芫花素與水溶性磷酸鹽柱[6]芳烴包合物的制備、表征及分子模擬研究

陶 欣，楊云漢，楊明坤，張郡童，陳 艷，楊 舉，楊玉香，釧永明，楊麗娟

云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院 云南省高校智能超分子化學(xué)重點實驗室 生物基材料綠色制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程中心，云南 昆明 650500

芫花素又稱為5,4′-二羥基-7-甲氧基黃酮，是一種從瑞香科瑞香屬植物芫花，唇形科植物刺糙蘇、迷迭香和月桂葉、黑榿木、沉香樹等眾多植物中分離出來的典型的非糖基化類黃酮類化合物[1-3]，具有較高的生物活性和低毒性等特點[4]。芫花素具有抗菌[5]、抗炎[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8-9]、抗瘧原蟲[10]、自由基清除[11]、免疫調(diào)節(jié)[4]和抗神經(jīng)退行性疾病[12]等多種生物藥理學(xué)作用，近年來被廣泛應(yīng)用于臨床上新型藥物制劑的研究。但因其性狀不穩(wěn)定，易吸水潮解霉變，需在低溫條件下密封干燥保存，溶解性較差[13]。因此亟需找到一種高效低毒的藥物載體以改善芫花素在藥物制劑研發(fā)中受到的限制。

大環(huán)化學(xué)發(fā)展了冠醚[14]、環(huán)糊精[15]、杯芳烴[16]、葫蘆脲[17]和柱芳烴[18]等5 類經(jīng)典的大環(huán)主體化合物，推動了超分子化學(xué)的快速發(fā)展。其中柱芳烴作為第5 代大環(huán)分子，具有獨特的剛性富電子空腔、易于修飾、主客體親和力強和優(yōu)異的生物兼容性等特點，使其成為構(gòu)筑功能有機超分子體系的有利載體[19]。與其他幾類經(jīng)典的大環(huán)主體化合物相比，柱芳烴因具有優(yōu)異的生物兼容性和水溶性[20]，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥[21]、功能材料[22]、高效催化劑[23]和環(huán)境污染物治理[24]等領(lǐng)域，且成為繼環(huán)糊精之后一種新型且高效低毒的天然藥物載體，能有效改善藥物分子的理化性質(zhì)[25]。

本研究選用水溶性磷酸鹽柱[6]芳烴（phosphate salt pillar[6]arene，PP6A）作為藥物載體，芫花素為客體分子，采用飽和水溶液法制備芫花素和PP6A的超分子包合物（GK/PP6A），通過紫外-可見吸收光譜法（UV-Vis）、半經(jīng)驗分子軌道法、分子對接、核磁共振波譜（1H-NMR、2D-NMR）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）、X 射線粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRD）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）等分析方法對芫花素包合前后的理化性質(zhì)進行研究分析，并推測了主客體可能的包合模式。進一步以包合物的包合率為指標(biāo)，對GK/PP6A 包合物的制備工藝進行了優(yōu)化篩選。

1 儀器與試劑

Nova Nanosem-450 型掃描電子顯微鏡，美國FEI 公司；Bruker D8 Advance A25X 型X 射線粉末衍射儀、Bruker Avance 400 型核磁共振儀，瑞士Bruker 公司；UV-2600i 型紫外分光光度計，日本島津儀器有限公司；Nicolet IS10 型傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；STA 449F3型差示掃描量熱儀，德國Netzsch 公司；S22-2 型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；N-1100DWD 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，云南科儀化玻有限公司；SHZ-（D）III 型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；FA1004 型電子分析天平，上海天平儀器廠；DZF 型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

三苯基膦（質(zhì)量分數(shù)99.0%，批號P1475928）、三甲基溴硅烷（質(zhì)量分數(shù)98.0%，批號P1348856）、亞磷酸三乙酯（質(zhì)量分數(shù)98.0%，批號P1656460）購于阿拉丁試劑有限公司；四溴化碳（質(zhì)量分數(shù)97.0%，批號P1412529）、1,4-二(2-羥基乙氧基)（質(zhì)量分數(shù)95.0%，批號F1220202）、多聚甲醛（質(zhì)量分數(shù)96.0%，批號P1322770）、KBr（質(zhì)量分數(shù)99.99%，批號20200401）購于泰坦科技有限公司；三氟化硼乙醚（質(zhì)量分數(shù)46.5%，批號9LWDR4VQ）購于安耐吉化學(xué)有限公司；氨水（體積分數(shù)25.0%，批號2022041326）購于天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；芫花素（質(zhì)量分數(shù)98.0%，批號HR1168W9）購于陜西辰光生物科技有限公司；氯仿（體積分數(shù)99.0%，批號20220301）、丙酮（體積分數(shù)99.5%，批號20220301）購于重慶川東化工有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 PP6A 的合成及其溶解度研究

2.1.1 PP6A 的合成 參照文獻方法[26]合成PP6A，合成路線如圖1 所示，產(chǎn)率98.20%。譜圖數(shù)據(jù)與文獻報道一致，1H-NMR (400 MHz，D2O)δ: 6.95 (12H,s), 4.09 (24H, s), 3.84 (12H, s), 2.13 (24H, s)；13C-NMR(100 MHz, D2O)δ: 150.1, 128.8, 116.8, 65.4, 29.3,28.3。

圖1 PP6A 的合成路線圖Fig.1 Synthesis route of PP6A

2.1.2 PP6A 的溶解度研究 用超純水配制系列質(zhì)量濃度梯度的PP6A 溶液，并在最大吸收波長（λ＝340 nm）處測定其紫外吸收光譜，以PP6A 吸光度（A）對其質(zhì)量濃度（C）作圖，得線性回歸方程A＝18.511 43C－0.000 641，r＝0.999 5，結(jié)果表明PP6A在5.991 3～60.137 9 mg/L 線性關(guān)系良好。

通過飽和溶液法探究了不同溫度下PP6A 的溶解度，分別在25、30、40、50 ℃的溫度下制備PP6A的飽和水溶液，并通過PP6A 的紫外吸收標(biāo)準曲線計算出PP6A 在不同溫度下的溶解度，如表1 所示。由實驗結(jié)果可知，隨著溫度的升高，PP6A 的溶解度逐漸增大。

表1 PP6A 在不同溫度下的溶解度Table 1 Solubility of PP6A at different temperatures

2.2 GK/PP6A 包合物的制備處方工藝篩選與優(yōu)化

2.2.1 GK/PP6A 包合物的制備 以PP6A 作為芫花素的藥物載體即主體分子，芫花素為客體分子，采用飽和水溶液法制備GK/PP6A 包合物。按照不同物質(zhì)的量比（PP6A∶芫花素）準確稱取定量的PP6A與芫花素；用不同比例的無水甲醇與水作為溶劑，將芫花素溶解于甲醇中超聲30 min 使其充分溶解，同時將PP6A 放入圓底燒瓶中加入適量的超純水將其溶解，并于不同溫度下攪拌使其充分溶解，然后將提前準備好的芫花素溶液緩慢加入攪拌一段時間，反應(yīng)結(jié)束后，處理濾液得GK/PP6A 包合物。

2.2.2 芫花素線性關(guān)系考察 使用UV-2600i型紫外分光光度計進行紫外-可見光譜測試，研究芫花素的標(biāo)準曲線時，采用DMSO 與水的混合溶劑（1∶1），并在最大吸收波長（λ＝340 nm）處測定紫外吸收光譜。配制質(zhì)量濃度為10 mmol/L 的芫花素溶液，然后依次取2、4、6、8、10、12、14、16、18 μL 的芫花素溶液，分別稀釋到3 000 μL 的溶液（DMSO-水1∶1）中，并在最大吸收波長處（λ＝340 nm）測定紫外吸收光譜，以A值對質(zhì)量濃度（C）作圖，得線性回歸方程為A＝16.572 62C－0.001 35，r＝0.999 6，結(jié)果表明芫花素在1.904 5～17.169 3 mg/L線性關(guān)系良好。

2.2.3 單因素實驗考察GK/PP6A 包合物的制備處方工藝

（1）PP6A 與芫花素物質(zhì)的量比：固定包合溫度為30 ℃，包合時間為8 h，甲醇與水的體積比為1∶8，分別在PP6A 與芫花素的物質(zhì)的量比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 的條件下制備包合物，通過包合率考察不同物質(zhì)的量比對包合工藝的影響。結(jié)果包合率分別為30.13%、46.37%、44.26%、37.62%，結(jié)果表明，當(dāng)PP6A 與芫花素的物質(zhì)的量比為1∶2 時，包合率最大，故選擇PP6A 與芫花素物質(zhì)的量比的研究范圍為1∶1～1∶3。

（2）包合溫度：固定PP6A 與芫花素的物質(zhì)的量比為1∶2，包合時間為8 h，甲醇與水的體積比為1∶8，分別在包合溫度為20、30、40、50 ℃的條件下進行包合物的制備，通過包合率考察不同物質(zhì)的量比對包合工藝的影響。結(jié)果包合率分別為38.17%、45.63%、45.11%、41.98%，結(jié)果表明，當(dāng)包合溫度為30 ℃時，包合率最大，故選擇包合溫度的研究范圍為30～50 ℃。

（3）包合時間：固定PP6A 與芫花素的物質(zhì)的量比為1∶2，包合溫度為30 ℃，甲醇與水的體積比為1∶8，分別在包合時間為6、8、10、12 h 的條件下制備包合物，通過包合率考察不同物質(zhì)的量比對包合工藝的影響。結(jié)果包合率分別為32.07%、46.48%、45.01%、43.21%，結(jié)果表明，當(dāng)包合時間為8 h 時，包合率最大，故選擇包合時間的研究范圍為6～10 h。

（4）甲醇與水的體積比：固定PP6A 與芫花素的物質(zhì)的量為1∶2，包合溫度為30 ℃，包合時間為8 h，分別在甲醇與水的體積比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 的條件下制備包合物，通過包合率考察不同物質(zhì)的量比對包合工藝的影響。結(jié)果包封率分別為29.76%、37.35%、48.59%、43.78%，結(jié)果表明，當(dāng)包合溶劑體積比為1∶8 時，包合率最大，故選擇甲醇與水體積比的研究范圍為1∶6～1∶10。

2.2.4 正交試驗優(yōu)化GK/PP6A 包合物的制備處方工藝 通過單因素試驗得出的各試驗因素水平，以包合率[27]為評價指標(biāo)設(shè)計正交試驗，以PP6A 與芫花素的物質(zhì)的量比（A）、包合溫度（B）、包合時間（C）和甲醇與水的體積比（D）為因素，每個因素3個水平，選用L9(34) 設(shè)計正交試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。通過正交試驗直觀分析結(jié)果表明，4 種因素對包合率的影響順序為D＞A＞C＞B，即甲醇與水的體積比＞PP6A 與芫花素的物質(zhì)的量比＞包合時間＞包合溫度。由測試結(jié)果可知，最優(yōu)制備工藝為A1B3C2D3，當(dāng)PP6A 與芫花素的物質(zhì)的量比為1∶1，包合溫度為50 ℃，包合時間8 h，甲醇與超純水體積比為1∶8 時包合率最高，為89.93%。

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of L9(34) orthogonal test

從表3 可知，因素A 和D 在不同水平間存在差異（P＜0.05），為GK/PP6A 包合物的制備工藝中較為重要的影響因素，B 和C 因素在不同水平間不存在顯著性差異，為次要影響因素。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2.5 GK/PP6A 包合物的制備處方工藝確定 采用“2.2.3”項中的優(yōu)化方法制備GK/PP6A 包合物，準確稱取PP6A（14.2 mg，M＝2 243.980 g/mol，6.30 μmol），芫花素（1.8 mg，M＝284.268 g/mol，6.30 μmol），將芫花素溶解于1.5 mL 的甲醇中超聲30 min 充分溶解，同時將PP6A 放入25 mL 圓底燒瓶中，加入12 mL 的超純水使其充分溶解，然后將提前準備好的芫花素溶液緩慢加入燒瓶中，50 ℃攪拌8 h。反應(yīng)結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，并向圓底燒瓶中加入適量超純水超聲溶解，用0.45 μm 的醋酸纖維濾頭濾除濾液中未進入柱芳烴空腔的，沉淀于溶液中的芫花素,再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，真空干燥，得GK/PP6A 包合物。

2.3 GK/PP6A 包合物的表征

2.3.1 FT-IR 分析 通過Nicolet IS10 傅里葉變換紅外光譜儀測試芫花素、PP6A 和GK/PP6A 的紅外光譜信息。采用壓片法將樣品與溴化鉀（樣品-KBr 1∶100）研磨制成薄片測定紅外吸收光譜。PP6A、芫花素和GK/PP6A 包合物的FT-IR 如圖2 所示，從主體分子PP6A 的紅外吸收光譜圖中可以看出1 217、1 144 cm?1處為PP6A 分子上P＝O 的伸縮振動吸收峰，797、702、546 cm?1處為PP6A 苯環(huán)上C-H 的彎曲振動吸收峰。芫花素的紅外吸收光譜顯示了其在3 269 cm?1處具有羥基-OH 的伸縮振動峰，2 935 cm?1處為芫花素21號原子處的-CH3的伸縮振動峰，1 669 cm?1處為羰基的伸縮振動，1 499 cm?1處為苯環(huán)上的C＝C 骨架伸縮振動，1 119 cm?1處為C-OC 的彎曲振動。當(dāng)芫花素與PP6A 形成包合物后，芫花素在3 269 cm?1處的-OH 伸縮振動峰消失，2 935、1 669、1 499、1 119 cm?1處的紅外吸收特征峰均明顯減弱，而1 217、1 144、797 cm?1處的PP6A的特征峰的吸收強度基本不變，據(jù)包合前后主客體特征峰波數(shù)與吸收強度的變化，可推斷出成功制備了GK/PP6A 包合物。

圖2 PP6A、芫花素、GK/PP6A 包合物的FT-IR 吸收光譜圖Fig.2 FT-IR absorption spectra of PP6A, genkwanin, and GK/PP6A inclusion complex

2.3.2 XRD 分析 使用X 粉末射線衍射儀對樣品進行XRD 測試，測試條件為Cu Kα（λ＝0.154 06 nm），2θ掃描區(qū)間從10°～90°，管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描速率10°/min。PP6A、芫花素和GK/PP6A 包合物的XRD 如圖3 所示，PP6A 在2θ值為13.13°和15.16°處有2 個弱的衍射峰，在19.24°～21.31°有1 個弱的寬衍射峰，呈現(xiàn)出明顯的無定形結(jié)構(gòu)。芫花素呈現(xiàn)出良好的晶型結(jié)構(gòu)，在2θ值為10.79°、14.16°和18.66°處有較強且尖銳的衍射峰，且在12.21°、16.25°、21.33°、24.55°、26.90°、28.75°和44.19°處也均有明顯尖銳的衍射峰，當(dāng)芫花素與PP6A 形成包合物后，顯示出了不同于主體或客體的衍射模式，包合后PP6A 與芫花素的特征衍射峰基本消失，此外，GK/PP6A 包合物在21.95°和31.23°處出現(xiàn)了較強且尖銳的衍射峰。實驗結(jié)果表明，主客體包合前后其晶型結(jié)構(gòu)、衍射峰位置和強度均有變化，說明包合物成功制備。

圖3 PP6A、芫花素、GK/PP6A 包合物的XRD 圖Fig.3 XRD patterns of absorption spectra of PP6A,genkwanin and GK/PP6A inclusion complex

2.3.3 SEM 分析 采用NOVA NANOSEM-450 型掃描電子顯微鏡對樣品的表面形態(tài)進行掃描，將樣品均勻的分散在金屬樣品臺上，并在真空中噴金處理。在30 kV 的激發(fā)電壓下拍攝得到SEM 圖像。SEM 是物質(zhì)表面結(jié)構(gòu)定性分析最常用的方法之一，PP6A、芫花素和GK/PP6A 的SEM 圖如圖4 所示，由SEM 測試結(jié)果可知，PP6A 的表面形態(tài)平整光滑且均勻分布著細碎的小斑點，形狀為規(guī)則的片狀；芫花素的表面形態(tài)呈現(xiàn)為細長的針狀，形似一簇堆疊的松針；GK/PP6A 的表面形態(tài)呈現(xiàn)出表面略粗糙且?guī)в袟l狀紋理的塊狀結(jié)構(gòu)，包合前表面細碎的小斑點基本消失，呈現(xiàn)出與前兩者不同的表面形態(tài)。包合前后表面形貌的變化，初步揭示了GK/PP6A 包合物的形成。

圖4 PP6A、芫花素、GK/PP6A 包合物的SEM 圖像 (SEM 圖經(jīng)Photoshop 染色)Fig.4 SEM images of PP6A, genkwanin and GK/PP6A inclusion complex (SEM image stained by Photoshop)

2.3.4 DSC 分析 采用Netzsch STA 449F3 型差示掃描量熱儀，設(shè)置升溫速率為10 ℃/min，溫度范圍35～150 ℃，氬氣體積流量為240 mL/min，對PP6A、芫花素和GK/PP6A 包合物進行差示掃描量熱測定，得到DSC 曲線。如圖5 所示，PP6A 在76.76 ℃和212.09 ℃分別有1 個吸熱峰，在560.89 ℃有1 個放熱峰。芫花素在285.10 ℃和408.29 ℃分別有1個吸熱峰，在600.92 ℃有1 個放熱峰。當(dāng)芫花素與PP6A 形成包合物以后，芫花素與PP6A 的特征峰均有減弱或消失，且在464.27 ℃和484.67 ℃出現(xiàn)了新的放熱峰，515.21 ℃出現(xiàn)了新的吸熱峰。DSC 曲線分析結(jié)果表明，芫花素與PP6A 已形成包合物。

圖5 PP6A、芫花素、GK/PP6A 包合物的DSC 圖Fig.5 DSC curves of PP6A, genkwanin and GK/PP6A inclusion complex

2.4 NMR 分析

采用BrukerAvance DRX 400 MHz 核磁共振波譜儀測試了芫花素、PP6A 和GK/PP6A 的1H-NMR、13C-NMR 和2D NMR 譜圖。其中，芫花素采用DMSO-d6作為溶劑，PP6A 和GK/PP6A 均以D2O作為溶劑，氘代溶劑均以四甲基硅烷（TMS）作為內(nèi)標(biāo)。

2.4.11H-NMR 分析 核磁共振波譜是研究主客包合物的有效方法[28]。芫花素與PP6A 進行主客體絡(luò)合時，化學(xué)位移會隨著主客體的相互屏蔽作用發(fā)生變化，因此可通過主體在包合前后質(zhì)子的化學(xué)位移變化來推斷客體分子是否順利進入主體空腔中。PP6A和GK/PP6A的1H-NMR如圖6所示，GK/PP6A包合物的1H-NMR 同時包含了主客體分子的特征質(zhì)子峰，且包合前后PP6A 的特征質(zhì)子峰H1、H2、H3、H4的質(zhì)子信號分別均向低場移動了δ0.05、0.05、0.04、0.11，結(jié)果如表4 所示，核磁共振波譜測試結(jié)果表明成功制備了包合物。

表4 PP6A 包合前后的化學(xué)位移值 (ΔδH) 對照Table 4 Comparison of chemical shift (ΔδH) values before and after PP6A inclusion

圖6 PP6A 與GK/PP6A 的1H-NMR 譜圖Fig.6 1H-NMR spectra of PP6A and GK/PP6A

2.4.2 2D-NMR 分析 主客體絡(luò)合時空間鄰近的2個質(zhì)子產(chǎn)生的核奧弗豪澤效應(yīng)（nuclear Overhauser effect，NOE）能有效證明主客體之間是否發(fā)生絡(luò)合，采用二維核磁共振波譜對樣品進行分析，結(jié)果如圖7 所示，測試結(jié)果表明PP6A 的H-1 與芫花素的H-2、H-9 存在NOE 相關(guān)，PP6A 的H-2 與芫花素的H2 存在NOE 相關(guān)，說明芫花素成功進入PP6A 的空腔內(nèi)形成包合物。

圖7 GK/PP6A 包合物的2D NOESY 譜 (A) 及其可能的包合模式和關(guān)鍵的NOE 相關(guān) (B)Fig.7 Two-dimensional nuclear Overhauser effect spectroscopy (2D-NOESY) spectrum (A) and proposed inclusion modes associated with key nuclear Overhauser effects (NOEs) (B) of GK/PP6A inclusion complex

2.5 光譜測定

2.5.1 Job 曲線測定 采用等物質(zhì)的量連續(xù)變化法測定GK/PP6A 的包合計量比[29]，維持體系總濃度為10.0 μmol/L，保持芫花素與PP6A 的物質(zhì)的量比為0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，并配制系列濃度梯度的混合溶液測定紫外吸收光譜，以芫花素的摩爾分數(shù)為橫坐標(biāo)，A值之差與芫花素的摩爾分數(shù)乘積為縱坐標(biāo)，繪制得Job 曲線。如圖8-a 所示，當(dāng)芫花素的摩爾分數(shù)為0.5 時，溶液的A值之差與芫花素的摩爾分數(shù)乘積達到最大。由此可以得出GK/PP6A 的包合物質(zhì)的量比為1∶1。

圖8 PP6A 與芫花素的Job 曲線 (a) 和PP6A 與芫花素的熒光滴定曲線 (b)Fig.8 Job curve between PP6A and genkwanin (a) and ultraviolet titration curves of PP6A and genkwanin (b)

2.5.2 紫外-可見光譜滴定實驗分析 通過紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）法探究了芫花素與PP6A 間的主客體絡(luò)合行為，如圖8-b 所示，保持芫花素的濃度為10.0 μmol/L，按照等濃度梯度依次加入0～20.0 μmol/L 的PP6A 溶液，測定紫外吸收光譜。由測試結(jié)果可知，隨著PP6A 溶液的加入混合溶液的A值逐漸增強，說明芫花素與PP6A 之間存在著較強的主客相互作用。根據(jù)滴定過程中A值的變化，采用Benesi Hildebrand 曲線法[30]求解得芫花素與PP6A 的絡(luò)合常數(shù)為49 488 L/mol。

2.6 芫花素與PP6A 的主客體包合模擬計算分析

采用Gaussian 03 程序[31]完成量化計算，PP6A的初始結(jié)構(gòu)由Gaussian View 對全甲氧基柱[6]芳烴（取自劍橋晶體數(shù)據(jù)庫）進一步修飾得到，并用PM6-D3H4 方法對PP6A 的初始結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化至結(jié)構(gòu)達到幾何平衡，同時采用Gaussian View 構(gòu)建芫花素的初始結(jié)構(gòu)至結(jié)構(gòu)達到幾何平衡。

采用MOPAC2016 軟件包進行半經(jīng)驗計算，選用坐標(biāo)放置法構(gòu)建芫花素與PP6A 的包合過程：以芫花素分子上13 號位置的氧原子作為定位點m，以PP6A 上連接的亞甲基上的碳所構(gòu)成圓的幾何中心作為坐標(biāo)原點O，并將m 與O 之間的距離定義為Dm-o，使芫花素分子從距離坐標(biāo)原點的10 nm 移動到?10 nm，每步移動1 nm，且均用PM6-D3H4 方法對包合物結(jié)構(gòu)進行全優(yōu)化。

采用AutoDock 4.2 程序[32]對芫花素與PP6A 的包合模式進行深入探究并完成分子對接。將芫花素和PP6A 分別作為配體分子和剛性受體分子進行分子對接模擬，設(shè)置最大評估數(shù)為2.5×106，執(zhí)行100次構(gòu)像搜索，將芫花素對接到PP6A 的空腔中，并將構(gòu)像搜索過程中均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）小于0.2 nm 的構(gòu)像歸為一簇，進行聚類分析。芫花素以每步1 nm 的步長靠近并深入PP6A 的空腔中，整個過程的結(jié)合能變化曲線如圖9 所示，由計算結(jié)果可知，隨著Dm-o減小，當(dāng)芫花素移動到3 nm 時，結(jié)合能為?105.184 4 kJ/mol，此時結(jié)合能力達到最強，此位置對應(yīng)的GK/PP6A 絡(luò)合體系的結(jié)合模式如圖10-A 所示。

圖9 芫花素與PP6A 的結(jié)合能變化曲線圖Fig.9 Diagram of binding energy variation between genkwanin and PP6A

圖10 經(jīng)PM6-D3H4 優(yōu)化后的最優(yōu)GK/PP6A 包合物模式(A) 和GK/PP6A 包合物分子對接最優(yōu)構(gòu)像 (B)Fig.10 Complexation patterns of optimal GK/PP6A inclusion complex after PM6-D3H4 optimization (A) and optimal molecular docking conformation of GK/PP6A inclusion complex (B)

當(dāng)芫花素移動到3 nm 時，客體芫花素置于PP6A 的空腔中，二者空間匹配度良好緊密結(jié)合，與二維核磁共振氫譜推斷的主客體可能的包合模式相互吻合。隨著芫花素繼續(xù)移動至4～?6 nm 間時，由于PP6A 支鏈和芫花素分子的扭轉(zhuǎn)，芫花素分子未能較好的置于PP6A 的空腔中，自?7 nm 后，隨著芫花素繼續(xù)移動且即將脫離PP6A 的空腔時，因為空間斥力的減弱，結(jié)合能力呈現(xiàn)出逐漸減弱的趨勢。值得注意的是，采用AutoDock 4.2 程序?qū)净ㄋ嘏cPP6A 的包合模式進行深入探究并完成分子對接后，得到GK/PP6A 包合物分子的對接最優(yōu)構(gòu)像如圖10-B 所示，并發(fā)現(xiàn)芫花素分子7 號位上的羥基暴露于PP6A 的空腔外，并與PP6A 中苯環(huán)對位的醚氧原子形成了1 條氫鍵，長度為0.186 6 nm，主客體間緊密結(jié)合并形成氫鍵，進一步增強了主客體間的結(jié)合能力。分子對接完成后，將RMSD 小于0.2 nm 的構(gòu)像歸為一簇，進行聚類分析，芫花素和PP6A 的構(gòu)像聚類分析如表5 所示，分析結(jié)果表明對接結(jié)果收斂度較高，只有五簇形成。

表5 芫花素與PP6A 分子對接后的成簇分析(RSDGK/PP6A＜0.2 nm)Table 5 Clustering analysis diagram of genkwanin and PP6A molecules after docking (RSDGK/PP6A < 0.2 nm)

2.7 包合物的性能研究

2.7.1 包合物的溶解度測定實驗 通過飽和溶液的方法測定芫花素和GK/PP6A 包合物在水中的溶解度，分別制備芫花素和GK/PP6A 包合物的飽和水溶液，并通過芫花素的紫外吸收標(biāo)準曲線分別計算出芫花素包合前后的溶解度。實驗結(jié)果表明，芫花素包合前的溶解度為3.5 μg/mL，包合后的溶解度為540.5 μg/mL，約提高了155 倍，由此可知PP6A 能有效的改善芫花素的溶解度。

2.7.2 包合物的穩(wěn)定性實驗 胃和腸道是人體吸收口服藥物的主要場所，因此模擬生物體環(huán)境對芫花素和GK/PP6A 的穩(wěn)定性進行探究[33]。設(shè)置2 組實驗，每組各取2 個25 mL 量瓶，分別向瓶中依次加入0.01 mmol/L 的芫花素溶液和4 mmol/L 的PP6A溶液，用pH 1.5（模擬人體胃液）和pH 7.6（模擬人體腸液）的緩沖溶液與甲醇的混合液（4∶1）分別稀釋至刻度，37 ℃恒溫孵育1 h，于最大吸收波長處測定其A值，然后避光保存，每隔12 h 測定其A值，連續(xù)測定72 h，每組實驗平行測定3 次。芫花素和GK/PP6A 的穩(wěn)定性如圖11 所示，在模擬人體的胃液環(huán)境中，芫花素在0～36 h 的相對A值呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，至36 h 下降了85.45%，在模擬人體的腸液環(huán)境中，芫花素在0～24 h 的相對吸光度（A/A0，A為每12 h 內(nèi)所測吸光度，A0為初始吸光度）呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，至24 h 下降了96.51%，而GK/PP6A 包合物的相對A值在模擬的胃液與腸液的環(huán)境中均表現(xiàn)為下降趨勢平緩。實驗結(jié)果表明芫花素在形成包合物后穩(wěn)定性顯著提高。

圖11 芫花素和GK/PP6A 包合物在pH 1.5 和pH 7.6 的條件下的A/A0 隨時間變化圖Fig.11 Plot of relative absorbance A/A0 of genkwanin and GK/PP6A inclusion complex with time at pH 1.5 and pH 7.6

3 討論

選取PP6A 作為藥物載體，芫花素為客體分子，構(gòu)筑了一種新型的GK/PP6A 超分子包合物。以包合物的包合率為指標(biāo)設(shè)計正交試驗，得GK/PP6A 包合物的最優(yōu)制備工藝為PP6A 與芫花素的物質(zhì)的量比為1∶1，包合溫度為50 ℃，包合時間8 h，甲醇與超純水體積比為1∶8，包合率為89.93%。并探究了4 個因素在不同水平間的顯著性差異，包合時間在不同水平間存在顯著性差異，是包合物的制備工藝的重要影響因素。

采用核磁共振波譜、FT-IR、XRD、SEM 和DSC等分析測試方法對包合物進行了表征，主客體在包合前后其理化性質(zhì)發(fā)生了明顯變化。通過半經(jīng)驗分子軌道法和分子對接揭示了芫花素與PP6A 最穩(wěn)定的包合模式，疏水作用和氫鍵作用為包合物形成的主要驅(qū)動力。進一步通過紫外可見吸收光譜探究了芫花素和PP6A 的物質(zhì)的量比及絡(luò)合常數(shù)，試驗結(jié)果表明，芫花素和PP6A 以物質(zhì)的量比1∶1 形成超分子包合物，其絡(luò)合常數(shù)為49 488 L/mol，芫花素與PP6A 之間存在著較強的主客相互作用。包合物的性能研究實驗結(jié)果表明，芫花素與PP6A 形成超分子包合物后，水溶解性和穩(wěn)定性顯著提高，其中水溶解性由3.5 μg/mL 提升至540.5 μg/mL，約提高了155 倍，PP6A 是芫花素的優(yōu)良藥物載體。

綜上所述，該研究為天然藥物分子芫花素在臨床上藥物制劑的研究和制備奠定了一定的基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突