基于蟾蜍分泌腺轉(zhuǎn)錄組對(duì)蟾蜍二烯酸內(nèi)酯合成途徑關(guān)鍵基因的挖掘

張靈迂，王普慶，周羅靜，高繼海，侯飛俠

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

蟾酥是蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufobufo gargarizansCantor 或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider 皮膚腺體的干燥分泌物。蟾蜍皮膚存在2種外分泌腺：一種是黏液腺又稱腺泡腺[1-2]，負(fù)責(zé)產(chǎn)生黏多糖和黏蛋白多糖，黏多糖自發(fā)的分泌能使皮膚保持濕潤(rùn)；另一種是漿液腺又稱為合胞腺[1]，腺中充滿肽類、胍衍生物、生物胺、甾體以及生物堿等內(nèi)含物[3]，其中甾體類物質(zhì)蟾蜍二烯酸內(nèi)酯（bufadienolides，BDs）是蟾蜍抵御天敵的主要毒性物質(zhì)，也是蟾酥主要的藥效成分[4]。BDs 在細(xì)胞中作為一種Na+，K+-ATP 酶抑制劑[5]，可增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，破壞細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，并誘導(dǎo)不同類型的細(xì)胞凋亡，是重要的抗癌藥物[6-7]。目前BDs 的主要獲取途徑是從蟾酥中提取，此方法依靠野生蟾蜍為主要原材料，勢(shì)必會(huì)造成野生蟾蜍的衰退甚至滅絕。微生物轉(zhuǎn)化和化學(xué)合成是替代從野生蟾蜍提取BDs的重要手段，但目前關(guān)于BDs 生物合成途徑的研究較少，導(dǎo)致現(xiàn)階段對(duì)其合成的分子機(jī)制仍不清楚。

目前BDs 合成途徑研究顯示，膽固醇是該類化合物的前體物質(zhì)[8]，涉及的基因家族包括CYP450、UGTs、ATS 等；涉及的關(guān)鍵酶有SRD5β、3β-HSD和CYP11A1 等，研究人員從蟾蜍耳后腺中克隆了3β-羥基類固醇脫氫酶（3βHSD）和類固醇5β-還原酶（5βSRD）[9-10]，并推測(cè)這2 種酶是將BDs 母核A/B 環(huán)轉(zhuǎn)化為順式構(gòu)型的關(guān)鍵酶，其中3βHSD 是類固醇生成組織中孕酮、雌激素和雄激素生物合成的重要步驟，可分別催化孕烯醇酮和脫氫表雄酮轉(zhuǎn)化為孕酮和雄烯二酮；5βSRD 催化孕酮為孕烯醇酮，可以將孕酮還原為5β-二氫孕酮；CYP11A1 在工程酵母試驗(yàn)中被鑒定為切割膽固醇側(cè)鏈的酶[11]。這些結(jié)果推動(dòng)了BDs 類化合物合成途徑的研究進(jìn)展，但到目前為止，人們對(duì)其合成途徑中諸多中間體轉(zhuǎn)化所涉及的基因和酶的了解仍處于初級(jí)階段，還需進(jìn)一步挖掘和研究。

1 材料

中華大蟾蜍樣品捕獲于課題組自養(yǎng)2 年齡材料，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)侯飛俠副教授鑒定為中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor。

2 方法

2.1 樣品采集和前處理

樣品經(jīng)無(wú)菌水洗凈，乙醚麻醉后剪取皮膚，挑取背部疣粒和耳后腺體，置于磷酸緩沖鹽（phosphate buffered saline，PBS）溶液中洗凈，放入盛有OCT 包埋劑的包埋盒中，立即放入液氮速凍后置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

2.2 蟾蜍腺體切片制備和顯微觀察

冷凍組織置Thermo 冷凍切片機(jī)中切片，切片厚度10～15 μm。采用連續(xù)切片法，選取厚薄均勻、完整的切片，用75%～90%梯度酒精洗脫固定后染色。染色方法如下：蘇木素染色2～3 min，蒸餾水洗去浮色，分化液3 min，伊紅染色3 s，蒸餾水洗去浮色，梯度乙醇（90%～75%）洗脫，風(fēng)干，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.3 激光顯微切割捕獲分泌腺

冷凍切片在無(wú)酶水中洗去包埋劑，浸泡在無(wú)水乙醇：冰乙酸（19∶1）溶液中固定2～3 min，使用LeicaDFC7000T 激光捕獲顯微切割儀器進(jìn)行目標(biāo)材料捕獲。實(shí)驗(yàn)前調(diào)試焦距和激光強(qiáng)度等參數(shù)，選擇合適的繪圖工具分別切下耳后腺中漿液腺（CE）、背部疣粒中粘液腺（CN）和漿液腺（CK）3 種分泌腺，每種分泌腺細(xì)胞數(shù)量不少于5 000 個(gè)。使用含細(xì)胞裂解液的無(wú)酶PCR 管收集捕獲的細(xì)胞，瞬時(shí)離心，?80 ℃冷凍后用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2.4 轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)和測(cè)序

采用DNBSEQ Low Input Smart-Seq Eukaryotic mRNA library 方法對(duì)捕獲的分泌腺細(xì)胞進(jìn)行建庫(kù)，利用DNBSEQ 和PE100 方法測(cè)序。通過(guò)SOAPnuke軟件清除原始數(shù)據(jù)里包含接頭，未知堿基（N 含量大于5%）以及低質(zhì)量的reads，獲得Clean reads。

2.5 生物信息學(xué)分析

2.5.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的質(zhì)控、比對(duì)和定量分析 利用FastQC、Fastp 軟件對(duì)Clean reads 進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估及剪切、過(guò)濾接頭和低質(zhì)量序列，得到高質(zhì)量clean data。使用STAR-2.6.1b[17]軟件將轉(zhuǎn)錄本比對(duì)在參考基因組中（ASM1485885v1），計(jì)算每個(gè)樣品的比對(duì)率。用featureCounts（1.6.0）[18]計(jì)算定量獲得表達(dá)矩陣。用R 軟件包DESeq2 根據(jù)原始表達(dá)矩陣構(gòu)建dds 矩陣，計(jì)算差異表達(dá)基因及對(duì)樣品做主成分分析，使用偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）來(lái)校正多次檢測(cè)的P值（FDR≤0.05），并使用表達(dá)水平差異的倍數(shù)的雙對(duì)倍數(shù)（log2FC）來(lái)確定基因表達(dá)的顯著性差異（log2FC≥2）。

2.5.2 差異基因的功能富集分析 注釋序列用蛋白序列（GCF-014858855.1-ASM1485885v1- protein.faa）在eggnog-mapper[eggNOG-mapper (embl.de)]網(wǎng)站中注釋，作為GO 富集的背景基因集，使用clusterProfiler（4.4.4）R 包[19]進(jìn)行GO 富集分析。同時(shí)將蛋白序列上傳到KAAS [KAAS-KEGG Automatic Annotation Server(genome.jp)] 數(shù)據(jù)庫(kù)中，用單向最佳命中率（single-directional best-hit，SBH）方法，以非洲爪蟾Xenopuslaevis、熱帶爪蟾Xenopustropicalis、南非爪蟾Nanoranaparkeri和人Homosapiens作參考物種，預(yù)測(cè)功能并建立KEGG 背景基因集，使用clusterProfiler（4.4.4）R 包進(jìn)行KEGG 富集分析。

太極虎遇到了同樣的厄運(yùn)，長(zhǎng)劍總是在他身上不要命的地方淺淺的，一觸即收。太極虎不再是太極虎，而是一只病貓。他全身上下像篩子一樣冒著鮮血，人也因失血過(guò)多而恍忽，長(zhǎng)劍在求生的直覺(jué)支持下做著毫無(wú)目標(biāo)的胡亂揮動(dòng)。

2.5.3 蟾酥藥效成分合成相關(guān)基因的蛋白互作分析和表達(dá)量分析 根據(jù)差異基因的GO 和KEGG 富集分析結(jié)果，結(jié)合PubMed 文獻(xiàn)庫(kù)檢索挑選出與甾體激素合成、類固醇合成代謝膽汁酸合成等相關(guān)功能和通路的基因，并在STRING[STRING: functional protein association networks (string-db.org)]網(wǎng)站中，以非洲爪蟾為參考背景建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape（3.7.1）[20]繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

選取上述分析后存在互作關(guān)系的基因，關(guān)聯(lián)到樣品表達(dá)量矩陣中，使用微生信網(wǎng)站（https://bioinformatics.com.cn/plot_basic_ballon_plot_0 48）的小工具繪制表達(dá)量氣泡圖。

2.6 熒光定量PCR 驗(yàn)證

選取轉(zhuǎn)錄組中識(shí)別的9 個(gè)參與BDs 合成相關(guān)差異表達(dá)基因，進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-RCR）驗(yàn)證。以測(cè)序?qū)嶒?yàn)同批次樣品的cDNA 為模板，使用GAPDH為內(nèi)參基因，利用CDS 序列和Primer 5 軟件設(shè)計(jì)qRT-RCR 特異性引物。采用SsoFastTMEva Green Su-peremix（Bio-Rad，USA）進(jìn)行定量表達(dá)檢測(cè)，采用2?ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 中華大蟾蜍分泌腺顯微觀察

中華大蟾蜍背部疣粒的分布呈現(xiàn)從脊椎向兩側(cè)外延逐漸減少的趨勢(shì)（圖1-a）。耳后腺顯微切片觀察發(fā)現(xiàn)其中的漿液腺形態(tài)呈橢圓形，幾乎充滿真皮層，腺體呈一字型緊密分布，兩側(cè)的漿液腺形態(tài)較小，中間的較大（圖1-b），其外圍分布大量的分泌細(xì)胞（圖1-c）。背部疣粒切片可觀察到疣粒中央散在分布有2～4 個(gè)較大的圓形漿液腺（圖1-d），表皮下方分布2～6 個(gè)圓形的粘液腺（圖1-e）。

圖1 中華大蟾蜍形態(tài)及分泌腺顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Morphology and secretory gland microstructure of Bufo bufo gargarizans

3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與比對(duì)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)測(cè)得9 個(gè)樣品共計(jì)clean reads 63.01 Gb，平均GC 含量44.45%，平均Q2096.85%，與參考基因組（ASM1485885v1）的平均比對(duì)率為74.87%（表1）。背景基因集注釋了26 064 條GO terms，24 823 KEGG通路，注釋和比對(duì)質(zhì)量較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 中華大蟾蜍分泌腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及比對(duì)數(shù)據(jù)Table 1 Transcriptome sequencing and comparison data of secretory gland of Bufo bufo gargarizans

3.3 差異基因表達(dá)分析及富集結(jié)果

3.3.1 差異基因表達(dá)基因分析 主成分分析顯示各生物學(xué)重復(fù)的樣本聚集，可得知每組樣本之間具有特異性，表明了數(shù)據(jù)的可靠性（圖2-a）。3 種分泌腺中共檢測(cè)到4 550 個(gè)差異基因（DEGs），其中樣品CE較CK 上調(diào)62 個(gè)基因，下調(diào)254 個(gè)基因（圖2-b）；CE 較CN 上調(diào)1 062 個(gè)基因，下調(diào)713 個(gè)基因（圖2-c）；CK 較CN 上調(diào)1 744 個(gè)基因，下調(diào)712 個(gè)基因（圖2-d）；CE 和CK 共有上調(diào)基因880 個(gè)。

圖2 樣品間差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)及主成分分析圖Fig.2 Number statistics and principal component analysis of differentially expressed genes among samples

3.3.2 差異基因富集分析 將差異基因進(jìn)行KEGG和GO 富集分析以深入了解差異基因的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，樣品CK 和CE 共有316 個(gè)DEGs，其中CK 較CE 上調(diào)DEGs 254 個(gè)（P＜0.05，log2FC≥2），GO 富集主要涉及含吡啶化合物的代謝（GO:0072524）、脂肪酸分解代謝（GO:0009062）、羧酸分解代謝（GO:0046395）和過(guò)氧化物酶體（GO:0005777）；KEGG 通路主要富集在甾類激素生物合成（ko00140）、過(guò)氧酶體（ko04146）、原代脂肪酸代謝（ko00120）和花生四烯酸途徑（ko00590）等途徑。CK 較CE 下調(diào)62 個(gè)DEGs（P＜0.05，log2FC≥2），GO 富集功能主要在含吡啶化合物的代謝過(guò)程（GO:0072524）、雌二醇-17β-脫氫酶活性（GO:0004303）、有機(jī)酸分解代謝過(guò)程（GO:0016054）、羧酸分解代謝過(guò)程（GO:0046395）和甲基轉(zhuǎn)移酶活性（GO:0008168）等；在KEGG富集主要涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解（ko00280）、甾類激素生物合成（ko00140）、類固醇生物合成（ko00100）等。

樣品CE 和CN 共存在1 775 個(gè)DEGs，其中CE 較CN 上調(diào)1062 個(gè)DEGs（P＜0.05，log2FC≥2），GO 富集主要涉及類固醇的生物合成（ GO:0006694 ）、類固醇代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)（GO:0019218）、花生四烯酸的分泌（GO:0050482）和泛素樣蛋白連接酶活性（GO:0061659）等；KEGG富集涉及通路有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（ko00260）、脂肪酸降解（ko00071）和乙醛酸和二羧酸代謝（ko00630）等。CE 較CN 下調(diào)713 個(gè)DEGs（P＜0.05，log2FC≥2），GO 功能富集主要涉及粘液層（GO:0070701）、蛋白-O-糖基化（GO:0006493）、細(xì)胞對(duì)凝集素的反應(yīng)（GO:1990858）和先天免疫反應(yīng)激活細(xì)胞表面受體信號(hào)通路（GO:00022200）等；KEGG 富集主要涉及礦物質(zhì)的吸收（ko04978）、甲狀腺激素信號(hào)通路（ko04919）、細(xì)胞粘結(jié)（ko04510）和JAK-STAT 信號(hào)通路和軸突導(dǎo)向（ko04360）等。

樣品CK 與CN 共有2 457 個(gè)DEGs，其中CK較CN 上調(diào)1 744 個(gè)DEGs（（P＜0.05，log2FC≥2），GO 富集主要涉及在有機(jī)酸分解代謝過(guò)程（GO:0016054）、類固醇生物合成的過(guò)程（GO:0006694）、17-00 甾酮還原酶活性（GO:0072555）和c21 甾體激素生物合成過(guò)程（GO:0006700）等；KEGG 富集主要涉及過(guò)氧酶體通路（ko04146）、甾類激素生物合成（ko00140）、P40 細(xì)胞色素對(duì)外源的代謝作用（ko00980）和氨基苯甲酸酯降解（ko00627）等。CK 較CN 下調(diào)712 個(gè)DEGs（P＜0.05，log2FC≥2），GO 功能富集主要有蛋白質(zhì)糖基化（GO:0006486）、刺激C 型凝集素受體信號(hào)通路（GO:0002223）、外源凝集素響應(yīng)答（GO:1990858）和體液免疫應(yīng)答（GO:0006959）等；KEGG 主要富集在ECM-受體交互通路、細(xì)胞粘附（ko04510）和中性粒細(xì)胞外陷阱形成（ko04613）等通路。

3.4 蟾酥藥效成分生物合成基因的篩選

BDs 生物合成途徑很可能是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[20]，目前研究的途徑主要有兩種，一是通過(guò)甲羥戊酸→膽固醇→孕烯醇酮→孕酮→強(qiáng)心甾類[21]，二是膽固醇通過(guò)膽汁酸合成途徑合成蟾毒內(nèi)酯類化合物[4]，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，在樣品CE、CK 上調(diào)差異基因的功能富集結(jié)果中檢索出包括類固醇、睪酮、雌二醇、前列腺素、雄甾酮、花生四烯酸、石膽酸、膽汁酸在內(nèi)的28 種物質(zhì)的代謝、合成及運(yùn)輸?shù)裙δ埽l(fā)現(xiàn)94 個(gè)基因參與調(diào)控，見表2。

表2 蟾酥藥效成分合成相關(guān)功能基因展示Table 2 Display of functional genes related to synthesis of drug constituents of bufonis venenum

3.4.1 相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 為進(jìn)一步探究上述基因之間的關(guān)系（圖3），利用近緣物種非洲爪蟾X.laevis作參考數(shù)據(jù)集，將上述基因在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中計(jì)算，結(jié)果顯示94 個(gè)基因中有34 個(gè)基因存在互作關(guān)系，如圖4 所示，主網(wǎng)絡(luò)富集的KEGG途徑是初級(jí)膽汁酸生物合成（XLA00120）；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降（XLA00280）、丙氨酸代謝（XLA00640）及脂肪酸生物合成（XLA01040）等。其中的HUB 蛋白有：?；?CoA 氧化酶1（acyl-CoA oxidase 1, acox1）、甾醇載體蛋白2（sterol carrier protein 2，scp2）、酰基輔酶A 硫代酯酶8（acyl-CoA thioesterase 8，acot8）及羥基類固醇 17-β 脫氫酶 4 型（hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 4，Hsd17b4.L）等。進(jìn)一步根據(jù)STING 網(wǎng)站計(jì)算的KEGG 途徑，發(fā)現(xiàn)基因AMACR、HSD17B4、SCP2和ACOT8參與調(diào)控初級(jí)膽汁酸合成（圖5），基因LOC122926609參與調(diào)控石膽酸結(jié)合，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)BDs 合成途徑之一是通過(guò)膽汁酸初級(jí)合成過(guò)程，石膽酸可能是該途徑中BDs 類化合物的重要前體。

圖3 蟾酥藥效成分合成相關(guān)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Interaction network diagram of gene proteins related to synthesis of effective component of Bufonis venenum

圖4 BDs 合成相關(guān)基因與表達(dá)量關(guān)聯(lián)分析氣泡圖Fig.4 Bubble map of BDs synthesis-related genes correlated with expression levels

圖5 BDs 生物合成途徑推測(cè)Fig.5 Predicted map of BDs biosynthetic pathway

3.4.2 相關(guān)基因的表達(dá)量分析 為探求“2.4”項(xiàng)中的基因在樣品CE 組、CK 組和CN 組的表達(dá)情況，將上述存在互作關(guān)系的基因和參與石膽酸結(jié)合的基因LOC122926609均關(guān)聯(lián)到表達(dá)量矩陣中。分析結(jié)果顯示，大部分基因在CE 組和CK 組的表達(dá)量大于在CN組；通過(guò)與表達(dá)量數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)及前面的蛋白互作分析，可以側(cè)面驗(yàn)證這些基因可能是BDs 下游合成途徑（膽汁酸合成途徑）的關(guān)鍵基因。據(jù)前文描述，發(fā)現(xiàn)基因AMACR、HSD17B4、SCP2和ACOT8參與調(diào)控初級(jí)膽汁酸合成，將該途徑調(diào)出，并將上述基因表達(dá)氣泡附上，如圖5 所示，推測(cè)該途徑是BDs 下游合成途徑，上述4 個(gè)基因是調(diào)控該途徑的關(guān)鍵基因。

3.5 熒光定量PCR 驗(yàn)證

本研究為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，從34 個(gè)基因中選取9 個(gè)與BDs 合成相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。分析目的基因在9 個(gè)組別中的表達(dá)差異，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性。結(jié)果顯示這9 個(gè)基因的基因表達(dá)量差異與測(cè)序結(jié)果具有一致性，結(jié)果見圖6。

圖6 差異基因qRT-PCR 驗(yàn)證Fig.6 qRT-PCR verification of differential genes

4 討論

4.1 激光捕獲顯微切割技術(shù)在中藥有效成分分子機(jī)制研究中的應(yīng)用

激光捕獲顯微切割在腫瘤細(xì)胞的分離、病理組織的分離及大腦細(xì)胞的分離等方面技術(shù)非常成熟[22-23]，通常與其他技術(shù)如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等聯(lián)合[24-27]，在空間角度分析樣品間的功能及成分分析上提供技術(shù)支撐[28]。但此技術(shù)在中藥中應(yīng)用極少，而中藥材恰恰具有不同部位不同功效的特殊性，LCM 技術(shù)的應(yīng)用可把藥用部位的研究精準(zhǔn)到細(xì)胞類群上，推進(jìn)藥用動(dòng)植物的表觀與其基因間的聯(lián)系。蟾蜍皮膚腺體作為蟾酥分泌合成的重要組織，目前的研究?jī)H停留在組織水平上，造成組織內(nèi)細(xì)胞功能平均化。

有報(bào)道解析了蟾蜍3 個(gè)部位（耳后腺、背部皮膚、腹部皮膚）的基因表達(dá)譜[29]，并闡述了耳后腺及背部皮膚富集了毒素成分相關(guān)的功能和通路。本研究從中華大蟾蜍耳后腺和背部皮膚腺體中分離出漿液腺和粘液腺，發(fā)現(xiàn)漿液腺整體上調(diào)差異基因的富集除基礎(chǔ)的代謝外，主要有甾體激素的合成、膽固醇代謝、膽汁酸合成等；另外，在“2.4”項(xiàng)中發(fā)現(xiàn)存在互作關(guān)系的 34 個(gè)基因除個(gè)別基因LOC122926609、VEGFA等在CE 中表達(dá)量高于CK外，其余大部分基因在CE 和CK 中表達(dá)相當(dāng)，推測(cè)背側(cè)漿液腺和耳后腺漿液腺都具有合成BDs 類成分的潛力。

4.2 BDs 類化合物合成途徑關(guān)鍵基因推測(cè)

BDs 類成分廣泛用于各種癌癥，在肝癌、胰腺癌和乳腺癌等多種癌細(xì)胞治療具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用[30-33]，是癌癥治療的潛在藥物，該化合物是一類甾體強(qiáng)心苷，在C-17 位與六元不飽和內(nèi)酯環(huán)（α-吡喃酮環(huán)）相連[4]。目前對(duì)這類成分的研究，主要還是藥理及化學(xué)合成方向，生物合成的研究較少。但早在1998 年，研究者就對(duì)動(dòng)植物中合成的BDs類成分的情況作出統(tǒng)計(jì)，在植物中，主要由景天科、風(fēng)信子科、鳶尾科、楝樹科、毛茛科及檀香科植物合成；動(dòng)物則主要存在于蟾蜍、螢火蟲、頸槽蛇屬及某些哺乳動(dòng)物中[34]，不過(guò)后續(xù)更加具體的工作進(jìn)展緩慢。近幾年開始興起對(duì)該類化合物的合成途徑關(guān)鍵基因的驗(yàn)證，如驗(yàn)證基因酶SRD5β 和3βHSD在孕烯醇酮-孕酮-二氫孕酮轉(zhuǎn)化等[9-10]。除此之外，對(duì)BDs 合成路線的推測(cè)的研究也有一定的進(jìn)展，一是參考洋地黃苷（五元內(nèi)酯環(huán)）的合成途徑：甲羥戊酸→膽固醇→孕烯醇酮→孕酮→強(qiáng)心甾類，該途徑的特點(diǎn)是膽固醇到孕烯醇酮的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，膽固醇側(cè)鏈斷開，后由丙二酰輔酶A 提供?；纬晌逶獌?nèi)酯環(huán)[21]；二是膽固醇經(jīng)膽汁酸初步合成途徑合成石膽酸，以石膽酸為中間體經(jīng)系列反應(yīng)合成BDs[11]。

在本研究中對(duì)BDs 合成路線的推導(dǎo)，更偏向于初級(jí)膽汁酸途徑。本課題組在CE、CK 樣品上調(diào)的差異基因的富集分析中發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因參與調(diào)控膽汁酸合成，且基因AMACR、HSD17B4、ACOT8及SCP2存在較強(qiáng)的互作關(guān)系，并在CE 和CK 中表達(dá)趨勢(shì)一致，且并未發(fā)現(xiàn)有基因參與調(diào)控孕烯醇酮的轉(zhuǎn)化。除此之外，查閱文獻(xiàn)得知，同時(shí)給蟾蜍和紅海蔥接種孕烯醇酮-20-14C，孕烯醇酮是紅海蔥中BDs 的良好前體，但在蟾蜍中并不能得到此結(jié)果，推測(cè)孕烯醇酮不是蟾蜍體內(nèi)合成BDs 的重要中間體[35]；另外有研究從蟾蜍毒液分離出7-α 羥基膽固醇和7-β 羥基膽固醇[35]，這2 種化合物是膽汁酸生物合成的重要中間體，該結(jié)果表明蟾蜍BDs 類化合物的合成經(jīng)由膽固醇-膽汁酸鹽途徑[36]，由此，推測(cè)BDs 生物合成經(jīng)由膽汁酸初級(jí)合成途徑合成石膽酸，再經(jīng)系列反應(yīng)合成BDS 類成分母核?；駻MACR、HSD17B4、ACOT8和SCP2及LOC122926609該途徑的關(guān)鍵基因，作者已開展對(duì)上述基因功能的驗(yàn)證，以期能探索 BDs 類成分的生物合成路線。

BDs 是一類重要的抗癌化合物，研究其生物合成途徑是開發(fā)相關(guān)臨床藥物的重要基礎(chǔ)，而其合成途徑關(guān)鍵基因的挖掘是推進(jìn)該途徑的重要研究歷程。本研究從微觀的腺體細(xì)胞著手，探究中華大蟾蜍兩種不同功能的外分泌腺差異基因的表達(dá)，通過(guò)生物信息學(xué)等手段推測(cè)出BDs 下游合成途徑的關(guān)鍵基因，旨在探究BDs 生物合成的分子機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突