QuEChERS 結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定砂仁中4 種黃曲霉毒素

陳昊文，周春霞，陳金，冼燕萍，管晶晶，胡均鵬，羅東輝,3*

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東湛江 524088）（2.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣州市食品安全風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與預(yù)警研究中心，廣州市食品安全檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511447）（3.化學(xué)與精細(xì)化工廣東省實(shí)驗(yàn)室潮州分中心（韓江實(shí)驗(yàn)室），廣東潮州 521000）

砂仁（Fructusamomi）為我國(guó)“四大南藥”之一，距今已有1 300 多年的用藥歷史。藥理作用研究表明，砂仁具有潛在的胃腸保護(hù)、抗炎、鎮(zhèn)痛、止瀉、抑菌、調(diào)節(jié)菌群、降血糖、抗氧化等作用[1-3]。砂仁“藥食同源”，在我國(guó)的傳統(tǒng)飲食里還是一種常用的芳香調(diào)味料[4]。由于受氣候地域等條件的影響，砂仁在運(yùn)輸、儲(chǔ)藏過程中極易受到真菌的污染而產(chǎn)生毒素的殘留[5]，對(duì)消費(fèi)者的健康產(chǎn)生潛在危害，世界衛(wèi)生組織（WHO）已經(jīng)將真菌毒素的監(jiān)測(cè)歸入食品安全的重點(diǎn)監(jiān)控項(xiàng)目[6]，因此需要加強(qiáng)對(duì)砂仁中真菌毒素的檢測(cè)和監(jiān)控，以保障消費(fèi)者的飲食安全。

在各種真菌毒素中，由黃曲霉和寄生曲霉兩類霉菌代謝所產(chǎn)生的黃曲霉毒素，因具備高毒性、致癌性、致畸性和致突變性等危害而成為重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象，其中自然界以B 族和G 族的黃曲霉毒素較為常見，包括黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（Aflatoxin G1，AFG1）和黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2），它們的分子結(jié)構(gòu)如圖1 所示，黃曲霉毒素因擁有雙呋喃環(huán)這一基本毒素結(jié)構(gòu)，輔以致癌結(jié)構(gòu)氧雜萘鄰?fù)?，成為危害人體的劇毒物質(zhì)[7]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將黃曲霉毒素視為IA 類致癌物，許多國(guó)家已經(jīng)對(duì)該類毒素制定了嚴(yán)格的食品限制指標(biāo)[8]，我國(guó)GB 2761-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》中也規(guī)定了AFB1 在多種食品基質(zhì)中的限量[9]，可見我國(guó)在食品中黃曲霉毒素的殘留限量方面給予了高度重視，為此建立準(zhǔn)確、快速的相關(guān)檢測(cè)方法具有重要意義。

圖1 4 種黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure formula of 4 aflatoxins

目前，黃曲霉毒素的主要檢測(cè)方法有薄層色譜法（TLC）[10]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[11]、高效液相色譜法（HPLC）[12]、氣相色譜法（GC）[13]等等，由于砂仁基質(zhì)的復(fù)雜性與毒素檢測(cè)的痕量性，上述檢測(cè)方法有著檢測(cè)步驟繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度相對(duì)較低、易出現(xiàn)假陽性等問題[14]，在應(yīng)用方面受到限制。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）由于具備優(yōu)良的分離能力與鑒定能力，被廣泛用于測(cè)定各種食品基質(zhì)中的真菌毒素。此外，目前黃曲霉毒素檢測(cè)的凈化手段主要采用免疫親和柱法[15]，但該法檢測(cè)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)也不利于日常的大批量檢測(cè)。而操作簡(jiǎn)便的QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）凈化法價(jià)格低廉，不僅能快速高效地去除基質(zhì)雜質(zhì)，而且能減少化學(xué)試劑的使用，目前在各類食品中真菌毒素的檢測(cè)領(lǐng)域上有著良好的應(yīng)用[16,17]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，采用QuEChERS-UPLC-MS/MS 法測(cè)定砂仁樣品中真菌毒素的研究尚未見報(bào)道，考慮到檢測(cè)機(jī)構(gòu)的成本及樣品基質(zhì)的復(fù)雜程度，本研究建立了適用于測(cè)定砂仁中4種黃曲霉毒素的QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，以期填補(bǔ)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在檢測(cè)砂仁真菌毒素的空白。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTM 超高效液相色譜、Waters XevoTM TQ MS 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters 公司；ACQUITY BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），美國(guó)Waters 公司；ME204 電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；MS3 digital 渦旋混合器，德國(guó)IKA 公司；KDC-40 低速離心機(jī)，安徽中科中佳公司；Milli-Q 去離子水發(fā)生器，美國(guó)Millipore 公司；KQ-500E 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

4 種黃曲霉毒素（Aflatoxin B1、B2、G1、G2）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL），天津阿爾塔科技有限公司；甲醇（HPLC 級(jí)），德國(guó)Merk 公司；乙腈（HPLC 級(jí)），德國(guó)Merk 公司；甲酸（HPLC 級(jí)），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸銨（HPLC 級(jí)）、PSA、C18、GCB，上海安譜有限公司；無水硫酸鎂、氯化鈉，廣州化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 樣品前處理方法

提取：稱取研磨后的砂仁試樣2 g（精確至0.01 g）于50 mL 塑料離心管中，加入5 mL 超純水靜置5 min，使其浸潤(rùn)樣品，再加入5 mLφ=1%甲酸-乙腈溶液渦旋2 min，超聲提取10 min，然后加入1.2 g 無水硫酸鎂和0.4 g 氯化鈉，渦旋2 min，4 200 r/min 離心5 min，取出上清液，重復(fù)萃取兩次，合并提取液。

凈化：吸取1.5 mL 上述清液至含有180 mg C18、150 mg PSA 和300 mg 無水硫酸鎂的2 mL 離心管中，渦旋振蕩2 min 除去雜質(zhì)，12 000 r/min 離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾后，將濾液置于2 mL進(jìn)樣小瓶中，供UPLC-MS/MS 測(cè)定。

1.3 色譜條件

UPLC-MS/MS 檢測(cè)色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨溶液（A）和乙腈（B）；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.4 質(zhì)譜條件

電離方式為電噴霧正離子（ESI+）模式；毛細(xì)管電壓2 kV；離子源溫度150 ℃，去溶劑溫度400 ℃；去溶劑氣為氮?dú)猓?00 L/Hr；錐孔氣為氮?dú)猓?50 L/Hr；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），4 種黃曲霉毒素的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)如表2 所示。

表2 4 種黃曲霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS/MS parameters of 4 aflatoxins

表3 4 種黃曲霉毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Linear equation,linear range,correlation coefficient (R2),LOD,LOQ and ME of 4 aflatoxins

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度為10 μg/mL Aflatoxin B1、B2、G1、G2 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，配制成1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液（100 μg/L）：準(zhǔn)確移取4 種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 于10 mL 容量瓶，用乙腈定容到10.00 mL，此時(shí)各化合物質(zhì)量濃度均為100 μg/L，于4 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：用乙腈溶液稀釋混合中間液（或根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)使用空白基質(zhì)溶液稀釋），配制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線為0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/L。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)進(jìn)行3 次平行，采用Origin 2021 pro 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

MRM 模式由于具有良好的選擇性，能同時(shí)掃描多化合物多離子對(duì)[18]，為獲得4 種化合物最佳靈敏度和分離效果，本實(shí)驗(yàn)對(duì)每個(gè)目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。采用直接進(jìn)樣的方式，在電噴霧正離子（ESI+）模式下分別對(duì)4 種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 μg/L）進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，尋找目標(biāo)化合物的母離子信息，通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品掃描后發(fā)現(xiàn)，4 種化合物在電離后均產(chǎn)生了[M+H]+峰，因此均采用[M+H]+作為其分子離子峰；4 種目標(biāo)化合物的母離子經(jīng)碰撞后，分別對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖，確定兩個(gè)子離子（響應(yīng)值較高、質(zhì)量數(shù)較大）分別作為定性、定量離子，并優(yōu)化得到每種黃曲霉毒素特征離子對(duì)的最佳質(zhì)譜參數(shù)，使特征離子對(duì)響應(yīng)最高[19]。經(jīng)優(yōu)化后的特征離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱是液相色譜的靈魂，是保證多分析物能良好分離的關(guān)鍵。由于化合物AFB1 和AFG1 的結(jié)構(gòu)與極性較為相似，本研究比較了ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）和ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（1.7 μm，100 mm×2.1 mm）對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果。運(yùn)用相同的實(shí)驗(yàn)條件，使用質(zhì)量濃度為2 μg/L的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACQUITY UPLC HSS T3 柱能夠在6 min 內(nèi)較好的分離4 種化合物，獲得最優(yōu)的峰型與響應(yīng)強(qiáng)度，原因在于HSS T3 作為極性較強(qiáng)的色譜柱，本質(zhì)上是在C18 鍵合相基礎(chǔ)上加上了極性基團(tuán)修飾，輔以高純度的合成硅膠作為基體，使得該色譜柱對(duì)高比例水相及低pH 的耐受性更好，故選擇ACQUITY UPLC HSS T3 柱作為分析色譜柱。

在反相液相色譜中，甲醇-水、乙腈-水等是較為常用的流動(dòng)相體系，為了改善峰型和提高離子化效率可以向水相中添加少量甲酸、乙酸銨等試劑[20]。因此，本研究以甲醇、乙腈分別與純水、φ=0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L 乙酸銨水溶液、φ=0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨組成流動(dòng)相，比較4 種真菌毒素的出峰情況。結(jié)果表明，不同流動(dòng)相能在一定程度上影響目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間和響應(yīng)值。由于乙腈較強(qiáng)的洗脫能力，選擇乙腈為有機(jī)相的流動(dòng)相體系相比甲醇而言，柱壓明顯降低，這對(duì)于儀器保護(hù)和檢測(cè)效率而言更為有利。綜合比較以乙腈為有機(jī)相的流動(dòng)相組合的出峰效果與響應(yīng)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)以乙腈與0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨溶液組合作為流動(dòng)相時(shí)，4 種黃曲霉毒素的保留時(shí)間穩(wěn)定，且色譜峰形和響應(yīng)強(qiáng)度最好，因此將其確定為該方法的最佳流動(dòng)相組合，最佳梯度洗脫條件通過改變不同時(shí)間段流動(dòng)相的比例進(jìn)行確定，目標(biāo)毒素的提取離子流圖如圖2 所示。

圖2 4 種黃曲霉毒素的提取離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of 4 aflatoxins

2.3 提取條件的優(yōu)化

不同類型的提取溶劑因其極性和溶解性的差異會(huì)影響目標(biāo)化合物的提取效果，多數(shù)真菌毒素易溶于有機(jī)溶劑，而目前甲醇和乙腈兩種溶劑常被用于毒素的提取，此外，向提取溶劑中添加酸對(duì)某些真菌毒素的提取具有正向作用[21]，降低提取系統(tǒng)的pH 值有利于促進(jìn)部分毒素在有機(jī)相中的分布[22]，因此，本研究選擇基質(zhì)較為復(fù)雜的陽春砂仁作為代表性基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，考察了甲醇、乙腈、1%甲酸-甲醇、1%甲酸-乙腈對(duì)目標(biāo)化合物回收的影響，不同提取溶劑對(duì)黃曲霉毒素的提取效果及回收率結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 4 不同提取劑的提取效果Fig.3 Extraction effect of different extractant

圖4 4 不同提取劑對(duì)黃曲霉毒素回收率的影響Fig.4 Effect of different extractant on recovery of 4 aflatoxins

實(shí)驗(yàn)表明，使用乙腈組提取的回收率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甲醇組的回收率，當(dāng)使用乙腈作為提取溶劑時(shí)，4 種黃曲霉毒素的回收率在64.48%～125.81%之間，而用甲醇作為提取溶劑時(shí)，4 種黃曲霉毒素的回收率最高僅達(dá)52.34%（圖4）。這是由于甲醇比乙腈具有更好的溶解性，易將樣品中的非目標(biāo)成分提取出來，使得樣品中的其他基質(zhì)進(jìn)入到提取液中，獲得的提取物顏色過深，干擾后續(xù)的鹽析和凈化步驟，進(jìn)而導(dǎo)致目標(biāo)化合物的電離信號(hào)受到抑制[23]，使用甲醇時(shí)的共萃取現(xiàn)象導(dǎo)致低回收率的結(jié)果在肉豆蔻[20]基質(zhì)的相關(guān)研究中也有報(bào)道，該研究同樣選擇了乙腈對(duì)多種真菌毒素進(jìn)行提取。乙腈的極性適中，使用時(shí)能減少共萃取物的干擾，從而獲得較為理想的回收率，同時(shí)可以觀察到使用酸化后的乙腈作為提取劑時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率在69.81%～104.95%，整體與純乙腈的回收率相比更接近于100%，因此選擇1%甲酸-乙腈作為提取劑。

在QuEChERS 前處理過程中加入鹽析劑可以促進(jìn)目標(biāo)化合物從水相進(jìn)入有機(jī)相，利于水相和有機(jī)相的相互分離，從而提高化合物在提取時(shí)的回收率[24]。本實(shí)驗(yàn)選擇無水MgSO4和NaCl 兩種較為常見的鹽析劑，并對(duì)其用量進(jìn)行優(yōu)化，由于MgSO4具有干燥放熱特性，能誘使極性化合物從水相往有機(jī)相遷移，利于目標(biāo)化合物的回收[20]，然而當(dāng)MgSO4的量超過1.2 g時(shí)，整個(gè)樣品體系的加熱情況和結(jié)塊程度明顯，導(dǎo)致提取液無法完全取出，影響對(duì)目標(biāo)毒素的回收。參考Zhang 等[25]研究中的類似現(xiàn)象并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們優(yōu)化確定鹽析劑的使用劑量為1.2 g 無水MgSO4和0.4 g NaCl。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

考慮到砂仁基質(zhì)中含有酚類、多糖、色素等干擾物質(zhì)[26]，這些化合物不僅會(huì)影響目標(biāo)物的響應(yīng)值，同時(shí)會(huì)對(duì)儀器造成一定的污染，影響儀器壽命，因此在進(jìn)樣之前需要對(duì)提取液進(jìn)行QuEChERS 技術(shù)凈化[27]，不同凈化劑對(duì)黃曲霉毒素的除雜效果及回收率結(jié)果見圖5、圖6。PSA、C18和GCB 作為三種常見的凈化吸附劑，被廣泛用于除去基質(zhì)中雜質(zhì)；C18可用于吸收基質(zhì)中的非極性成分和脂肪類物質(zhì)，PSA 是一種弱陰離子交換劑，可有效去除有機(jī)酸、脂肪酸、色素等成分，GCB 對(duì)含苯結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物有較好的吸附能力[28]。同時(shí)，加入無機(jī)鹽能去除有機(jī)相中的水分并將基質(zhì)中的非目標(biāo)干擾物保留在水層，利于真菌毒素溶入有機(jī)相的同時(shí)提高溶液電離強(qiáng)度[29]，從而提高回收率。本實(shí)驗(yàn)考察了三種凈化劑單獨(dú)或協(xié)同使用對(duì)回收率的影響，并對(duì)凈化劑和無水MgSO4的用量進(jìn)行了優(yōu)化，從凈化液的澄清度上看，PSA+C18+GCB 的凈化效果最好，溶液狀態(tài)接近無色透明，PSA+C18混合使用的凈化效果也要優(yōu)于三種凈化劑單獨(dú)使用（圖5）；但從回收率上看，由于GCB 對(duì)于平面結(jié)構(gòu)的真菌毒素具有較高的親和力，它的加入使目標(biāo)物的回收率明顯下降（圖6），這一現(xiàn)象也與Zhao 等[20]的研究結(jié)果相似，在該研究中其經(jīng)過篩選后選擇了單一的C18作為凈化劑。雜質(zhì)相對(duì)較少的樣品更有利于對(duì)色譜柱和儀器的保護(hù)，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇PSA+C18+無水MgSO4作為凈化劑組合。

圖5 不同吸附劑對(duì)砂仁基質(zhì)的凈化效果Fig.5 Purifying effect of different adsorbents on Amomum villosum

圖6 不同吸附劑對(duì)4 種黃曲霉毒素回收率的影響Fig.6 Effect of adsorbents on recovery of 4 aflatoxins

圖7 吸附劑用量對(duì)4 種黃曲霉毒素回收率的影響Fig.7 Effect of the amount of sorbents on recovery of 4 aflatoxins

在QuEChERS 凈化技術(shù)的應(yīng)用中，吸附劑的用量對(duì)基質(zhì)雜質(zhì)的去除和目標(biāo)化合物的回收有著至關(guān)重要的作用，過量吸附劑的使用會(huì)導(dǎo)致部分目標(biāo)物被吸附除去，吸附劑劑量使用的不足會(huì)導(dǎo)致除雜效果不佳，兩種情況皆會(huì)影響方法的靈敏度及目標(biāo)化合物的響應(yīng)值。本實(shí)驗(yàn)前期比較了不同用量（50、100、150、200 mg）的C18、PSA（1:1）組合的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C18、PSA（1:1）的用量為150 mg 時(shí)目標(biāo)物的整體回收率最高，達(dá)到了72.09%～91.13%，因此通過選取兩種凈化劑120、150、180 mg 三個(gè)水平下的用量組合，進(jìn)行優(yōu)化配比，并加以比較了C18、PSA（1:2）和（2:1）的凈化效果。凈化劑用量對(duì)黃曲霉毒素的回收率結(jié)果見圖5，兩種凈化劑用量為180 mg C18+150 mg PSA時(shí)4 種毒素的整體回收率最高，達(dá)到了77.75%～98.49%，因而選擇此配比為凈化劑最佳用量，同時(shí)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)加入無水MgSO4能普遍提高目標(biāo)毒素的回收率，可以解釋為鹽的除水作用能使目標(biāo)物往有機(jī)層移動(dòng)，從而盡可能地使其充分溶解于乙腈。綜合凈化劑種類及其用量的探究結(jié)果，本研究確定以“180 mg C18+150 mg PSA+300 mg 無水MgSO4”為最佳凈化劑組合，此組合下目標(biāo)物的回收率達(dá)到了94.12%～110.49%。無獨(dú)有偶，姚譽(yù)陽等[12]對(duì)該4 種毒素的凈化提取同樣使用了該凈化劑組合，但用量不同，其用量為75 mg C18+50 mg PSA+200 mg 無水MgSO4，與本實(shí)驗(yàn)相比較少，這與樣品基質(zhì)相關(guān)，基于砂仁基質(zhì)的復(fù)雜性，該凈化劑組合的確定，對(duì)于精準(zhǔn)測(cè)定4種毒素尤為重要。

2.5 線性范圍、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

在液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的分析過程中，目標(biāo)化合物的檢測(cè)結(jié)果會(huì)被樣品基質(zhì)中的某些物質(zhì)所干擾，這種現(xiàn)象被稱作基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）[30]，對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)，采用ME=K1/K2（K1：基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，K2：溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）評(píng)估[31]：若ME 在0.8～1.2之間，基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)，ME 值低于或高于該范圍則表明存在基質(zhì)抑制或增強(qiáng)現(xiàn)象。經(jīng)分析表明，4 種毒素的基質(zhì)效應(yīng)在0.46～0.67 的范圍內(nèi)，表明該方法存在基質(zhì)抑制情況，同位素內(nèi)標(biāo)法與空白基質(zhì)外標(biāo)法常被用于改善基質(zhì)抑制情況，考慮到檢測(cè)機(jī)構(gòu)的成本及分析時(shí)間等因素，本實(shí)驗(yàn)采用后者進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)以補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。

配制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.20～10.00 μg/L，6 個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)），上機(jī)測(cè)定。以目標(biāo)物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（y）與對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/L）作圖，繪制4 種黃曲霉毒素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性方程和相關(guān)系數(shù)，儀器的檢出限（LOD，S/N≥3）和定量限（LOQ，S/N≥10）通過信噪比（S/N）來確定。結(jié)果表明，4 種黃曲霉毒素在0.20～10.00 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與其對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度展現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.998 9，方法檢出限在0.30～0.60 μg/kg 之間，方法定量限在1.00～2.00 μg/kg 之間，其中AFB1、AFB2 的檢出限和定量限與米粉[12]、白露片[32]基質(zhì)中的報(bào)道值相同，AFG1 的檢出限和定量限低于檳榔[33]基質(zhì)的報(bào)道值，AFG2 的檢出限和定量限低于玉米[34]基質(zhì)中的報(bào)道值，由此可知，本方法的定性和定量分析能力良好。

2.6 方法回收率和精密度

通過分析在定量限水平下加標(biāo)的空白砂仁樣品，評(píng)估該方法的回收率與精密度。分別按照低（1×LOQ）、中（2×LOQ）、高（10×LOQ）3 個(gè)質(zhì)量濃度水平加入適量4 種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度做6 個(gè)平行樣品，上機(jī)測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率（Recovery）、日內(nèi)精密度（Intra-RSD）和日間精密度（Inter-RSD）。結(jié)果表明，在砂仁基質(zhì)中，各目標(biāo)化合物在低水平添加量下的平均回收率為89.50%～107.70%，日內(nèi)精密度為3.04%～6.71%，日間精密度為4.16%～6.20%；在中水平添加量下的平均回收率為99.17%～113.12%，日內(nèi)精密度為3.01%～4.87%，日間精密度為3.73%～4.66%；在高水平添加量下的平均回收率為101.60%～105.31%，日內(nèi)精密度為1.31%～2.32%，日間精密度為1.29%～3.11%（表4），證明此方法具有較高的可重復(fù)性與準(zhǔn)確度，可滿足砂仁食品中4 種黃曲霉毒素的定量分析要求。

表4 實(shí)際空白樣品4 種黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Spiked recoveries and RSDs of 4 aflatoxins in real blank samples (n=6)

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)廣州市售的15 批砂仁樣品進(jìn)行定量分析，均未檢測(cè)出陽性樣品。從檢測(cè)結(jié)果上分析，廣州市售砂仁的黃曲霉毒素污染情況并不嚴(yán)重，但參考學(xué)者現(xiàn)有的研究及實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果[35,36]，隨著各地氣候的差異及儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，砂仁中仍存在黃曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)，該方法對(duì)于其污染情況的日常篩查具有重要意義。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)砂仁中4 種黃曲霉毒素的測(cè)定方法，該方法前處理過程簡(jiǎn)便、靈敏度高、復(fù)現(xiàn)性強(qiáng)。通過對(duì)不同流動(dòng)相、色譜柱、提取條件及凈化條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件，經(jīng)ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱分離后4 種黃曲霉毒素得到良好分離；采用1%甲酸-乙腈提取、QuEChERS 鹽析和凈化以獲得良好的除雜效果及回收率。與現(xiàn)有文獻(xiàn)相比，本文首次將超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于砂仁基質(zhì)中黃曲霉毒素的檢測(cè)，該方法可滿足政府監(jiān)管部門對(duì)砂仁中4 種黃曲霉毒素快速篩查，有望在日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中得到良好的應(yīng)用，具有一定的實(shí)際意義。