靈芝總?cè)聘患貌煌吞?hào)大孔吸附樹(shù)脂的篩選

陳婧 羅欣 鐘海燕 劉澤湞 李鵬

（福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 福州 350122）

赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.]為多孔菌科真菌的干燥子實(shí)體，是一種傳統(tǒng)中藥材，使用歷史非常悠久[1]。靈芝含有三萜、多糖、生物堿、黃酮、甾醇、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種類(lèi)型的化學(xué)成分[2]。羊毛甾烷型四環(huán)三萜類(lèi)成分是其主要的生物活性成分之一，具有抗腫瘤、抗炎、保肝、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗輻射、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥等多種藥理作用[3]。大孔吸附樹(shù)脂已廣泛用于富集藥用真菌的有效成分，如核苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、三萜類(lèi)、酚類(lèi)、蛋白質(zhì)和肽類(lèi)[4]。近年來(lái)，大孔吸附樹(shù)脂已有用于靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)分離純化工作。周曉[5]利用AB-8樹(shù)脂對(duì)靈芝三萜粗提液進(jìn)行分離純化。陳慧[6]和王濤[7]選取ADS-8大孔樹(shù)脂用于靈芝三萜的分離純化。但是關(guān)于靈芝總?cè)聘患玫拇罂孜綐?shù)脂的篩選研究報(bào)道較少。針對(duì)文獻(xiàn)中已用于三萜類(lèi)物質(zhì)純化的8種大孔吸附樹(shù)脂（HPD400、HPD500、D101、D4020、LSA-21、DM301、HZ816及HP-20），本研究比較這些樹(shù)脂對(duì)靈芝總?cè)频奈脚c解吸附能力，從中篩選出用于富集靈芝總?cè)频暮线m樹(shù)脂，為后續(xù)利用大孔吸附樹(shù)脂純化靈芝三萜的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑與材料

ZQTY-50振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；Cary 300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（安捷倫科技有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（福州泰美實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；XS105型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，型號(hào)規(guī)格詳見(jiàn)表 1；95%乙醇、乙酸乙酯、甲醇（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）；高氯酸（AR，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；香草醛（AR，上海麥克林生化科技有限公司）；齊墩果酸對(duì)照品（AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；赤芝藥材（福建仙芝樓生物科技有限公司提供，經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系張永紅教授鑒定，藥材標(biāo)本現(xiàn)存于福建醫(yī)科大學(xué)福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

表1 實(shí)驗(yàn)所使用的苯乙烯型大孔吸附樹(shù)脂的一般性能

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝總?cè)颇敢旱闹苽?/p>

準(zhǔn)確稱(chēng)取靈芝粉末500 g于5 000 mL的圓底燒瓶中，加入3 000 mL 95%乙醇，95 ℃回流提取3次，每次2 h。合并3次提取液并過(guò)濾，濾液減壓濃縮，真空干燥，稱(chēng)重，得醇提浸膏（24.47 g）。將醇提浸膏用60%乙醇溶解，并定容至1 000 mL，即得靈芝總?cè)颇敢骸?/p>

1.2.2 靈芝總?cè)坪繙y(cè)定

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考2020版《中國(guó)藥典》靈芝項(xiàng)下三萜含量測(cè)定方法[8]，精密稱(chēng)取干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品5.0 mg于25 mL量瓶中，加甲醇溶解后，定容至刻度，配制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于5 mL具塞試管中，不加塞，水浴揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸0.8 mL，加塞，搖勻，在70 ℃恒溫水浴中加熱15 min后，立即置冰水浴中冷卻5 min，再加入乙酸乙酯使總量為5 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，在546 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，齊墩果酸濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）精密度測(cè)定 取0.02 mL靈芝總?cè)颇敢河? mL具塞試管中，水浴揮干溶劑后，按 “1.2.2項(xiàng)1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法，測(cè)定其吸光度6次。

3）穩(wěn)定性測(cè)定 取0.02 mL靈芝總?cè)颇敢河? mL具塞試管中，水浴揮干溶劑后，按 “1.2.2項(xiàng)1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法，分別在室溫下放置5、10、15、20、25、30、35、40、45 min后測(cè)定其吸光度。

4）重復(fù)性測(cè)定 取0.02 mL靈芝總?cè)颇敢?份，分別置于編有1、2、3、4、5、6號(hào)的5 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑后，按“1.2.2項(xiàng)1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法，測(cè)定其吸光度。

5）回收率測(cè)定 取0.02 mL靈芝總?cè)颇敢?份，分別置于編有1、2、3、4、5、6號(hào)的5 mL具塞試管中，在1、2號(hào)管中加入0.1 mL齊墩果酸對(duì)照品，在3、4號(hào)管中加入0.15 mL齊墩果酸對(duì)照品，在5、6號(hào)管中加入0.2 mL齊墩果酸對(duì)照品，分別搖勻，水浴揮干溶劑后，按“1.2.2項(xiàng)1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法，測(cè)定其吸光度（齊墩果酸對(duì)照品濃度為0.22 mg/mL）。

回收率（%）=（C－A)/B×100%。

式中：A為加入樣品量(mg)，B為加入標(biāo)準(zhǔn)品量(mg)，C為測(cè)得量(mg)。

6）母液中靈芝總?cè)坪繙y(cè)定 精密移取靈芝總?cè)颇敢?.02 mL于5 mL具塞試管中，不加塞，揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸0.8 mL，加塞，搖勻在70 ℃恒溫水浴中加熱15 min后，立即置冰浴中冷卻5 min，再加入乙酸乙酯使總量為5 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，在546 nm處測(cè)定吸光度，將吸光度值（A）代入回歸方程，計(jì)算靈芝總?cè)颇敢褐锌側(cè)频暮?，平行?shí)驗(yàn)3次。

1.2.3 靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

1）大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理 各型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h，待溶脹完全后，濕法裝柱，用95%乙醇洗脫直至溜出液與蒸餾水按體積比1∶4混合后不呈現(xiàn)白色渾濁，然后用大量的蒸餾水洗脫，直至溜出液無(wú)醇味，濕法密封保存待用。

2）靜態(tài)吸附考察 準(zhǔn)確量取預(yù)處理過(guò)的大孔吸附樹(shù)脂HPD400、HPD500、D101、D4020、LSA-21、DM301、HZ816及HP-20各10 mL于250 mL錐形瓶中，分別準(zhǔn)確量取靈芝總?cè)颇敢?0 mL加于各錐形瓶中，另量取30 mL靈芝總?cè)颇敢河?50 mL錐形瓶（不含樹(shù)脂）作為空白對(duì)照組，用保鮮膜和膠布封口后，置于振蕩培養(yǎng)箱中，100 r/min，25 ℃，振搖24 h，抽濾，濾液備用。各取濾液0.04 mL，按“1.2.2項(xiàng)6）母液中靈芝總?cè)坪繙y(cè)定”的方法，分別測(cè)定空白對(duì)照組與各型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂吸附后濾液中靈芝總?cè)频暮?，?jì)算各大孔吸附樹(shù)脂對(duì)靈芝總?cè)频奈搅亢臀铰省?/p>

吸附量＝空白對(duì)照組中總?cè)坪浚瓰V液中總?cè)坪浚晃铰剩?空白對(duì)照組中總?cè)坪浚瓰V液中總?cè)坪?/空白對(duì)照組中總?cè)坪俊?00%。

3）靜態(tài)解吸考察 將“1.2.3”項(xiàng)2）中通過(guò)過(guò)濾得到的已吸附靈芝三萜的8種樹(shù)脂分別完全轉(zhuǎn)移入250 mL錐形瓶中，再分別加入50 mL的95%乙醇，用保鮮膜和膠布封口后，置于振蕩培養(yǎng)箱中，100 r/min，25 ℃，振搖24 h，抽濾，濾液備用。各取濾液0.08 mL，按“1.2.2項(xiàng)6）母液中靈芝總?cè)坪繙y(cè)定”的方法，測(cè)定各型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂解吸附后對(duì)應(yīng)濾液中靈芝總?cè)频暮?，?jì)算解吸率。

解吸率（%）＝解吸后濾液中總?cè)频暮?吸附量×100%。

2 結(jié)果

2.1 靈芝總?cè)颇敢褐锌側(cè)坪?/h3>

2.1.1 精密度測(cè)定

結(jié)果表明，儀器精密度良好（表2）。

表2 精密度測(cè)定

2.1.2 穩(wěn)定性測(cè)定

結(jié)果表明，在樣本配制后5～45 min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，穩(wěn)定性良好（表3）。

表3 穩(wěn)定性測(cè)定

2.1.3 重復(fù)性測(cè)定

結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好（表4）。

表4 重復(fù)性測(cè)定

2.1.4 回收率測(cè)定

結(jié)果表明，方法回收率良好（表5）。

表5 回收率測(cè)定

2.1.5 靈芝總?cè)颇敢褐锌側(cè)坪?/p>

齊墩果酸濃度于4～20 μg/mL范圍內(nèi)與其吸光度值線性關(guān)系良好，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.011 8+0.032 67C，r=0.999 5。經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得靈芝總?cè)颇敢褐锌側(cè)破骄繛?.46 mg/mL（表6）。樣品測(cè)定前，我們考察了母液中的非三萜有色物質(zhì)是否會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果。取0.02 mL母液于5 mL具塞試管中，再加入無(wú)水乙醇使總量為5 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為0.003，因此，母液中的非三萜類(lèi)有色物質(zhì)不會(huì)對(duì)三萜的測(cè)定產(chǎn)生干擾。

表6 靈芝總?cè)颇敢褐锌側(cè)茲舛?/p>

2.2 靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

根據(jù)計(jì)算公式得出8種大孔吸附樹(shù)脂吸附率和解吸率。結(jié)果表明，HPD400大孔吸附樹(shù)脂的吸附率（67.27%）和解吸率（97.5%）均較高（圖1），因此，綜合考慮，選擇其用于靈芝總?cè)频母患ぷ鳌?/p>

圖1 不同型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)靈芝總?cè)频撵o態(tài)吸附-解吸率（n=3）

3 討論

靈芝是一種既可作為食物又可作為藥物使用的物質(zhì)。近年來(lái)，大孔吸附樹(shù)脂已有用于靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)分離純化工作。選擇合適的樹(shù)脂是開(kāi)展利用大孔吸附樹(shù)脂純化靈芝三萜研究工作的基礎(chǔ)。錢(qián)竹等[9]用大孔樹(shù)脂從發(fā)酵液中分離提取靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)，并比較了4種大孔吸附樹(shù)脂AB-8、S-8、NKA-9和HP-20。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AB-8樹(shù)脂最適合于靈芝三萜的分離和純化。段曉穎等[10]通過(guò)乙醇回流提取靈芝子實(shí)體中的靈芝總?cè)瞥煞?，再利用大孔吸附?shù)脂富集，實(shí)驗(yàn)比較了HPD100、HPD300、HPD400、HPD600、D101、AB-8、X-5、HPD-BJQH和S-8這9種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)靈芝總?cè)频母患ЧY(jié)果選擇HPD400來(lái)富集靈芝總?cè)?。通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了HPD400與HPD500、D101、D4020、LSA-21、DM301、HZ816、HP-20對(duì)靈芝總?cè)频奈胶徒馕饔茫C實(shí)HPD400是較理想的大孔吸附樹(shù)脂。

大孔吸附樹(shù)脂的比表面積是影響樹(shù)脂吸附性能的重要因素[11]。與LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂相比，在極性類(lèi)型和樹(shù)脂結(jié)構(gòu)相同，平均孔徑相當(dāng)?shù)那闆r下，比表面積更大的HZ816型樹(shù)脂顯示了更高的吸附率。但過(guò)高的比表面積，可能使HZ816型樹(shù)脂吸附更多的雜質(zhì)，從而干擾靈芝三萜的解吸，結(jié)果HZ816型樹(shù)脂的解吸率反而明顯低于LSA-21型樹(shù)脂。因此，合適的大孔吸附樹(shù)脂比表面積是純化靈芝總?cè)频年P(guān)鍵因素之一。樹(shù)脂的孔徑和極性等也是影響樹(shù)脂吸附性能的重要因素，這些因素最終影響到大孔樹(shù)脂對(duì)所純化物質(zhì)的吸附率和解吸率。通過(guò)比較這些樹(shù)脂對(duì)靈芝三萜的吸附率和解吸率，鑒于HPD400大孔吸附樹(shù)脂同時(shí)具有較高的吸附率和解吸率，因此最終選擇其用于后續(xù)靈芝總?cè)频母患兓ぷ鳌?/p>