茶多酚對(duì)植物乳桿菌的益生作用及其在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用

江福林，盧云浩，何強(qiáng)*

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065）（2.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610106）

發(fā)酵香腸是中國(guó)著名的傳統(tǒng)肉制品，主要是以豬痩肉、豬肥膘、鹽和香料等為原料，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵而成的肉制品，因獨(dú)特的風(fēng)味、質(zhì)地和豐富的營(yíng)養(yǎng)而受到消費(fèi)者的廣泛青睞[1]。早期的發(fā)酵香腸是基于原料中天然存在的微生物發(fā)酵而成的，難以保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量和風(fēng)味。如今，為確保最終發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量，人工控制發(fā)酵以及應(yīng)用商業(yè)發(fā)酵劑已經(jīng)是相當(dāng)普遍的做法[2]。乳酸菌作為發(fā)酵香腸生產(chǎn)中的最重要的發(fā)酵劑之一，可以產(chǎn)酸降低產(chǎn)品pH 值，抑制致病菌和腐敗菌的生長(zhǎng)，同時(shí)使纖維蛋白凝固從而提高最終產(chǎn)品的硬度和內(nèi)聚性。此外，一些乳酸菌具有脂解和蛋白水解活性，有助于香腸風(fēng)味和感官品質(zhì)的形成[1,3]。

茶多酚具有良好的抗氧化和抗菌作用，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中，如發(fā)酵香腸、火腿等[4]。此外，一些研究已經(jīng)證明茶多酚對(duì)于某些益生菌（如乳酸菌）的生長(zhǎng)表現(xiàn)出促進(jìn)作用。Tabasco 等[5]的研究表明，質(zhì)量濃度為0.25～1.0 mg/mL 的多酚（包括兒茶素、表兒茶素和黃烷-3-醇）可以有效刺激乳酸菌的生長(zhǎng)。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，烏龍茶多酚有助于增強(qiáng)乳酸菌的代謝能力，產(chǎn)生更多的乳酸。另一方面，當(dāng)茶多酚的濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)乳酸菌也可能表現(xiàn)出廣譜的抗菌效果。因此，研究茶多酚益生作用的邊界濃度，對(duì)于指導(dǎo)茶多酚在發(fā)酵食品實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度茶多酚對(duì)植物桿菌生長(zhǎng)的影響，探究了茶多酚益生作用的邊界濃度，并在發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)一步證明了這種益生作用。通過(guò)測(cè)定乳酸菌數(shù)、pH 值、水分活度（Water Activity，aw）、色澤、質(zhì)構(gòu)、脂質(zhì)氧化和揮發(fā)性鹽基氮含量，探討了益生作用濃度下的茶多酚對(duì)發(fā)酵香腸理化品質(zhì)的影響，以期為茶多酚在香腸和類(lèi)似發(fā)酵食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

豬肉和香腸輔料，購(gòu)于成都沃爾瑪超市；植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum6253），購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；茶多酚（純度：98%），購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸、氯仿、硫代巴比妥酸、乙二胺四乙酸、硼酸、甲基紅、亞甲基藍(lán)、碳酸鉀、鹽酸均為分析純，購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠；MRS 培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌選擇培養(yǎng)瓊脂，購(gòu)于青島海博生物有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ZWY-2102C 恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；HWS-150B 恒溫恒濕箱，杭州綠博儀器有限公司；FiveEasy plus pH 計(jì)，德國(guó)梅特勒托利多公司；S2-A808絞肉機(jī)，濟(jì)南九陽(yáng)股份有限公司；Labmaster-aw STANDARD 水分活度儀，瑞士Novasina 公司；CM-5色度色差儀，日本柯尼卡美能達(dá)公司；TA.XT.plus 質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)SMS 公司；Biotek 微孔板檢測(cè)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將植物乳桿菌接種于MRS 培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，反復(fù)活化3 次。實(shí)驗(yàn)前用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L PBS，pH 值6.8）將菌液進(jìn)行適度稀釋?zhuān)?.5×108CFU/mL 的菌懸液。

1.3.2 茶多酚益生效果的測(cè)定

稱(chēng)取不同質(zhì)量的茶多酚溶解于50 mL MRS 培養(yǎng)基中，得到質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL 的培養(yǎng)基。將1 mL 菌懸液接種于該培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min 條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定培養(yǎng)基的pH 值。菌液進(jìn)行適度稀釋后，將稀釋菌液均勻涂布于MRS 瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.10、0.20 g 茶多酚溶解于50 mL MRS培養(yǎng)基中，得到質(zhì)量濃度分別為0、2.0、4.0 mg/mL的培養(yǎng)基。將1 mL 植物乳桿菌菌懸液接種于該培養(yǎng)基中，在37 ℃、120 r/min 條件下培養(yǎng)。分別于0、5、15、20、25、30 h 取樣，測(cè)定pH 值和活菌數(shù)。

1.3.4 發(fā)酵香腸制備

參照文獻(xiàn)[7]的方法，將800 g 豬瘦肉和200 g 豬肥膘絞碎，與25 g 氯化鈉、50 g 葡萄糖、0.09 g 亞硝酸鈉、0.1 g 抗壞血酸鈉、3 g 味精、10 g 白酒和3 g 混合香料混合，攪拌均勻后灌入天然豬腸衣。實(shí)驗(yàn)分組如下：CN 組（自然發(fā)酵組）；LP 組（植物乳桿菌接種量：107CFU/g）；LPTP 組（植物乳桿菌接種量：107CFU/g，0.2%（m/m）茶多酚添加量)。所有批次的香腸在恒溫恒濕箱中風(fēng)干1 d（25 ℃、30%～50%相對(duì)濕度），然后在25 ℃、75%～85%相對(duì)濕度下發(fā)酵9 d。在不同發(fā)酵時(shí)間（0、1、3、6、9 d）對(duì)每個(gè)處理組的香腸進(jìn)行取樣，以測(cè)量乳酸菌數(shù)、質(zhì)構(gòu)、脂質(zhì)氧化等情況。

1.3.5 發(fā)酵香腸中乳酸菌數(shù)的測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB 4789.35-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[8]進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)。

1.3.6 發(fā)酵香腸aw和pH 值的測(cè)定

aw值：參照趙改名等[9]的方法測(cè)定；pH 值：使用pH 計(jì)測(cè)定[10]。

1.3.7 發(fā)酵香腸色澤和質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

色差值：參照周垚卿等[11]的方法測(cè)定；質(zhì)構(gòu)：參照何琪等[12]的方法測(cè)定。

1.3.8 發(fā)酵香腸TBARS 值和TVB-N 值的測(cè)定

TBARS 值：將5 g 香腸樣品與25 mL 7.5%（m/V）的三氯乙酸溶液[含0.1%（m/V）乙二胺四乙酸]以6 000 r/min 混合勻漿60 s，然后過(guò)濾兩次。吸取3 mL濾液與3 mL 硫代巴比妥酸溶液（0.02 mol/L）混合均勻后，于沸水中加熱20 min?？瞻捉M與等量三氯乙酸溶液混合。冷卻至室溫后，加入3 mL 氯仿，混合均勻后以4 000 r/min 離心10 min。測(cè)量上層清液在532 nm 和600 nm 的吸光度，TBARS 值以每千克樣品中丙二醛的毫克數(shù)（mg/kg）表示[13]。

TVB-N 值：參照國(guó)標(biāo)GB 5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》測(cè)定[14]

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 26.0 進(jìn)行方差分析、顯著性分析，P＜0.05 時(shí)為差異顯著；使用Origin 2021 進(jìn)行相關(guān)性分析、繪圖。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響

不同質(zhì)量濃度茶多酚對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響如圖1 所示。由圖1 可知，隨著茶多酚質(zhì)量濃度增加，植物乳桿菌活菌數(shù)先增加后減少，且在2 mg/mL 時(shí)達(dá)到最大。與空白組相比，當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，活菌數(shù)增長(zhǎng)了21.39%，能夠明顯促進(jìn)植物乳桿菌生長(zhǎng)（P＜0.05）。當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度為6 mg/mL 時(shí)，活菌數(shù)則減少了11.63%，顯著抑制植物乳桿菌的生長(zhǎng)（P＜0.05）。以上結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)，低濃度茶多酚能夠促進(jìn)植物乳桿菌的生長(zhǎng)，高濃度茶多酚則抑制其生長(zhǎng)[15]。研究表明，部分乳酸菌能夠合成沒(méi)食子酸酯酶和脫羧酶，代謝相關(guān)酚類(lèi)物質(zhì)以刺激生長(zhǎng)[5]。另一方面，茶多酚對(duì)乳酸菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞器具有保護(hù)作用，能夠防止膜脂質(zhì)過(guò)氧化和保護(hù)膜流動(dòng)性[16]。

圖1 茶多酚對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)和培養(yǎng)基pH 的影響Fig.1 Effects of tea polyphenols on the growth of Lactobacillus plantarum and pH of medium

隨著茶多酚質(zhì)量濃度的增大，培養(yǎng)基的pH 值先增加后降低。如圖1 所示，茶多酚質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)基的pH 值為3.42，顯著低于空白組，這是由于低濃度茶多酚能夠促進(jìn)植物乳桿菌生長(zhǎng)導(dǎo)致產(chǎn)酸增加，從而降低pH 值。Zhang 等[6]也發(fā)現(xiàn)茶多酚有利于乳酸菌產(chǎn)生各種有機(jī)酸。

為了進(jìn)一步說(shuō)明培養(yǎng)過(guò)程中植物乳桿菌活菌數(shù)的變化趨勢(shì)，研究了茶多酚質(zhì)量濃度為0、2、4 mg/mL時(shí)菌株的生長(zhǎng)曲線。如圖2 所示，茶多酚增強(qiáng)了菌株的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)酸速度，且穩(wěn)定期的活菌數(shù)高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。因此，以上結(jié)果說(shuō)明茶多酚對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響具有濃度依賴(lài)性，即適宜質(zhì)量濃度的茶多酚促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，高質(zhì)量濃度則體現(xiàn)抑菌作用。

圖2 植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線（a）和培養(yǎng)基pH 值（b）的變化Fig.2 Changes of growth curve of Lactobacillus plantarum (a)and pH of medium (b)

2.2 發(fā)酵香腸乳酸菌數(shù)的變化

在香腸發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)一步研究了茶多酚對(duì)乳酸菌的益生作用，以探究茶多酚在實(shí)際食品生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量和安全的影響。發(fā)酵香腸的乳酸菌數(shù)如圖3 所示，接種107CFU/g 植物乳桿菌后，香腸在9 d的發(fā)酵過(guò)程中保持高水平的乳酸菌數(shù)量。自然發(fā)酵組的乳酸菌數(shù)顯著增加，從2.81 lg CFU/mL 增長(zhǎng)到3.62 lg CFU/mL，但始終顯著低于其他兩組（P＜0.05）。發(fā)酵結(jié)束后，LPTP 組的乳酸菌數(shù)顯著高于LP 組，這與Xiang 等[17]的研究一致，添加桑葚多酚的香腸在貯藏期間顯示出最高的乳酸菌數(shù)量，這可能是由于多酚可以防止食品基質(zhì)中的乳酸菌受到氧化損傷和毒性[15]。這些發(fā)現(xiàn)與上述培養(yǎng)基體系的結(jié)果一致，表明在發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過(guò)程中，茶多酚仍能對(duì)乳酸菌發(fā)揮益生作用。

圖3 茶多酚對(duì)發(fā)酵香腸乳酸菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of tea polyphenols on the number of lactic acid bacteria in fermented sausage

2.3 發(fā)酵香腸aw和pH 值的變化

水分活度對(duì)食品貯藏穩(wěn)定性有重要影響，較低的水分活度有利于發(fā)酵香腸的貨架壽命。由圖4a 可知，由于水分流失，aw在發(fā)酵期間不斷降低，從0.77 下降至0.65，但各組之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。發(fā)酵香腸的pH 值如圖4b 所示，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，CN 組的pH 值穩(wěn)定在6.05 左右，而LP 組和LPTP 組的pH 值不斷下降，最低分別為5.30 和5.42，這是由于乳酸菌在適宜條件下生長(zhǎng)繁殖，不斷分解糖類(lèi)產(chǎn)酸，導(dǎo)致pH 值的降低[9]。發(fā)酵6 d 后，LPTP 組的pH 值顯著低于LP 組（P＜0.05），說(shuō)明茶多酚可以降低發(fā)酵香腸的pH 值，這與Zhang 等[10]的發(fā)現(xiàn)類(lèi)似，含有玫瑰多酚的香腸具有較低的pH 值。較低的pH 值能抑制發(fā)酵香腸中有害微生物的生長(zhǎng)，有利于產(chǎn)品安全[18]。發(fā)酵9 d 后，LPTP 組的pH 值有所上升，可能是由于微生物或酶的作用，分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸和胺等堿性物質(zhì)，限制了pH 值降低[19]。結(jié)果表明，添加茶多酚能夠促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，降低產(chǎn)品pH 值，提高發(fā)酵香腸的安全性。

圖4 茶多酚對(duì)發(fā)酵香腸水分活度（a）和pH（b）的影響Fig.4 Effects of tea polyphenols on water activity (a) and pH (b)of fermented sausage

2.4 發(fā)酵香腸色澤和質(zhì)構(gòu)的變化

發(fā)酵過(guò)程中香腸的色澤和質(zhì)構(gòu)特性變化如表1 所示。由表1 可知，發(fā)酵過(guò)程中各組香腸的a*值不斷增加，而L*、b*值不斷降低。發(fā)酵結(jié)束后，LPTP 組的L*值和a*值分別為60.61 和3.70，均顯著高于其他兩組（P＜0.05），Nowak 等[20]也發(fā)現(xiàn)櫻桃多酚賦予發(fā)酵香腸更高的L*值和a*值，這是因?yàn)槎喾幽芤种迫庵屑〖t蛋白氧化形成棕色的高鐵肌紅蛋白，從而起到護(hù)色的作用[21]。同樣地，LPTP 組的b*值也顯著高于其他兩組，這可能是由茶多酚自身顏色屬性導(dǎo)致的。

表1 茶多酚對(duì)發(fā)酵香腸色澤和質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effects of tea polyphenols on color and texture characteristics of fermented sausage

由表1 可知，三組香腸的硬度、彈性、粘附性、內(nèi)聚性和咀嚼性在發(fā)酵過(guò)程中均不斷增加。發(fā)酵結(jié)束后，各組的彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性不存在顯著性差異（P＞0.05）。在硬度方面，各組大小順序?yàn)椋篖P＞LPTP＞CN。LP 組的硬度顯著高于CN 組，這是因?yàn)榈蚿H促使溶解的纖維蛋白聚集，形成有序的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致硬度增加[22]。然而LPTP 組的硬度顯著低于LP 組，這可能是因?yàn)槎喾涌梢酝ㄟ^(guò)與蛋白質(zhì)相互作用改變香腸的質(zhì)地[23]。

2.5 發(fā)酵香腸TBARS 值和TVB-N 值的變化

脂質(zhì)在食品中起著關(guān)鍵作用，脂質(zhì)過(guò)度氧化會(huì)產(chǎn)生不良風(fēng)味物質(zhì)，降低產(chǎn)品質(zhì)量和消費(fèi)者接受程度。TBARS 值用于評(píng)估脂質(zhì)次級(jí)氧化產(chǎn)生的醛類(lèi)物質(zhì)的數(shù)量，能夠反映脂質(zhì)氧化的程度[24]。由圖5a 可知，各組香腸的TBARS 值隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)而顯著升高（P＜0.05），發(fā)酵結(jié)束時(shí)CN 組、LP 組和LPTP 組分別為0.71、0.61 和0.49 mg/kg。在發(fā)酵過(guò)程中，自然發(fā)酵組的TBARS 值顯著高于其他兩組（P＜0.05），說(shuō)明乳酸菌能夠延緩脂肪氧化[25]。在香腸發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌可以利用過(guò)氧化氫酶或超氧化物歧化酶分解過(guò)氧化物，從而降低脂質(zhì)氧化程度[9]。此外，在發(fā)酵過(guò)程中，LPTP 組的TBARS 值始終保持最低水平，說(shuō)明茶多酚能夠增強(qiáng)發(fā)酵香腸的抗氧化性，這可能是因?yàn)椴瓒喾幽軌蚯宄杂苫万辖饘匐x子，阻斷脂質(zhì)氧化反應(yīng)鏈，從而有效抑制脂質(zhì)氧化進(jìn)程，減少氧化產(chǎn)物生成[11]。

圖5 茶多酚對(duì)發(fā)酵香腸脂質(zhì)氧化（a）和揮發(fā)性鹽基氮含量（b）的影響Fig.5 Effects of tea polyphenols on lipid oxidation (a) and the content of volatile base nitrogen (b) of fermented sausage

總揮發(fā)性鹽基氮被認(rèn)為是蛋白質(zhì)和胺類(lèi)降解的生物標(biāo)志物，是評(píng)價(jià)肉類(lèi)產(chǎn)品新鮮度和保質(zhì)期的關(guān)鍵指標(biāo)[26]。TVB-N 值越高，表明肉制品腐敗程度越高。由圖5b 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，各組的TVB-N 值均不斷增加。在發(fā)酵期間，各組TVB-N 值的順序?yàn)椋篊N＞LP＞LPTP，但各組的TVB-N 值差異不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵結(jié)束后，LPTP 組的TVB-N 值顯著低于其他兩組，這可能是由于多酚抑制香腸中腐敗微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而延緩了腐敗。

2.6 相關(guān)性分析

對(duì)發(fā)酵香腸的各項(xiàng)指標(biāo)做了相關(guān)性分析，結(jié)果如圖6 所示。發(fā)酵香腸的乳酸菌數(shù)與L*、a*、硬度呈顯著正相關(guān)，而與pH 值、TBARS 值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明乳酸菌數(shù)顯著影響香腸的色澤和脂質(zhì)氧化程度。香腸pH 值與硬度呈顯著負(fù)相關(guān)、而與TBARS 值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明pH 越低，氧化程度越輕，但硬度會(huì)有所提高。香腸色澤指標(biāo)（L*、a*、b*）與TBARS 值呈顯著負(fù)相關(guān)，表明脂質(zhì)氧化程度對(duì)香腸色澤具有重要影響，較低的氧化能賦予產(chǎn)品更好的顏色屬性。香腸彈性與內(nèi)聚性、咀嚼性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。因此，茶多酚能夠促進(jìn)香腸中乳酸菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)香腸色澤、pH、脂質(zhì)氧化和質(zhì)構(gòu)等屬性產(chǎn)生影響。

圖6 發(fā)酵香腸各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of various indicators of fermented sausage

3 結(jié)論

本文探討了不同濃度茶多酚對(duì)植物乳桿菌的影響及其對(duì)發(fā)酵香腸理化品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，在適宜的濃度下，茶多酚體現(xiàn)出對(duì)植物乳桿菌的益生作用，濃度過(guò)高則體現(xiàn)抑制作用。在生產(chǎn)發(fā)酵香腸的過(guò)程中，茶多酚仍能顯著促進(jìn)植物乳桿菌的生長(zhǎng)。此外，茶多酚有效降低了香腸發(fā)酵過(guò)程中的TBARS 值和TVB-N值，從而延緩脂肪氧化和腐敗，并在一定程度上提升了產(chǎn)品的色澤和質(zhì)量。相關(guān)性分析表明，發(fā)酵香腸的色澤、pH、質(zhì)構(gòu)和脂質(zhì)氧化等理化品質(zhì)與乳酸菌數(shù)存在一定的關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果對(duì)茶多酚在發(fā)酵肉制品中的應(yīng)用具有重要意義，后續(xù)可以進(jìn)一步探索茶多酚促進(jìn)植物乳桿菌生長(zhǎng)的詳細(xì)機(jī)制以及發(fā)酵香腸的風(fēng)味和代謝物分析，為茶多酚在發(fā)酵食品中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。