茯神指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別和多指標(biāo)成分定量研究

王 娜，程 璐 ，王 浩 ，彭華勝, ，張亞中 ，劉軍玲 *，金傳山*

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012

2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051

3.國家藥監(jiān)局中藥質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230051

4.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材品質(zhì)保障與資源持續(xù)利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700

茯神PoriacumPiniRadix為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 菌核中間天然抱有松根的白色部分，始載于《名醫(yī)別錄》[1]，甘、淡，平，入心、脾經(jīng)，具有寧心、安神、利水功效。茯神在臨床上仍是常用的大宗品種，《中國藥典》1963 年版[2]曾收錄“茯神”，然而，后來歷版藥典均未再收錄[3]。全國多個(gè)省已制定中藥材地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但大多是基原、性狀、功效上的描述，內(nèi)容較少且不全面[4]。此外，通過查閱文獻(xiàn)資料，發(fā)現(xiàn)茯神相關(guān)文獻(xiàn)資料也較少?；诖耍狙芯坎捎酶咝б合嗌V法[5-8]建立茯神的指紋圖譜[9-10]，結(jié)合相似度評(píng)價(jià)同時(shí)進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別[11-17]，并測定其中10 個(gè)三萜成分的含量。從定性和定量2 個(gè)方面為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定基礎(chǔ)，保證茯神的臨床療效與用藥安全。

1 儀器與材料

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀及所配備的二極管陣列檢測器（Dionex 公司）；ML 型204 萬分之一電子天平（Mettler 公司）；XP26 型百萬分之一電子分析天平（Mettler 公司）；A11 型分析研磨機(jī)（IKA公司）；KQ-100 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；XMTD205 水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；Simplicity-185 型超純水儀（Millipore 公司）；HALO 90 A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）

對(duì)照品16α-羥基松苓新酸（批號(hào)J12HB184946，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、茯苓酸B（批號(hào)J13HB172712，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95% ）、去氫土莫酸（ 批號(hào)A19GB158345，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、茯苓酸A（批號(hào)J28HB186446，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96%）、多孔菌酸C（批號(hào)P08J11L107514，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、3-表去氫土莫酸（批號(hào)A26IB212331，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、3-O-乙酰基-16α-羥基松苓新酸（批號(hào)P08J11S107846，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、去氫茯苓酸（批號(hào)A19IB212921，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、松苓新酸（批號(hào)P24J10S80630，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、去氫齒孔酸（批號(hào)A18IB212947，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）均購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

37 批茯神（S1～S17 批來自安徽，S18～S27批來自云南，S28～S37 批來自湖北），經(jīng)安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院劉軍玲主任中藥師鑒定為多孔菌科真菌茯苓P.cocos(Schw.) Wolf 菌核中間抱有松根的白色部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用HALO 90A，C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-0.05%磷酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～9 min，62% A；9～28 min，62%～78% A；28～32 min，78%～90% A；32～38 min，90% A；38～40 min，90%～62% A），檢測波長242 nm，柱溫30 ℃，體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度依次為0.038 3、0.049 0、0.048 5、0.033 7、0.047 0、0.043 0、0.038 4、0.054 7、0.089 6、0.040 9 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜? mL 量瓶中，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 取甲醇，作為陰性對(duì)照品溶液。

2.3 HPLC 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（S2）和陰性對(duì)照溶液（甲醇溶液）分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，在色譜圖中各待測成分峰分離度良好，溶劑對(duì)色譜峰無影響，見圖1。

圖1 茯神供試品 (A)、混合對(duì)照品 (B) 和陰性對(duì)照品 (C)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of Poria cum Pini Radix test substance (A), mixed control substance (B), and negative control substance (C)

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取茯神樣品（S2），按照“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD 均＜1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取茯神樣品（S2），按照“2.2.2”項(xiàng)方法平行制備6 份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD 均＜1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取茯神樣品（S2），按照“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件于制備后的0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD 均＜2.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 指紋圖譜的建立 將所得的37 批茯神指紋圖譜依次導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012 版）”。以樣品S1 作為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1，采用中位數(shù)法，利用多點(diǎn)校正法進(jìn)行峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，37 批茯神色譜圖與對(duì)照?qǐng)D譜的疊加圖譜見圖2。

圖2 37 批茯神HPLC 疊加圖譜 (S1～S37)及對(duì)照?qǐng)D譜(R)Fig.2 HPLC overlay spectra (S1?S37) and control spectra(R) of 37 batches of Poria cum Pini Radix

2.4.2 指紋圖譜的分析 37 批茯神指紋圖譜標(biāo)定10 個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出1 號(hào)峰為16α-羥基松苓新酸、2 號(hào)峰為茯苓酸B、3 號(hào)峰為去氫土莫酸、4 號(hào)峰為茯苓酸A、5 號(hào)峰為多孔菌酸C、6號(hào)峰為3-表去氫土莫酸、7號(hào)峰為3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、8 號(hào)峰為去氫茯苓酸、9 號(hào)峰為松苓新酸、10 號(hào)峰為去氫齒孔酸。計(jì)算37 批不同產(chǎn)地茯神之間的相似度，見表1，結(jié)果顯示，除S23、S37 外，其余35 批茯神樣品的相似度在0.791～1.000，S23、S37 可能由個(gè)體差異導(dǎo)致，其余樣品相似度較高。

表1 37 批茯神相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 1 Similarity evaluation results of 37 batches of Poria cum Pini Radix

2.5 多指標(biāo)成分定量

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱定16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸的對(duì)照品適量，以甲醇配制成6 個(gè)不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示各組分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 茯神中10 種成分的線性回歸結(jié)果Table 2 Linear regression results of 10 components in Poria cum Pini Radix

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸峰面積的RSD分別為0.001 6%、0.001 1%、0.001 9%、0.002 6%、0.003 9%、0.002 0%、0.001 7%、0.001 6%、0.002 4%、0.002 4%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取茯神樣品粉末6 份（S2），按照“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下平行進(jìn)樣分析，結(jié)果16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為0.002 8%、0.001 1%、0.001 4%、0.001 7%、0.013 4%、0.001 4%、0.001 5%、0.001 3%、0.001 1%、0.002 7%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液（S2），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣，計(jì)算出含量，結(jié)果16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為0.002 3%、0.000 8%、0.000 6%、0.001 1%、0.017 2%、0.000 9%、0.001 5%、0.003 0%、0.000 7%、0.001 6%，樣品穩(wěn)定性良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知成分含量的茯神樣品（S2）0.5 g 置錐形瓶中，平行6 份，按1∶1 比例加入各對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算得到16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸的平均加樣回收率分別為 90.27%、109.22%、97.90%、85.57%、107.41%、86.25%、88.45%、108.60%、96.22%、85.22%，RSD 分別為0.033 4%、0.016 1%、0.026 4%、0.024 6%、0.032 7%、0.029 7%、0.026 1%、0.030 3%、0.049 8%、0.036 8%，表明本方法的加樣回收率良好。

2.5.6 樣品含量測定 取37 批茯神藥材粉末各約1.0 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸10個(gè)成分的含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果Table 3 Results of content determination of samples

2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.6.1 聚類分析 以37批茯神中10種化學(xué)成分的含量為變量，以平方歐氏距離為測距，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 23 軟件，采用系統(tǒng)聚類法，對(duì)37批茯神進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)平方歐氏距離為5 時(shí)可分為3 類，S23 聚為一類，S37 聚為一類，其余樣品聚為一類，S23、S37 可能由個(gè)體含量差異導(dǎo)致，其余樣品間質(zhì)量差異不大，與相似度結(jié)果相符。

圖3 37 批茯神樣品的聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of 37 batches of Poria cum Pini Radix samples

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 為進(jìn)一步比較不同批次茯神間的質(zhì)量差異，將37 批茯神10 個(gè)有效成分含量導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 23 和Simca 軟件，進(jìn)行PCA，共有峰特征值見表4。前2 個(gè)主成分的初始特征值依次為6.098、2.248，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到83.460%，表明以上2個(gè)主成分能夠較好的代表指紋圖譜中的大部分信息。PCA 得分圖顯示37 批樣品可大致劃分為3 類，與CA 結(jié)果一致，見圖4。

表4 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Principal component eigenvalues and variance contribution rate

圖4 37 批茯神PCA 得分圖Fig.4 PCA score chart of 37 batches of Poria cum Pini Radix

2.6.3 正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 將37 批茯神有效成分含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Simca 軟件進(jìn)行OPLS-DA，以變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值＞1.0 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖5，表明共有4 個(gè)特征峰的VIP 值＞1.0，分別為峰8 去氫茯苓酸（VIP＝1.775 9）、峰1 為16α-羥基松苓新酸（VIP＝1.333 9）、峰5 為多孔菌酸C（VIP＝1.125 1）、峰6 為3-表去氫土莫酸（VIP＝1.107），表明這4 個(gè)成分是茯神不同批次樣品間質(zhì)量差異貢獻(xiàn)較大的標(biāo)志物，可以用來區(qū)分不同產(chǎn)地、批次間茯神的質(zhì)量差異。OPLS-DA 分析的結(jié)果與CA、PCA 的結(jié)果一致。

圖5 37 批茯神OPLS-DA 模型VIP 值圖Fig.5 VIP value chart of 37 Batch of Poria cum Pini Radix

3 討論

3.1 色譜條件及處理方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)操作過程中選用高效液相色譜法測定茯神三萜類成分，所用提取溶劑有乙醇、甲醇，提取方法有超聲與加熱回流，提取時(shí)間有20、30、40 min，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲30 min 后提取的樣品溶液色譜峰信息較準(zhǔn)確完整、操作簡單且高效節(jié)約，適用于茯神的定性及定量研究。在波長的選擇上，本文根據(jù)10 種待測成分的吸收波長特點(diǎn)，分別考察了在210、242 nm 波長下的檢測效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在210 nm 波長下10 種三萜類成分均無吸收，在242 nm 波長下有最大吸收，故最終選擇242 nm 為測定波長。另外對(duì)流動(dòng)相亦進(jìn)行了考察，有乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸等。結(jié)果表明，以乙腈-0.05%磷酸進(jìn)行梯度洗脫獲得的圖譜峰形良好，基線分布穩(wěn)定，可分別滿足對(duì)10 種三萜類化合物圖譜的分離要求。

3.2 指紋圖譜的建立

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)37 批茯神藥材在相同的提取方法和色譜條件下所得HPLC 圖譜及數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2012 版)分析結(jié)果，確定了茯神中共有15 個(gè)共有色譜峰，比對(duì)對(duì)照品色譜峰指認(rèn)了16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸，且在37 批樣品中均檢出這10 個(gè)成分。此外，部分樣品在26 min 左右檢出1個(gè)未知峰，這可能與茯神木的成分有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。除S23、S37 外，其余35 批茯神樣品的相似度在0.791～1.000，S23、S37 兩批樣品相似度存在較大差異，可能由個(gè)體差異導(dǎo)致，其余樣品相似度較高，表明茯神多批次產(chǎn)地的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，能很好地反應(yīng)樣品的指紋圖譜。

3.3 含量測定及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)通過CA、PCA 及OPLS-DA 分析對(duì)茯神含量進(jìn)行綜合分析。通過CA 發(fā)現(xiàn)，37 批茯神樣品可聚為3 類，S23 聚為一類，S37 聚為一類，其余樣品聚為一類，與相似度結(jié)果相符。對(duì)比表3 含量結(jié)果圖發(fā)現(xiàn)，S23 中大多成分含量較高，而S37中大多成分的含量均較低，表明茯神中某些成分含量的高低可能是這兩批樣品各單獨(dú)聚為一類的原因，產(chǎn)地來源并不是決定聚類結(jié)果的唯一因素；PCA得分圖與CA 結(jié)果一致，利用主成分分析得到2 個(gè)主成分，可代表樣品中的大部分信息；此外，OPLS-DA 篩選出去氫茯苓酸、16α-羥基松苓新酸、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸這4 個(gè)質(zhì)量差異標(biāo)志物，表示這4 個(gè)色譜峰所代表的成分對(duì)區(qū)分不同產(chǎn)地、批次茯神的貢獻(xiàn)較大，可以用來區(qū)分不同批次間茯神的質(zhì)量差異。

4 結(jié)語與展望

茯神是衛(wèi)生部頒布的第一批藥食同源兩用品[18]，僅收載于地方標(biāo)準(zhǔn)，而且標(biāo)準(zhǔn)過于簡單，無法有效控制茯神質(zhì)量，本研究建立的指紋圖譜及含量測定方法重復(fù)性良好，準(zhǔn)確度高，可為茯神的質(zhì)量控制提供新方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不足，可用于茯神的質(zhì)量評(píng)價(jià)。此外，篩選出影響茯神質(zhì)量的4 個(gè)潛在差異標(biāo)志物，可為進(jìn)一步完善該藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

中藥材作為中醫(yī)用藥的源頭，其質(zhì)量控制對(duì)后續(xù)中藥飲片和中成藥的安全性、有效性起到關(guān)鍵性作用，進(jìn)而影響其臨床療效。通過市場調(diào)研，了解到目前市場流通的茯神有部分為后期在茯苓中人為插入松根而成，只為滿足茯神外觀性狀要求，而非真正的抱木而生，不具備茯神的功效；另外，以松根為中心，靠近松根多遠(yuǎn)的范圍，算作真正意義上的茯神，暫無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有待進(jìn)一步研究，以確定其規(guī)格等級(jí)。因此，需進(jìn)一步完善茯神質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，建立科學(xué)、管用的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，服務(wù)于監(jiān)管，同時(shí)解決茯神質(zhì)量摻偽問題。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突