基于蔗糖代謝途徑分析保加利亞乳桿菌的后酸化性能

唐宗馨，楊碩，段勃帆，陳禹含，孟祥晨

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

發(fā)酵乳是指以原料乳為底物，經(jīng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌等發(fā)酵劑發(fā)酵而制成的乳制品，因其具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)、獨特的風味以及對人體的健康益處深受消費者喜愛[1]，發(fā)酵劑的產(chǎn)酸能力不僅會影響發(fā)酵乳制品的風味，還會影響發(fā)酵乳在貯藏過程中的產(chǎn)酸情況[2]。發(fā)酵乳在貯藏、運輸、銷售等食用前階段，其中的乳酸菌繼續(xù)以緩慢的速度持續(xù)代謝產(chǎn)生乳酸，乳酸量過大會使產(chǎn)品出現(xiàn)消費者不可接受的過度酸味，導致發(fā)酵乳感官品質(zhì)下降，這種現(xiàn)象被稱為發(fā)酵乳的后酸化。后酸化會使發(fā)酵乳的流變性質(zhì)變差，降低其中益生菌的存活，縮短產(chǎn)品保質(zhì)期，嚴重影響發(fā)酵乳的可食用性[3,4]。目前發(fā)現(xiàn)，影響發(fā)酵乳后酸化的因素包括：菌株特性[5]、牛奶成分[6]、溫度和pH值[7,8]等，其中，選擇使用后酸能力弱的菌株發(fā)酵制作發(fā)酵乳是控制后酸化的重要措施之一。

近年來，隨著發(fā)酵乳市場逐漸發(fā)展壯大，發(fā)酵乳品種越來越多，營養(yǎng)價值越來越豐富，已經(jīng)成為生活的必需品，但其后酸化問題卻一直制約著發(fā)酵乳行業(yè)的發(fā)展。無論是消費者還是生產(chǎn)制造商都越來越關(guān)心發(fā)酵乳的貨架期品質(zhì)穩(wěn)定性問題。一些研究人員嘗試通過改善工藝水平控制發(fā)酵乳后酸化[9]，一些研究人員試圖使用添加劑、細菌素減弱發(fā)酵乳的后酸化情況[10,11]，同時也有人對菌株的誘變育種和基因工程方面進行了大量研究[12]，但突變菌株的安全性及遺傳穩(wěn)定性都不確定，不能從根本上解決后酸化問題。研究表明保加利亞乳桿菌具有很強的耐酸性和產(chǎn)酸能力，是發(fā)酵乳發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌，也是導致后酸化的主要菌株[13]。在產(chǎn)酸過程中，保加利亞乳桿菌通過β-半乳糖苷酶將乳糖分解成半乳糖和葡萄糖，通過蔗糖酶（β-D-呋喃果糖苷水解酶）將蔗糖分解成果糖和葡萄糖，葡萄糖進入糖酵解（EMP）途徑產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸在乳糖脫氫酶的催化下分解代謝為乳酸，逐漸地使培養(yǎng)基質(zhì)酸化[14]。目前，有研究揭示了保加利亞乳桿菌代謝乳糖相關(guān)基因的表達[15]，還有研究證明可以通過調(diào)控保加利亞乳桿菌乳糖代謝途徑中產(chǎn)酸關(guān)鍵酶的活性來減弱發(fā)酵乳的后酸化[16]，而針對保加利亞乳桿菌蔗糖代謝途徑的研究鮮有報道。因此，基于保加利亞乳桿菌蔗糖代謝途徑研究保加利亞乳桿菌的后酸化性能，對調(diào)控發(fā)酵乳后酸化、提高發(fā)酵乳質(zhì)量和貨架期內(nèi)的品質(zhì)穩(wěn)定性有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 菌株

東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室前期分離保藏的保加利亞乳桿菌Lb.1、Lb.2、KLDS 1.1011、KLDS 1.1006 及KLDS 1.0207。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基（葡萄糖質(zhì)量分數(shù)2%），北京奧博星生物技術(shù)有限公司；脫脂乳培養(yǎng)基：12 g 脫脂乳溶于100 mL 蒸餾水；乳糖培養(yǎng)基：將MRS 中的葡萄糖換為等質(zhì)量乳糖；蔗糖培養(yǎng)基：將MRS 中的葡萄糖換為等質(zhì)量蔗糖；雙糖培養(yǎng)基：將MRS 中的葡萄糖換為等質(zhì)量的乳糖和蔗糖（乳糖:蔗糖=1:1.5）。

1.1.3 試劑

乳糖、蔗糖、半乳糖、乳酸標準品（色譜純），天津市科密歐化學試劑有限公司；蔗糖酶，北京紅潤寶順科技有限公司；微生物蔗糖酶檢測試劑盒，江蘇酶免實業(yè)有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Talent qPCR PreMix（SYBR Green）實時聚合酶鏈式反應試劑盒、培養(yǎng)細胞/細菌總RNA 提取試劑盒，天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SPL-150 型恒溫培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；光學顯微鏡，上海光學儀器一廠；DK-8 D 型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；Model 680型酶標儀，美國Beckman 公司；紫外分光光度計，美國Bio-Rad 公司；熒光定量PCR 儀，美國Applied Biosystems 公司；微量臺式離心機，美國Beckman 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 保加利亞乳桿菌后酸能力的測定

將實驗室保藏的5 株保加利亞乳桿菌分別接種至脫脂乳培養(yǎng)基中活化2 代，再以3%（V/V）的接種量接種至質(zhì)量分數(shù)為6%的蔗糖脫脂乳培養(yǎng)基中，42 ℃發(fā)酵至70 °T，4 ℃冷藏12 h 后記作貯藏的起點，再于4 ℃貯藏21 d，每隔3 d 取樣測定pH 值、滴定酸度和活菌數(shù)。

參考國標（GB 5009.237-2016）[17]測定發(fā)酵乳的pH值；參考國標（GB 5009.239-2016）[18]測定發(fā)酵乳的滴定酸度，最終滴定酸度采用吉爾涅爾度（°T）表示；參照國標（GB 4789.35-2016）[19]測定發(fā)酵乳中活乳酸菌的數(shù)量。

1.3.2 保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的糖代謝活性測定

1.3.2.1 樣品的前處理

取經(jīng)發(fā)酵、冷藏后熟后貯藏第0、7、14、21 天的發(fā)酵乳，采用Carrez 法處理除去樣品中的蛋白質(zhì)收集上清液[20]。

1.3.2.2 蔗糖、乳糖、半乳糖及乳酸含量的測定

分別取蔗糖、乳糖、半乳糖和乳酸標準品，加去離子水配制為20 g/L 的標準儲備液，稀釋至合適濃度并混合作為液相色譜的混合標準品。

分別取經(jīng)1.3.2.1處理后的上清液和混合標準品各1.5 mL，分別過0.22 μm 濾膜以去除蛋白及細菌菌體，使用液相色譜儀檢測蔗糖、乳糖、半乳糖及其代謝產(chǎn)生乳酸的含量，進樣量為10 μL[21]。

色譜條件：HPX-87H 色譜柱（酸柱），檢測波長254 nm，柱溫60 ℃，流動相為5 mmol/L H2SO4，分離時間為30 min，流速0.6 mL/min。

Hi-plexH 色譜柱（糖柱），檢測波長254 nm，柱溫60 ℃，流動相為純水，分離時間為15 min，流速0.6 mL/min。

在上述條件下，獲得蔗糖保留時間為9.94 min，標準曲線為y=18 848x+7 446.4，R2=0.995 8；乳糖保留時間為8.73 min，標準曲線為y=13 487x+15 122，R2=0.996 5；半乳糖保留時間為10.46 min，標準曲線為y=16 849x+6 144.7，R2=0.995 2；乳酸保留時間為20.93 min，標準曲線為y=70 066x-47 603，R2=0.991 8。式中的y表示液相色譜中的峰面積（mV·s）；x表示質(zhì)量濃度（g/L）。

1.3.3 保加利亞乳桿菌在含不同碳源培養(yǎng)基中的生長情況

分別取后酸能力差異最大的Lb.1 和KLDS1.0207活化2 次后，以3%（V/V）的接種量接種至乳糖和蔗糖培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h 取樣，記錄發(fā)酵24 h 過程中菌株的pH 值和OD600nm。

1.3.4 發(fā)酵液蔗糖及乳酸含量的測定

將Lb.1 與KLDS 1.0207 以3%（V/V）接種量接種至蔗糖培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，分別取0 h 和24 h 的培養(yǎng)物1.5 mL，在12 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液過0.22 μm 濾膜以去除蛋白及細菌菌體，使用高效液相色譜儀按照1.3.2.2 方法檢測蔗糖及乳酸的含量。

1.3.5 熒光定量PCR 檢測蔗糖代謝相關(guān)基因表達量

1.3.5.1 菌體的收集

將Lb.1 與KLDS1.0207 以3%（V/V）接種量分別接種至雙糖培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h 后，取培養(yǎng)物400 μL 于4 ℃、12 000 r/min 離心2 min 后收集菌體。

1.3.5.2 RNA 的提取及逆轉(zhuǎn)錄

四是《條例》從生產(chǎn)、生活和生態(tài)3個方面作出規(guī)定，涉及建設應急備用水源、供水設施改造、取水總量控制、清淤疏浚、地下水禁采、水污染物總量控制削減、城鄉(xiāng)污水垃圾處理、禽畜養(yǎng)殖污水污物處置、農(nóng)藥化肥減施、船舶污染物收集、運送劇毒或危險化學品船舶重點區(qū)域禁運、藍藻打撈、植樹造林、增殖放流等方面綜合的手段和措施。

采用天根RNA prep Pure 培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒提取菌體總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在冰浴條件下混合體系并合成cDNA，合成后于-20 ℃保存。

1.3.5.3 引物的設計及RT-qPCR 分析

以repA 為內(nèi)參基因，使用QuantStudio 3 系統(tǒng)和TB Green? Premix Ex Taq? II 測定目標基因的表達。反應體系為20 μL，反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共進行40 個循環(huán)，并記錄循環(huán)閾值。引物采用Primer 5.0 軟件設計（表1），部分引物的設計參照文獻。

表1 實時熒光定量RT-qPCR 引物Table 1 Primers of RT-qPCR

計算方法：Lb.1 培養(yǎng)物為對照組，以相同取樣條件KLDS1.0207 培養(yǎng)物作為試驗組，根據(jù)ΔCt=目標基因Ct-內(nèi)參基因Ct，ΔΔCt=ΔCt 試驗組-ΔCt 空白組，采用2-ΔΔCt相對定量法計算目標基因相對表達量。

1.3.6 蔗糖酶活性測定

胞內(nèi)酶的提取：將Lb.1 與KLDS1.0207 以3%（V/V）的接種量接種至蔗糖培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h（對數(shù)生長期后期），分別取Lb.1 與KLDS 1.0207 培養(yǎng)物10 mL 于4 ℃，8 000 r/min 離心10 min 收集菌體，將菌體懸浮于8 mL 的20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 值7.5）后，加入1 mL 的10 mg/mL（20 000 U/mg）的溶菌酶，于37 ℃下水浴50 min，將懸浮液10 000 r/min 離心10 min 以除去細胞殘片和未破碎的細胞，離心后上清液即為胞內(nèi)酶的粗酶液[16]。

酶活性的測定：將處理后的粗酶液加于酶標板孔底部，之后按照試劑盒說明書進行操作，試驗結(jié)束后取出溶液立即在450 nm 處測定吸光度值。在上述條件下，獲得蔗糖酶標準曲線為y=0.294 9x+0.082 6，R2=0.993。式中：y表示OD450nm；x表示酶活力（U/mg）。

取Lb.1 以3%（V/V）的接種量分別接種至蔗糖培養(yǎng)基和補充質(zhì)量分數(shù)為3‰蔗糖酶的蔗糖培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，每隔2 h 取樣，測定OD600nm和pH。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗均獨立重復三次，結(jié)果以“平均值±標準差（Standard Deviation，SD）”表示。采用SPSS 25軟件進行統(tǒng)計學分析，采用GraphPad Prism 9 軟件進行繪圖。兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗，多樣本比較采用ANOVA 分析和Tukey 檢驗，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 保加利亞乳桿菌的后酸化能力比較

發(fā)酵乳酸度是衡量消費者對貨架期內(nèi)產(chǎn)品接受程度的重要指標[23,24]，乳酸菌活菌數(shù)一定程度上可以反應發(fā)酵乳的新鮮度和品質(zhì)[25]。本試驗使用5 株保加利亞乳桿菌分別發(fā)酵脫脂乳，測定了發(fā)酵乳在4 ℃貯藏期間pH 值、滴定酸度和活菌數(shù)的變化。結(jié)果表明，在0～9 d 的貯藏期間，pH 值下降快，酸度也急劇升高；貯藏9～21 d 期間，pH 值下降與滴定酸度上升的速率逐漸趨于平緩。5 株菌的后酸化能力由大到小依次為：KLDS 1.0207＞KLDS 1.1006＞Lb.2＞KLDS 1.1011＞Lb.1；其中，KLDS 1.0207 發(fā)酵乳的滴定酸度變化最大，Lb.1 發(fā)酵乳的滴定酸度變化最?。辉谫A藏21 d結(jié)束時，二者的pH 值分別降至4.03 和4.23（圖1a），滴定酸度分別增加了46.00 °T 和30.00 °T（圖1b）。菌株在貯藏期內(nèi)pH 值與滴定酸度的變化量越小，表明發(fā)酵乳的后酸化越弱[26,27]。

圖1 發(fā)酵乳4 ℃貯藏21 d 的滴定酸度（a）、pH 值（b）及活菌數(shù)（c）變化Fig.1 Changes in acidity (a),pH value (b) and viable bacteria count (c) of fermented milk stored at 4 ℃ for 21 days

發(fā)酵乳在4 ℃貯藏過程中，隨酸度升高活菌數(shù)降低。初始接種量均為106CFU/mL，發(fā)酵結(jié)束后轉(zhuǎn)入4 ℃貯藏，貯藏開始時活菌數(shù)均高于108CFU/mL，而12 d 后活菌數(shù)大部分降至108CFU/mL 以下，后酸化程度低的Lb.1 發(fā)酵乳貯藏21 d 后，從開始的108CFU/mL降至107CFU/mL，活菌數(shù)下降了近一個數(shù)量級；后酸化程度高的KLDS 1.0207從開始108CFU/mL貯藏21 d降至106CFU/mL，活菌數(shù)下降了兩個數(shù)量級（圖1c）。在貯藏過程中，由于持續(xù)產(chǎn)酸，導致pH 值下降，不利于乳酸菌的存活，故導致乳酸菌數(shù)量下降[28]，不同菌株對酸耐受能力不同，貯藏期間存活差異也比較大[29]。選擇后酸能力最弱的保加利亞乳桿菌Lb.1 與后酸能力最強的KLDS 1.0207 進行后續(xù)試驗。

2.2 發(fā)酵乳在貯藏期間的糖代謝活性分析

Lb.1 和KLDS 1.0207 發(fā)酵乳貯藏21 d，檢測碳水化合物的代謝情況，結(jié)果表明，在貯藏期間KLDS 1.0207 發(fā)酵乳的蔗糖含量從4.70 g/L 下降至3.25 g/L，差異顯著（P＜0.05），而弱后酸化菌株Lb.1 發(fā)酵乳的蔗糖含量從5.34 g/L 下降至4.78 g/L，差異不顯著（P＞0.05），該菌蔗糖代謝一直處于較低水平；KLDS 1.0207發(fā)酵乳的乳糖含量從13.70 g/L下降至4.62 g/L，Lb.1 發(fā)酵乳的乳糖含量從13.48 g/L 下降至6.61 g/L，均存在顯著性差異（P＜0.05）；半乳糖含量從貯藏期開始就一直在積累，隨著貯藏時間延長，半乳糖的含量逐漸增多，貯藏21 d 后，Lb.1 與KLDS 1.0207 發(fā)酵乳的半乳糖積累量分別達到2.87 g/L 和2.93 g/L，二者乳酸含量分別增加到5.67 g/L 和12.17 g/L。上述結(jié)果表明后酸化弱的菌株Lb.1 蔗糖代謝率低，產(chǎn)酸緩慢；后酸化強的菌株KLDS 1.0207 在貯藏期間則持續(xù)代謝蔗糖產(chǎn)酸（表2）。

表2 高效液相色譜法測定發(fā)酵乳在4 ℃貯藏期間蔗糖、乳糖、半乳糖及乳酸的含量（g/L）Table 2 Determination of sucrose,lactose,galactose and lactic acid in fermented milk by HPLC during storage at 4 ℃ (g/L)

在糖代謝過程中，乳糖在β-半乳糖苷酶的作用下水解成葡萄糖和半乳糖，其中，葡萄糖通過類似于磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，乳糖和半乳糖通過通透酶系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)運[14]。蔗糖可以在蔗糖酶（β-D-呋喃果糖苷水解酶）的作用下水解成葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，也可以先經(jīng)PTS 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)再進行水解[30]。研究表明大多數(shù)乳酸菌只能代謝蔗糖、乳糖和葡萄糖，而不能利用半乳糖，可能是其不能合成調(diào)節(jié)D-半乳糖代謝途徑（Leior 途徑）中的半乳糖激酶，也可能是由于乳糖-半乳糖的反向轉(zhuǎn)座子運輸競爭抑制了半乳糖激酶的活性[14]。

糖代謝途徑是為乳酸菌正常生長提供能源和還原力的重要化學反應途徑，其中保加利亞乳桿菌不能代謝戊糖，但能通過碳水化合物降解代謝蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖進而生成乳酸，而糖代謝能力較弱的保加利亞乳桿菌只能低效率地通過碳水化合物發(fā)酵和底物水平磷酸化的方式獲取少量能量，產(chǎn)生較少的ATP維持其生命活動并進行生物合成，影響了菌株的能量代謝，能在一定程度上控制發(fā)酵乳的后酸化[31,32]。本試驗中，半乳糖從貯藏開始就逐漸積累，隨著時間的延長，半乳糖的積累量增多，后酸能力強的菌株KLDS 1.0207 糖代謝能力和產(chǎn)酸能力遠遠超過了后酸能力弱的Lb.1，后酸能力弱的Lb.1 蔗糖代謝能力異常弱，其發(fā)酵乳在貯藏7～21 d 間蔗糖含量無顯著差異，可見兩株菌表現(xiàn)出的后酸化能力的差異與它們的蔗糖代謝密切相關(guān)。

2.3 Lb.1 與KLDS 1.0207 在含不同碳源培養(yǎng)基中的生長

兩株菌分別接種至蔗糖和乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)兩株菌的生長速率相差較大，KLDS 1.0207 在兩種培養(yǎng)基中的生長速率明顯高于Lb.1。在乳糖培養(yǎng)基中生長24 h 后，KLDS 1.0207 與Lb.1 的OD600nm差異較??；在蔗糖培養(yǎng)基中生長24 h 后，KLDS 1.0207 的OD600nm大約是Lb.1 的10 倍，前者pH 值為3.22，而Lb.1 僅為5.72（圖2）?？梢娕cKLDS 1.0207 相比，菌株Lb.1 在蔗糖培養(yǎng)基中的生長緩慢，產(chǎn)酸少，這可能是導致Lb.1 后酸化能力弱的原因之一。

圖2 保加利亞乳桿菌Lb.1 和KLDS 1.0207 在蔗糖培養(yǎng)基和乳糖培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h 的pH（a）及OD600nm（b）變化Fig.2 Changes of pH (a) and OD600nm (b) of Lb.1 and KLDS 1.0207 cultured at 37 ℃ for 24 h on sucrose and lactose medium

2.4 兩株菌對蔗糖的利用

將Lb.1 和KLDS 1.0207 接種于蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵24 h 后，二者的蔗糖終轉(zhuǎn)化率分別為5.85%和85.39%，前者極顯著低于后者（P＜0.01），發(fā)現(xiàn)菌株Lb.1 利用蔗糖能力很差；此時兩培養(yǎng)物上清液中乳酸質(zhì)量濃度分別為1.13 g/L 和11.81 g/L，差異極顯著（P＜0.01）（表3）。上述結(jié)果表明，保加利亞乳桿菌對蔗糖的利用能力顯著影響乳酸的生成量，蔗糖利用能力弱，乳酸生成量也低。蔗糖酶以及PTS 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中蔗糖磷酸化酶活性可以影響保加利亞乳桿菌代謝蔗糖的能力[33]，Lb.1 生長速率緩慢，代謝蔗糖生成乳酸量低，可能是由于該菌株的蔗糖酶、蔗糖磷酸化酶活性較弱，影響了蔗糖的水解代謝，乳酸生成量也隨之減少，導致了菌株的低代謝率和弱產(chǎn)乳酸能力。

表3 兩株菌在蔗糖培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h 后蔗糖及乳酸的含量（g/L）Table 3 Sucrose and lactic acid content of two strains cultured in sucrose medium at 37 ℃ for 24 h (g/L)

2.5 蔗糖代謝途徑關(guān)鍵基因的表達量

將Lb.1 和KLDS 1.0207 接種于雙糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，發(fā)現(xiàn)KLDS 1.0207 菌株與蔗糖代謝生成乳酸相關(guān)的基因sacA、pgi、gap、pgk、ldh的相對表達量均極顯著高于菌株Lb.1（P＜0.01），而基因gtfA 的相對表達量與Lb.1 無顯著差異（P＞0.05），其中，KLDS 1.0207菌株sacA基因的表達量是Lb.1的1.96倍（圖3）。

圖3 兩株保加利亞乳桿菌在雙糖培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h時蔗糖代謝相關(guān)基因的表達Fig.3 Expression of genes related to sucrose metabolism in two strains of Lactobacillus bulgaricus cultured in disaccharides medium at 37 ℃ for 24 h

Fernandez 等[34]揭示了保加利亞乳桿菌乳糖代謝途徑中的基因pgi、fruK、fba、tpiA、gap、pgk、eno、pyk、ldh、tuf、purR 和clpC 參與了該菌的酸脅迫過程。李晨等[15]發(fā)現(xiàn)在保加利亞乳桿菌發(fā)酵脫脂乳過程中，基因tpiA、gap、ldh、atpA 表達量變化明顯，其中基因tpiA 的過量表達會影響菌株的產(chǎn)酸和生長。上述基因都是乳糖代謝途徑中的關(guān)鍵基因，但還未見針對蔗糖代謝途徑相關(guān)基因的報道。

基因sacA 編碼的蔗糖酶參與蔗糖水解過程[35]，基因gtfA 編碼的蔗糖磷酸化酶參與蔗糖的轉(zhuǎn)運過程[36]，基因pgi編碼的6-磷酸葡萄糖脫氫酶、基因gap編碼的3-磷酸甘油醛脫氫酶參與糖酵解途徑，基因pgk編碼的磷酸甘油酸激酶[37]、ldh編碼的乳酸脫氫酶參與丙酮酸代謝生成乳酸的過程[38]。sacA 為蔗糖代謝途徑中的上游基因，KLDS 1.0207 中sacA 相對表達量顯著高于菌株Lb.1（P＜0.01），基因gtfA 的相對表達量差異不顯著。結(jié)果表明：與Lb.1 相比，KLDS 1.0207 有更強的蔗糖水解能力，這導致KLDS 1.0207 代謝蔗糖生成較多的葡萄糖和果糖進入糖酵解途徑繼續(xù)代謝，對應糖酵解途徑中的pgi、gap基因的相對表達量上升，進而促進丙酮酸代謝及丙酮酸代謝途徑中的基因pgk、ldh的相對表達量升高，生成更多乳酸。因此蔗糖代謝途徑中的sacA基因是影響保加利亞乳桿菌Lb.1 后酸的關(guān)鍵基因。

2.6 蔗糖酶活性測定

蔗糖酶活性對保加利亞乳桿菌蔗糖代謝和菌株生長意義重大，通過測定后酸化能力不同的保加利亞乳桿菌Lb.1 和KLDS 1.0207 的蔗糖酶活性，發(fā)現(xiàn)：后酸能力強的KLDS 1.0207 菌株蔗糖酶活力顯著高于后酸能力弱的Lb.1（P＜0.05）（圖4）。推測菌株蔗糖酶活力高，蔗糖水解能力強，水解后會生成更多的葡萄糖和果糖，為糖酵解途徑提供更多的原料，進而生成更多的乳酸，導致發(fā)酵乳在貯藏時pH 值下降，酸度上升。因此，可以通過調(diào)控蔗糖酶活性，控制蔗糖水解，弱化后酸。

圖4 兩株保加利亞乳桿菌在蔗糖培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)20 h時的蔗糖酶活力Fig.4 Sucrase activity of two Lactobacillus bulgaricus strains cultured in sucrose medium for 20 h at 37 ℃

2.7 添加蔗糖酶后Lb.1 的生長情況

在蔗糖培養(yǎng)基中補充蔗糖酶后，分析菌株Lb.1在37 ℃培養(yǎng)24 h 過程中的pH 值、OD600nm，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中補充蔗糖酶后Lb.1的OD600nm大約是未補充蔗糖酶的5 倍（圖5a），Lb.1 的生長明顯得到改善。補充蔗糖酶的培養(yǎng)物pH 值為5.30，而未補充蔗糖酶的培養(yǎng)物的pH 值僅為5.72，Lb.1 在補充蔗糖酶后產(chǎn)酸明顯增多（圖5b）。可見菌株Lb.1 由于自身蔗糖酶活性較弱導致其蔗糖水解能力較弱，在培養(yǎng)基中補充蔗糖酶后，蔗糖能更多地被水解成果糖和葡萄糖，再進一步被Lb.1 利用。上述結(jié)果表明，蔗糖酶活性會影響保加利亞乳桿菌對蔗糖的代謝，進而影響菌株在蔗糖培養(yǎng)基中的生長及產(chǎn)酸情況。

圖5 保加利亞乳桿菌Lb.1 在補充蔗糖酶的蔗糖培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h 過程中的OD600nm（a）及pH（b）的變化情況Fig.5 Changes in OD600nm (a) and pH (b) of Lb.1 cultured in sucrose medium supplemented with sucrase for 24 h at 37 ℃

3 結(jié)論

保加利亞乳桿菌Lb.1 是一株弱后酸化菌株，在蔗糖培養(yǎng)基中生長較差，蔗糖代謝能力弱，乳酸產(chǎn)量低。Lb.1 蔗糖酶活性以及編碼蔗糖酶的基因sacA 的相對表達量都很低，因此其發(fā)酵乳在貯藏期間蔗糖代謝產(chǎn)酸下降，表現(xiàn)出較強的弱后酸化能力。上述結(jié)果表明，蔗糖水解是保加利亞乳桿菌蔗糖代謝途徑中的一個關(guān)鍵步驟，可以通過調(diào)控保加利亞乳桿菌蔗糖水解酶活性，降低蔗糖代謝產(chǎn)生乳酸，從而達到弱化發(fā)酵乳后酸的目的。本研究為有針對性的解決發(fā)酵乳后酸化問題，提高產(chǎn)品貨架期內(nèi)品質(zhì)穩(wěn)定性提供了新思路，對發(fā)酵劑的開發(fā)具有非常重要的意義。