毛蚶蛋白對(duì)益生菌抗生素脅迫的保護(hù)作用

梁錚洋，周苗，陶春霖，侯傳麗，任嬌艷

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510641）

水產(chǎn)品的抗生素殘留可導(dǎo)致人體攝入后引起腸道菌群紊亂的問題。恩諾沙星是被報(bào)道在水產(chǎn)品中檢出殘留率最高的抗生素（超過11%）[1]，在局部地區(qū)檢出率高達(dá)62.5%[2]。研究表明，該抗生素可引發(fā)腸道益生菌（雙歧桿菌和乳酸桿菌）豐度下降，導(dǎo)致腸道菌群趨向抗生素耐藥化，并削弱對(duì)病原菌的定植抗性[3]，且對(duì)大鼠保護(hù)性免疫的產(chǎn)生造成損害[4]。持續(xù)低劑量攝入恩諾沙星可導(dǎo)致病原菌對(duì)喹諾酮類抗生素（恩諾沙星、環(huán)丙沙星等）的耐藥性，對(duì)人體和環(huán)境造成不可逆的影響[5]。

人攝入水產(chǎn)品抗生素殘留可對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)造成破壞，但水產(chǎn)蛋白也對(duì)腸道益生菌有一定保護(hù)作用。蛋白質(zhì)是食物重要的營養(yǎng)基質(zhì)之一，前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)及其消化道降解產(chǎn)物小分子肽等組分，對(duì)于腸道益生菌增殖及黏附具有重要促進(jìn)作用[6]。魚粉蛋白會(huì)上調(diào)小鼠盲腸中鼠李糖乳桿菌的豐度，影響腸道菌群中腐敗化合物如丁酸鹽和乳酸的產(chǎn)生[7]；鰳魚蛋白替換培養(yǎng)基中的氮源可促進(jìn)益生菌植物乳桿菌LP45 增殖，并輔助其在腸組織上黏附[6]。蛋白質(zhì)對(duì)益生菌的作用機(jī)制可能包括提供必需氨基酸，提高益生菌的抗逆能力和促進(jìn)益生菌蛋白酶、肽酶分泌的活性等[8]，這些研究表明水產(chǎn)蛋白在促進(jìn)益生菌增殖，維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有巨大的潛力。

目前研究表明，毛蚶蛋白和多肽具有良好的生物活性。Guo 等[9]發(fā)現(xiàn)毛蚶蛋白ASP-3 對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 具有較強(qiáng)的抑制作用，IC50值為(171.18±18.59) μg/mL；Chen 等[10]純化出具有抗氧化活性的多肽H3，并通過電噴霧電離質(zhì)譜儀分析出該多肽的117 個(gè)氨基酸序列；從毛蚶中鑒定出的多肽D2-G1S-1 和G2-G1S-2 在秀麗隱桿線蟲上展現(xiàn)出延緩衰老的功效，并可緩解由百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[11]。盡管對(duì)于毛蚶蛋白和多肽的生物活性已有了初步研究，其對(duì)人體腸道與益生菌的作用仍未明晰。

本研究基于恩諾沙星對(duì)四種益生菌的生長脅迫，建立了抗生素脅迫的益生菌生長模型，以紅三魚、黃蜆和毛蚶作為原料，經(jīng)過低溫超聲輔助水提取制備三種水溶性蛋白粗提物，在模型中評(píng)價(jià)水產(chǎn)蛋白改善恩諾沙星對(duì)益生菌生長脅迫效果。在此基礎(chǔ)上，對(duì)具有較高生物活性的毛蚶蛋白進(jìn)行分離純化，通過蛋白電泳分析每個(gè)組分的分子量分布，并對(duì)組分生物活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為毛蚶蛋白的生物活性研究提供了新方向。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

紅三魚、黃蜆和毛蚶樣品均從廣州黃沙水產(chǎn)市場購買，4 ℃運(yùn)輸30 min，在-20 ℃保存?？股囟髦Z沙星購買自羅恩生物（上海），其余化學(xué)試劑均為分析純。乳雙歧桿菌Probio-M8、植物乳桿菌LP45、鼠李糖乳桿菌LGG 和兩歧雙歧桿菌BBi32 來自于本實(shí)驗(yàn)室，這些益生菌均于MRS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。酵母浸膏、牛肉浸膏，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

MRS 培養(yǎng)基的配方包括酵母浸膏5 g/L、牛肉浸膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、D-葡萄糖20 g/L、吐溫80 1 mL/L、檸檬酸三銨2 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、磷酸二氫鈉2 g/L、硫酸錳0.02 g/L 和硫酸鎂0.01 g/L。其中，葡萄糖與其余物質(zhì)分開滅菌，滅菌并冷卻后，于超凈臺(tái)內(nèi)混合制成MRS 培養(yǎng)基。

依據(jù)Bradford 等[12]的方法測定樣品中的蛋白含量，樣品于超凈臺(tái)內(nèi)過膜除菌后，按目標(biāo)濃度調(diào)整樣品添加量，用若干體積樣品和無菌水將5×MRS 培養(yǎng)基稀釋至正常濃度，即完成蛋白添加組培養(yǎng)基的配制。在各組實(shí)驗(yàn)中，抗生素恩諾沙星和蛋白樣品的干預(yù)均于微生物開始生長前添加至基礎(chǔ)MRS 培養(yǎng)基。

1.3 生長曲線的測定

使用酶標(biāo)儀（Model SYNERGY H1，BioTek Instruments Co.Ltd.，Vermont，America）測定益生菌0～30 h 的生長曲線。以每孔200 μL 的量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至96 孔板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行，加完后置于酶標(biāo)儀中，以連續(xù)振板方式培養(yǎng)并設(shè)置每10 min 記錄600 nm 處的吸光值（OD600），培養(yǎng)30 h 后，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并繪制生長曲線。下文中生長曲線的吸光值數(shù)據(jù)均為原始吸光值減去空白MRS 培養(yǎng)基的吸光值。

1.4 生長代時(shí)和曲線積分的計(jì)算

按照Liu 等[6]的方法計(jì)算生長代時(shí)和曲線積分。生長代時(shí)的計(jì)算：將所測得生長曲線的OD600值進(jìn)行以自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化，按1～5 h 的時(shí)間間隔分別在生長的1～20 h 內(nèi)，進(jìn)行線性擬合，篩選其中R2＞0.8 的回歸方程。然后通過線性擬合的斜率計(jì)算生長代時(shí)，計(jì)算公式為：

式中：

g——生長代時(shí)；

k——斜率。

曲線積分的計(jì)算：首先將整個(gè)生長曲線與邏輯斯蒂方程（Logistic Equation）擬合，然后計(jì)算其積分面積。邏輯斯蒂方程如下所示：

式中：

N0——初始生物量（OD600）；

K——最大可能細(xì)菌數(shù)量（環(huán)境承載量）；

r——生長速率。

邏輯斯蒂方程將從生長曲線中擬合出K、r、N0的值。

1.5 粗蛋白的提取制備

毛蚶樣品取斧足部肌肉，紅杉魚樣品取背部肌肉，黃蜆取可食用部分作為原料樣品。如圖3a 所示，稱取20 g 水產(chǎn)原料，剪碎后與60 mL 蒸餾水混合，在豆?jié){機(jī)（九陽，中國）中勻漿2 min，在4 ℃下超聲輔助提取1 h，10 000 r/min 離心15 min，棄去沉淀，所得上清液即為樣品中提取出的水溶性蛋白。

粗蛋白得率的計(jì)算：依據(jù)Bradford 等[12]的方法測定液體樣品中的粗蛋白濃度，根據(jù)以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)得率：

式中：

Pc——粗蛋白得率，%；

C——粗蛋白樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——粗蛋白樣品體積，mL；

m——原料質(zhì)量，mg。

1.6 毛蚶蛋白的分離純化

按照Chen 等[13]的方法，稍微進(jìn)行修改，對(duì)毛蚶粗蛋白（CE）進(jìn)行層析分離。調(diào)節(jié)粗提溶液pH 值至8.0，裝入用Tris-HCl 緩沖液平衡兩個(gè)柱體積的DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱。用相同緩沖液配制的0、0.1、0.3 和2 mol/L 的氯化鈉逐步洗脫，每個(gè)濃度洗脫30 管，每管收集5 mL，流速為1 mL/min。依據(jù)Bradford 等[12]的測定每管蛋白質(zhì)含量，并以此為依據(jù)收集組分。

純化組分蛋白回收率的計(jì)算：依據(jù)Bradford 等[12]的方法測定每個(gè)試管樣品粗蛋白濃度，根據(jù)以下公式計(jì)算純化蛋白組分回收率：

式中：

Pp——純化組分蛋白回收率，%；

m1——各組分蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；

m0——粗蛋白蛋白質(zhì)量，mg。

1.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

用SDS-PAGE凝膠電泳分析毛蚶粗提物和各個(gè)組分的蛋白分子量分布情況。濃縮膠中聚丙烯酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠中聚丙烯酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。在電泳儀（Bio-Rad，美國）中以80 V 恒壓電泳至溴酚藍(lán)染色條靠近凝膠底端。電泳凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色后分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，所有值都表示為平均值。使用Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單向方差分析（ANOVA），使用Tukey 分析比較所有組之間的顯著性差異。差異在P＜0.05 時(shí)被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié)果與討論

2.1 恩諾沙星對(duì)不同益生菌的生長脅迫效應(yīng)探究

恩諾沙星能抑制DNA解旋酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV 的作用，阻止細(xì)菌的DNA 復(fù)制，起到抑菌的作用[14]。為了研究恩諾沙星對(duì)不同益生菌的生長脅迫作用，按照Wiegand 等[15]設(shè)計(jì)的方法，設(shè)置了從0.03 μg/mL 到1 024 μg/mL 的抗生素質(zhì)量濃度梯度，圖1 僅展示了能表現(xiàn)微生物生長狀態(tài)明顯差異的幾個(gè)質(zhì)量濃度。如圖1 所示，當(dāng)恩諾沙星的質(zhì)量濃度為64 μg/mL 或更高時(shí)，所有微生物的生長均受明顯抑制，相較于對(duì)照組（0 μg/mL）曲線積分顯著下降（P＜0.001），且生長代時(shí)顯著延長（P＜0.001）；而當(dāng)抗生素的質(zhì)量濃度為8 μg/mL 或更低時(shí)，四種益生菌的生長趨勢均與對(duì)照組相近，于同一時(shí)間進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期，且生長代時(shí)未見顯著變化，除Probio-M8 菌外，生長曲線積分未發(fā)生顯著變化。由此可見，當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度較高（≥64 μg/mL）或較低（≤8 μg/mL）時(shí)，四種益生菌對(duì)抗生素的反應(yīng)差異不大。

圖1 恩諾沙星對(duì)不同益生菌的生長脅迫效應(yīng)Fig.1 Growth stress effect of enrofloxacin on different probiotics

圖2 不同水產(chǎn)粗提蛋白的活性評(píng)價(jià)Fig.2 The activity of different aquatic crude extract proteins

當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度為32 μg/mL 時(shí)，BBi32 菌生長受到抑制，OD600相較對(duì)照組（1.43）降低至0.52，且曲線積分顯著降低（P＜0.005），生長代時(shí)相較于對(duì)照組略微延長，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)質(zhì)量濃度降低至16 μg/mL 時(shí)，該菌的生長代時(shí)未見顯著變化，OD600上升至0.86，曲線積分提升至9.01，但與對(duì)照組仍存在顯著差異（P＜0.05）（圖1a）。

對(duì)于LGG 菌，32 μg/mL 抗生素可明顯抑制其生長，生長延滯期延長至20 h 以上，在30 h 內(nèi)未進(jìn)入生長平臺(tái)期，生長代時(shí)相較于對(duì)照組（1.28 h）顯著延長至2.22 h；16 μg/mL 質(zhì)量濃度下，該菌的生長受到輕微抑制，吸光值達(dá)0.97，低于對(duì)照組（1.62），曲線積分和生長代時(shí)均未發(fā)生顯著變化（圖1b）。

在32 μg/mL質(zhì)量濃度下，LP45菌與LGG菌相似，生長延滯期被延長至20 h 以上，生長代時(shí)較對(duì)照組（1.52 h）被延長至2.22 h（P＜0.05），曲線積分顯著降低（P＜0.001）；當(dāng)恩諾沙星的質(zhì)量濃度降至16 μg/mL 時(shí)，該菌的曲線積分顯著降低（P＜0.005），在抗生素的影響下提前進(jìn)入生長平臺(tái)期，20 h后OD600維持在0.97，生長代時(shí)未見明顯延長（圖1c）。

對(duì)于Probio-M8 菌，在32 μg/mL 和16 μg/mL 的抗生素下生長延滯期受到不同程度的延長，吸光值均有所下降，曲線積分顯著降低，生長代時(shí)相較于對(duì)照組（0.96 h）均顯著延長（P＜0.01），分別為1.86 h 和1.43 h（圖1d）。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在這四種益生菌中乳雙歧桿菌Probio-M8 對(duì)恩諾沙星最為敏感。之前的研究中，該抗生素對(duì)數(shù)十株雙歧桿菌的最小抑菌濃度（MIC）分布在2～64 μg/mL[16]；當(dāng)抗生素的質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL 時(shí)，體外培養(yǎng)的腸道菌群中乳酸桿菌和雙歧桿菌的豐度降低[3]?？紤]到低濃度抗生素對(duì)益生菌帶來的不利影響，用Probio-M8 菌分別在16 μg/mL 和32 μg/mL 恩諾沙星脅迫的生長模型對(duì)水產(chǎn)蛋白及其組分活性進(jìn)行研究。

2.2 水產(chǎn)粗提蛋白的活性評(píng)價(jià)

紅三魚、黃蜆和毛蚶是三種常見的養(yǎng)殖水產(chǎn)品，也是人們經(jīng)常攝入的幾種水產(chǎn)品。利用Probio-M8 菌在32 μg/mL 的恩諾沙星脅迫下的生長模型對(duì)紅三魚、黃蜆和毛蚶粗提蛋白活性探究。紅三魚、黃蜆和毛蚶蛋白的粗提取得率分別為1.35%、0.27%、0.99%。如圖3 所示，對(duì)照組為Probio-M8 菌在MRS 培養(yǎng)基中正常生長，模型組為該菌在有32 μg/mL 質(zhì)量濃度恩諾沙星的MRS 培養(yǎng)基中生長，往含有該抗生素的培養(yǎng)基中分別添加0.1 g/L 和0.2 g/L 的不同水產(chǎn)蛋白對(duì)其進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)?shù)鞍滋砑恿繛?.1 g/L時(shí)，三種蛋白粗提物均可提高曲線的OD600，其中毛蚶蛋白粗提物可將生長延滯期縮短至5 h 以內(nèi)，且相較于模型組（2.48 h）顯著降低生長代時(shí)至1.49 h（P＜0.05），展現(xiàn)出更好的生物活性。當(dāng)?shù)鞍滋砑恿繛?.2 g/L 時(shí)，毛蚶蛋白仍展現(xiàn)出良好的保護(hù)效果，相對(duì)于模型組，可將生長代時(shí)縮短至1.51 h。綜合生長曲線、曲線積分及生長代時(shí)分析，三種水產(chǎn)品中毛蚶蛋白對(duì)益生菌的保護(hù)效果最優(yōu)，其生物活性在0.1～0.2 g/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖3 水產(chǎn)蛋白的提取和毛蚶蛋白的分離純化Fig.3 Extraction of aquatic proteins and isolation and purification of Arca subcrenata proteins

目前研究發(fā)現(xiàn)毛蚶蛋白的生物活性包括抗腫瘤[9]、抗氧化和金屬結(jié)合能力[17]，其對(duì)益生菌的作用仍不明晰，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛蚶蛋白可保護(hù)乳酸桿菌免受抗生素生長脅迫，具有調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)的潛在功能。

2.3 毛蚶蛋白的分離純化

毛蚶蛋白的純化結(jié)果如圖3b 所示，毛蚶蛋白粗提物在0、0.1、0.3 和2.0 mol/L 四個(gè)濃度的NaCl 通過陰離子交換柱DEAE Sepharose Fast Flow 中被洗脫出四個(gè)組分，分別為Fr0、Fr1、Fr2 和Fr3。Fr0、Fr1、Fr2、Fr3 的蛋白回收率分別為10.9%、4.03%、6.27%和1.54%。由SDS-PAGE 分析結(jié)果可知，粗提物的分子量主要分布在14.3～66.4 ku 之間，分別在35.0、23.0和14.3 ku 左右處觀察到明顯的條帶。Fr0 的蛋白分子量分布在約14.3 ku 和43.0 ku 處，F(xiàn)r1 的分子量分布于20.1～29.0 ku 之間，F(xiàn)r2 的分子量分布較廣，分布于14.3～97.2 ku，而Fr3 則集中于分布于小于14.3 ku 的范圍。其中，F(xiàn)r0 和Fr3 均在約14.3 ku 處有出現(xiàn)條帶，而僅有Fr1 組分則在約23.0 ku 和27.0 ku 處出現(xiàn)明顯條帶（圖3c）。上述結(jié)果表明，毛蚶蛋白的分離純化效果良好，能明顯區(qū)分組分之間的蛋白差異。

2.4 毛蚶蛋白組分的活性評(píng)價(jià)

將蛋白粗提物和純化得到的組分以0.1 g/L 的質(zhì)量濃度添加至含有16 μg/mL 恩諾沙星的MRS 培養(yǎng)基中，通過乳雙歧桿菌Probio-M8 在該混合培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)對(duì)組分的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。由圖4 所示，所有蛋白組分均提高了培養(yǎng)體系的OD600。與模型組相比，除Fr2 組外，其余實(shí)驗(yàn)組的曲線積分均顯著提高（P＜0.005），生長代時(shí)也均顯著下降（P＜0.001）。其中，F(xiàn)r0 可使益生菌的最大吸光值從模型組0.80 提升至1.56，提高生物量至接近對(duì)照組，相較于模型組顯著提高曲線積分（P＜0.001）。Fr3 可使Probio-M8菌的生長代時(shí)恢復(fù)至0.98 h，與對(duì)照組接近。綜合以上結(jié)果判斷，毛蚶蛋白的組分均能緩解恩諾沙星對(duì)Probio-M8 的生長脅迫，其中Fr0 可顯著提高培養(yǎng)體系中的細(xì)菌總數(shù)，F(xiàn)r3 可顯著降低益生菌的生長代時(shí)，具有良好的生物活性。

圖4 毛蚶蛋白組分的活性評(píng)價(jià)Fig.4 Activity evaluation of protein fractions of Arca subcrenata

小分子蛋白和多肽是乳酸菌生長發(fā)育所依賴的主要氮源[8]，乳酸菌需通過分泌胞外蛋白酶將酪蛋白降解為寡肽，再對(duì)其吸收并利用[18]，有研究表明，大豆蛋白和多肽均能促進(jìn)雙歧桿菌的生長和代謝，且多肽的生物活性高于蛋白[19]。從SDS-PAGE 分析的結(jié)果可知，具有更高生物活性的Fr0 和Fr3 組分中含有更多小分子蛋白和多肽。相對(duì)于大分子蛋白，益生菌對(duì)小分子蛋白和多肽具有更高利用率，這可能是該組分具有更高生物活性的原因之一。

目前研究表明，不同腸段均存在腸道微生物，不同腸段所定植菌的數(shù)量和種類有所不同，其中結(jié)腸部分所含的菌數(shù)量最多，在蛋白質(zhì)主要吸收的小腸部分也存在腸道微生物如乳酸菌和鏈球菌[20]。蛋白質(zhì)進(jìn)入人體胃腸后，大部分于胃消化在小腸吸收，仍有一些殘留蛋白質(zhì)能不被吸收而進(jìn)入到結(jié)腸，并與腸道環(huán)境發(fā)生交互[21]。

3 結(jié)論

本研究基于恩諾沙星對(duì)四種益生菌抑菌作用差異，建立了乳雙歧桿菌Probio-M8 在抗生素脅迫下的生長模型，在該模型下，毛蚶蛋白粗提物展示出保護(hù)益生菌免受抗生素生長脅迫的生物活性；毛蚶蛋白經(jīng)分離純化得到四個(gè)組分（Fr0、Fr1、Fr2 和Fr3），其中蛋白組分Fr0（14.3～43.0 ku）可將益生菌在抗生素脅迫下的OD600從0.80 提高至1.56，F(xiàn)r3（＜14.3 ku）可將Probio-M8 菌的生長代時(shí)降低至0.98 h，緩解抗生素對(duì)益生菌的生長脅迫。綜上所述，毛蚶蛋白組分可促進(jìn)乳雙歧桿菌在抗生素脅迫下增殖，表明毛蚶蛋白具有調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)的功能，本研究為水產(chǎn)蛋白對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)功能研究提供理論基礎(chǔ)。后續(xù)研究將聚焦于優(yōu)化毛蚶蛋白的提取工藝，提高活性蛋白得率，并利用生物酶水解毛蚶蛋白得到具有生物活性的多肽與寡肽，結(jié)合蛋白組學(xué)分析方法，優(yōu)化可溶性蛋白的生物活性。