醋粉產(chǎn)品微生物抑制效果研究

孟子恒 魏敬遠(yuǎn) 宋蓮軍 齊澤倩 喬明武 黃現(xiàn)青 海丹

苯乳酸、甲酸、乙酸、丙酸等是微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸的主要成分，這些有機(jī)酸可以通過降低微生物生長環(huán)境體系的pH抑制病原菌生長繁殖，并由此發(fā)揮生物防腐作用。在食品行業(yè)，由微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有提高食品口感、增強(qiáng)營養(yǎng)、延長保質(zhì)期等優(yōu)點(diǎn)，因此將食品發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物提取制備后用于食品相關(guān)的生物防腐，能夠有效提高食品的安全性以及消費(fèi)者的消費(fèi)信心。

相比于傳統(tǒng)的食品抑菌劑對(duì)細(xì)菌類微生物的抑制作用，作為食品組成成分的發(fā)酵醋粉對(duì)各類食品中微生物均有不同程度的抑制作用，其營造的酸性環(huán)境不利于細(xì)菌的生存，可以間接達(dá)到殺菌消毒的作用，從而延長保質(zhì)期并增強(qiáng)產(chǎn)品風(fēng)味，可廣泛應(yīng)用于醬鹵肉、香腸、肉餅等熟肉或熟食制品，面包、吐司等烘焙食品，沙拉醬、醬汁、蘸醬等復(fù)合調(diào)味品，濕面制品，腌漬蔬菜制品，以及各種風(fēng)味奶酪的加工等。

本研究采用平板計(jì)數(shù)法，對(duì)比研究了河南偉創(chuàng)生物科技有限公司生產(chǎn)的3種發(fā)酵有機(jī)酸產(chǎn)品對(duì)5種細(xì)菌的抑制效果。本實(shí)驗(yàn)中所采用的發(fā)酵有機(jī)酸是基于標(biāo)簽友好成分的天然產(chǎn)品，通過使用非轉(zhuǎn)基因玉米、大米、食用酒精等一種或幾種為原料，經(jīng)過一定周期的液態(tài)深層兩步發(fā)酵，通過噴霧干燥或者真空冷凍干燥獲得天然固態(tài)調(diào)味料，所制備的物質(zhì)含有有機(jī)酸、多酚、維生素、微量元素、酚酸（原兒茶酸、二氫阿魏酸、二氫芥子酸等）、多肽及類黑精等營養(yǎng)成分，以期為食品工業(yè)中的殺菌工藝和防腐劑復(fù)配提供理論支持。

一、材料與設(shè)備

1.菌株與試劑。（1）供試菌株：?jiǎn)卧隼钏固鼐鶤TCC19115（G+）、曲霉菌、酵母菌、大腸桿菌（G-）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（G+）。（2）供試試劑：5°發(fā)酵醋粉、20°發(fā)酵醋粉、液體發(fā)酵醋（河南偉創(chuàng)生物科技有限公司），霉菌和酵母菌培養(yǎng)液體，PDA培養(yǎng)基（霉菌和酵母菌固體培養(yǎng)基），LB培養(yǎng)基，瓊脂粉，無菌水，鹽酸，氫氧化鈉，生理鹽水（0.85%）。0.1mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：按GB/T 601《化學(xué)試劑 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》，配制與標(biāo)定0.1mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，0.01mol/L或0.05mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（用時(shí)當(dāng)天稀釋）。1%酚酞指示劑溶液：將1g酚酞溶于60mL的95%乙醇（GB/T 679-2002《化學(xué)試劑 乙醇》）中，用水稀釋至100mL。

2.儀器與設(shè)備。DH420恒溫培養(yǎng)箱（上海樹立儀器儀表有限公司）；FXB303-2恒溫培養(yǎng)箱（上海樹立儀器儀表有限公司）；生物安全柜（1379）；pH計(jì)（PHS-3C）；滅菌鍋（KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC KG-SX-500）。

二、試驗(yàn)與方法

1.醋粉pH值的測(cè)定。根據(jù)GB 5009.237-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》中的方法進(jìn)行測(cè)定。

2.含有發(fā)酵醋粉培養(yǎng)基的配制。分別根據(jù)空白對(duì)照組、0.1%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、2.0%、2.5%的抑菌劑（5°醋粉、20°醋粉、液體醋）添加到已滅過菌的固體培養(yǎng)基中，倒平板，備用。

3.指示懸菌液的制備。將用甘油保存的單增李斯特菌按照1%-2%的接種量接種到LB培養(yǎng)基中，在（30±1）℃條件下，以150r/min培養(yǎng)18-24h；將大腸桿菌接種到LB肉湯培養(yǎng)基中，在（37±1）℃條件下，以150r/min培養(yǎng)18h；將嗜熱芽孢桿菌在（55±1）℃條件下，以180r/min培養(yǎng)10h；將用甘油保存的根曲霉菌和酵母菌按照1%-2%的接種量接種到霉菌液體培養(yǎng)基中，分別在（29±1）℃和（33±1）℃的條件下，以150r/min培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，分別各取1mL菌液，用無菌生理鹽水按照1：10的比例稀釋到合適的濃度（稀釋108）待用。

4.涂布法檢測(cè)抑菌劑對(duì)微生物的抑制。根據(jù)國標(biāo)GB 4789.2-2016涂布法檢測(cè)抑菌液對(duì)微生物的抑制情況，稀釋涂布平板法的優(yōu)點(diǎn)是便于計(jì)數(shù)和觀察菌落特征。

三、結(jié)果與分析

1.不同醋粉產(chǎn)品pH值的測(cè)定結(jié)果。不同醋粉產(chǎn)品pH值的測(cè)定結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，3種產(chǎn)品在100mL無菌水條件下的pH值相同（p＜0.05），添加0.05mL抑菌劑后，20°醋粉和液體醋的pH下降明顯；隨著抑菌劑體積的不斷增加，20°醋粉和液體醋的pH分別持續(xù)下降至5.04和5.05。5°醋粉的pH值變化不明顯，從不添加抑菌劑時(shí)的5.88下降到2.5mL抑菌劑下的5.66。三個(gè)呈酸性的固體培養(yǎng)基均不影響后續(xù)抑菌結(jié)果。

2.不同醋粉產(chǎn)品抑菌率的測(cè)定。不同醋粉產(chǎn)品抑菌率的測(cè)定結(jié)果如圖1所示。從圖1-A可以看出，5°醋粉在0.6%濃度下對(duì)大腸桿菌的抑菌率為83%，對(duì)嗜熱芽孢桿菌的抑菌率為95%；在2.0%濃度下對(duì)酵母菌和霉菌可以達(dá)到100%抑菌；針對(duì)單增李斯特氏菌，在0.9%濃度下抑菌率為93%，在1.2%濃度下實(shí)現(xiàn)100%抑菌。從圖1-B可以看出，20°醋粉在0.6%濃度下可以對(duì)大腸桿菌和嗜熱芽孢桿菌實(shí)現(xiàn)100%抑菌；在1.5%濃度下對(duì)酵母菌的抑菌率達(dá)到100%；在2.0%濃度下對(duì)霉菌的抑菌率達(dá)到100%；針對(duì)單增李斯特氏菌，在0.9%濃度下實(shí)現(xiàn)100%抑菌。從圖1-C可以看出，液體醋在0.9%濃度下實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌100%抑菌；在0.9%濃度下實(shí)現(xiàn)100%抑菌；在2.5%濃度下對(duì)霉菌的抑菌率為55.8%，對(duì)酵母菌的抑菌率為56.7%；針對(duì)單增李斯特氏菌，在1.5%濃度下實(shí)現(xiàn)完全抑菌。

綜上，在pH=7.0的中性介質(zhì)環(huán)境下，添加0.6%及以上的5°醋粉對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌率可達(dá)100%，添加1.5%及以上對(duì)曲霉菌的抑菌率可達(dá)100%，添加2.0%及以上對(duì)酵母菌的抑菌率可達(dá)100%；添加0.3%及以上的20°醋粉對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌率可達(dá)100%，添加1.5%及以上對(duì)曲霉菌的抑菌率可達(dá)100%，添加2.0%及以上對(duì)酵母菌的抑菌率可達(dá)100%；添加0.6%及以上的液體醋產(chǎn)品對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌率可達(dá)90%-100%，添加2.5%及以上對(duì)曲霉菌和酵母菌的抑菌率分別為55.8%和56.7%。

四、討論與結(jié)論

微生物污染是影響食品安全的重要因素，應(yīng)用防腐劑雖可延長食品的保質(zhì)期，但是化學(xué)合成食品防腐劑因其成分及使用量問題，無法打消消費(fèi)者對(duì)其安全存在的疑慮，因此發(fā)展天然食品防腐保鮮技術(shù)成為必然趨勢(shì)。有機(jī)酸在食品中作為防腐劑和保鮮劑已有數(shù)百年的應(yīng)用歷史，具有調(diào)節(jié)食品風(fēng)味、抑制病源菌增生、延長食品貨架期等多種作用。

本實(shí)驗(yàn)通過使用3種發(fā)酵有機(jī)酸，對(duì)食品中常見的3種細(xì)菌、霉菌和酵母菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，這3種發(fā)酵有機(jī)酸均可抑制單增李斯特菌ATCC19115（G+）、大腸桿菌（G-）和嗜熱脂肪芽孢桿菌（G+）的生長，其中20°醋粉對(duì)幾種菌的抑菌效果最好；5°醋粉和20°醋粉在一定濃度下對(duì)曲霉菌、酵母菌可以達(dá)到100%的滅菌效果；液體醋雖不能達(dá)到100%的抑菌效果，但是可以有效抑制霉菌和酵母菌的生存繁殖。值得注意的是，三種產(chǎn)品都需要在較高的濃度范圍才能較好地抑制酵母菌和霉菌的生長，而且隨著pH值的變化，抑菌能力也不同。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以生活中常見的發(fā)酵醋粉作為原料，制作3種不同的產(chǎn)品，并明確3種不同產(chǎn)品對(duì)5種微生物的抑制效果，有助于后續(xù)研發(fā)出更為高效的天然產(chǎn)品抑菌劑。不過，目前對(duì)于有機(jī)酸作用機(jī)理的研究還停留在初級(jí)階段，后期仍需要對(duì)具體的抑菌作用分子等靶標(biāo)及其機(jī)制進(jìn)行深入研究。

基金項(xiàng)目：2022年河南省研究生聯(lián)合培養(yǎng)基地項(xiàng)目（YJS2022JD16）；河南省研究生教育改革與質(zhì)量提升工程項(xiàng)目（研究生課程思政示范課項(xiàng)目，YJS2023SZ14）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（23B550001）；河南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科教育教學(xué)改革研究與實(shí)踐項(xiàng)目：基于“SRPED”四循環(huán)可持續(xù)實(shí)踐教學(xué)模式的創(chuàng)新與探究。

作者簡(jiǎn)介：孟子恒（2000-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇踩刂啤?/p>

*通信作者：海丹（1987-），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全、食品微生物安全控制。