免疫信號(hào)后即被激活進(jìn)入外周血，參與骨折的修復(fù)[32]。

前期研究表明，THSWD 能促進(jìn)骨折大鼠股骨干骨折骨體積和骨礦化密度的增加[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，THSWD 可能通過(guò)促進(jìn)骨髓內(nèi)MSC 動(dòng)員加快骨折愈合。 蛋白芯片結(jié)果提示，THSWD 能增加骨折大鼠外周血中L-Selectin、FKN、CINC-1 和VEGF 表達(dá)，并能抑制IL-1α 表達(dá)。 FKN 是內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的具有黏附和趨化雙重活性的細(xì)胞因子。 有研究報(bào)道，F(xiàn)KN能促進(jìn)骨髓MSC 向缺血損傷的腦組織歸巢[34]。 L-Selectin 作為細(xì)胞黏附分子，主要參與白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附。 研究表明，MSC 不表達(dá)L-Selectin 的配體[35]，所以其能否促進(jìn)MSC 動(dòng)員需繼續(xù)研究。 VEGF 能促進(jìn)MSC 的生長(zhǎng)和鋪展、細(xì)胞膜褶皺的形成及黏著斑和應(yīng)力纖維的組裝[36]。研究表明，MSC 能抑制外周血中巨噬細(xì)胞等分泌炎性因子，具有自身免疫調(diào)節(jié)和抑制炎癥的作用[37]。 另外，外周血IL-1α 表達(dá)的降低，可能是由于MSC 動(dòng)員后的結(jié)果，但I(xiàn)L-1α 的降低是否能促進(jìn)MSC 的動(dòng)員還尚待證實(shí)。

綜上所述，THSWD 作為活血化瘀的代表方在干預(yù)骨折早期的大鼠能明顯促進(jìn)骨髓內(nèi)MSC 的動(dòng)員，外周血FKN、CINC-1、VEGF、L-Selectin 的上調(diào)、IL-1α 下調(diào)可能與其動(dòng)員分子機(jī)制相關(guān)，尚待研究。