刺五加苷B影響EMT進程抑制肺癌細胞遷移和侵襲的機制研究

曹雪婷，陳靜

（1. 華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點實驗室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北 唐山 063210； 2. 華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210）

刺五加，又名五加參、刺拐棒，是五加科植物的干燥根和根莖以及莖，根據(jù)中國藥典的記錄，刺五加是一種廣泛用于益氣、健脾、補腎、安神的中藥［1］，主要分布在俄羅斯以及我國東北三省、華北等地。刺五加苷B是刺五加中發(fā)揮藥用活性的主要成分，現(xiàn)在已經(jīng)被證實具有許多的藥理活性，其中就有抗疲勞、抗炎、抗腫瘤作用等［2-3］。刺五加苷B 在體內(nèi)外實驗中均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，其中包含肺癌A549 細胞、宮頸癌Hela 細胞和乳腺癌MCF-7 細胞等，但刺五加苷B 對肺癌細胞的作用機制尚不清楚，本研究初步探究了刺五加苷B 對肺癌A549 和H460 細胞遷移侵襲的影響，為刺五加苷B成為臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥品

細胞：人肺癌細胞株A549 和H460 細胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所饋贈。

刺五加苷B（美國MREDA 公司，批號：02009154），純度不小于98%。刺五加苷B 是一種有生物活性酚苷類物質(zhì)，其為白色結(jié)晶狀，用DMSO 溶液將其制備成54 mmol/L濃度的溶液，并保存于-20 ℃冰箱中。

1.2 主要儀器

超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司，ZHJH-C1214B），CO2細胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛ThermoFisher，），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS，），酶標儀（瑞士TECAN，），凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司產(chǎn)品，AlapHa ImagerTM 2200），電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 主要試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)基（以色列BiologicalIndustries公司，批號：2131212）；胎牛血清產(chǎn)品（德國Cegrogen 公司，批號：19042772）；胰蛋白酶（中國Eallbio 公司，批號：F2303）；細胞裂解液（中國碧云天生物技術(shù)公司，批號：060622220930）；10 × SDS-PAGE 電泳液、20 ×Western 快速轉(zhuǎn)模緩沖液、10 × TBST 洗滌緩沖液、4 ×分離膠mix、8 × 濃縮膠（中國莊盟生物公司，批號：2BD03LSXT1、AF08C、220H04C22）、22AB04C、21A008S）；30%Acr-Bis、ECL 顯影液（中國Report 公司，批號：A1010500、KF005）；基質(zhì)膠（中國ABW 公司，批號：20221514ZH）；MTT（東京TCI公司，批號：）。

2 方法

2.1 A549細胞和H460細胞培養(yǎng)

使用含有10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，該細胞為貼壁細胞，每隔2～3 d傳代換液。

2.2 MTT法

將處于對數(shù)生長期的肺癌A549和H460細胞以每孔6 000個細胞的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，之后吸掉上清，加入不同濃度的刺五加苷B，同時設(shè)置對照組（不加刺五加苷B，只加刺五加苷B的溶解液）和調(diào)零組（僅添加無血清的1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基），每個藥物濃度均設(shè)置3 個重復(fù)孔（包括對照組），培養(yǎng)24 h 后，吸掉上清，每個實驗孔中加入含有10%的 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清并棄掉，每孔加入150 μL DMSO，96 孔板放到微型震蕩器上充分震蕩5～10 min，570 nm 測量每孔的吸光度OD 值。計算出細胞存活率及半抑制濃度IC50值。

2.3 細胞劃痕實驗

收集處于對數(shù)生長期的肺癌A549 和H460 細胞，調(diào)整細胞密度于5 × 105個/mL的密度接種于六孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)24 h，使用100 μL移液頭管頭在單層制造劃痕，以單次流體運動在細胞單層中畫一條線。PBS緩沖液清洗1～2次被劃下的細胞，倒置顯微鏡拍攝0 h的照片。對于H460細胞加入含有15、20、25 mmol/L刺五加苷B 的無血清1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對于A549細胞加入含有15、25、35 mmol/L 刺五加苷B 的無血清1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。藥物作用24 h后在倒置顯微鏡下檢測24 h的細胞遷移，注意要拍攝與0 h位置相同的地方再次拍攝24 h的照片。使用ImageJ軟件分析。

2.4 Transwell細胞遷移侵襲實驗

用預(yù)冷的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基將基質(zhì)膠配成相應(yīng)濃度的工作膠，每個Transwell 小室孔加入100 μL 工作膠（遷移實驗此步省略），收集消化好的待處理細胞并制成細胞懸液，使H460細胞加入含有15、20、25 mmol/L刺五加苷B 的無血清1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使A549 細胞加入含有15、25、35 mmol/L 刺五加苷B 的無血清1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以每孔2 × 104個細胞的密度接種到Transwell 小室的上腔室中，下腔室中加入含有15%血清的1640 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，棄去舊培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定15 min 后，吸棄，PBS 緩沖液清洗1～2 次，用0.1%結(jié)晶紫染液室溫下對遷移侵襲細胞瞬時染色，PBS 緩沖液清洗1～2 次，棉簽輕輕擦去上腔室膜上的細胞并用倒置顯微鏡觀察遷移到上腔膜下的細胞，并拍照記錄。

2.5 Western Blot蛋白印跡法

收集經(jīng)藥物處理后的細胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒說明書提取A549 和H460 細胞總蛋白后，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。金屬浴變性后，電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育E-cadherin、Slug、Snail 抗體及顯影，以β actin 為內(nèi)參，凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的蛋白表達水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

每個實驗均獨立重復(fù)3 次及以上，結(jié)果以均數(shù) ±標準差來表示，t檢驗分析方法用于兩組間比較，單因素方差分析用于多組間比較，各組數(shù)值均應(yīng)用ImageJ和Graphpad prism 8.0 軟件統(tǒng)計學(xué)分析并繪圖，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 刺五加苷B對人肺癌細胞生長影響

用不同濃度（0、5、15、20、25、30、35、40、45 mmol/L）的刺五加苷B 作用于肺癌A549 和H460 細胞 24 h，MTT法測定刺五加苷B對人肺癌細胞生長的影響。實驗結(jié)果顯示，與0 mmol/L 組相比刺五加苷B 可明顯抑制肺癌A549 和H460 細胞的增殖，刺五加苷B 誘導(dǎo)了肺癌細胞A549 和H460 的死亡，刺五加苷B 處理組細胞存活率明顯降低，見圖1。刺五加苷B作用于肺癌細胞A549和H460的IC50值見表1。

圖1 MTT法檢測刺五加苷B對肺癌A549和H460細胞存活率的影響

表1 刺五加苷B作用 A549和H460的IC50值比較（±s）

表1 刺五加苷B作用 A549和H460的IC50值比較（±s）

細胞A549 H460 n3 3 IC50/（mmol/L）28.64 ± 0.29 22.16 ± 0.25

3.2 刺五加苷B對肺癌細胞遷移侵襲的影響

不同濃度的刺五加苷B 作用于A549 和H460 細胞2 h后，劃痕實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組劃痕面積最小，而實驗組中隨著藥物濃度的增加劃痕面積也隨之增大，說明刺五加苷B可以抑制肺癌A549和H460細胞的遷移。

Transwell 遷移的結(jié)果示，在肺癌細胞A549 和H460中隨著刺五加苷B 的濃度增加，通過Transwell小室膜孔的細胞數(shù)目減少，聯(lián)系劃痕實驗的結(jié)果可以得出，刺五加苷B 能夠抑制肺癌細胞A549 和H460 遷移。結(jié)果見圖2～5及表2～3。

圖2 A549細胞細胞劃痕實驗

圖3 H460細胞細胞劃痕實驗

圖4 Transwell細胞遷移實驗檢測刺五加苷B對A549細胞遷移的影響（×100）

圖5 Transwell細胞遷移實驗檢測刺五加苷B對H460細胞遷移的影響（×100）

表2 刺五加苷B對A549細胞遷移侵襲的影響（±s））

表2 刺五加苷B對A549細胞遷移侵襲的影響（±s））

注：與0 mmol/L組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

Transwell侵襲細胞數(shù)159.33 ± 13.96 104.33 ± 6.13***52.00 ± 6.38***37.00 ± 4.55***刺五加苷B濃度/（mmol/L）0 15 25 35 n3 3 3 3細胞遷移率/%53.03 ± 9.31 42.41 ± 4.94*30.47 ± 4.79***18.84 ± 4.13***Transwell遷移細胞數(shù)213.00 ± 20.61 150.67 ± 11.56**45.67 ± 11.95**19.67 ± 2.62**

表3 刺五加苷B對H460細胞遷移侵襲的影響（±s））

表3 刺五加苷B對H460細胞遷移侵襲的影響（±s））

注：與0 mmol/L組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

Transwell侵襲細胞數(shù)83.33 ± 7.59 57.67 ± 3.86**40.37 ± 3.09***22.00 ± 4.89***刺五加苷B濃度/（mmol/L）0 15 20 25 n3 3 3 3細胞遷移率/%71.76 ± 2.55 50.23 ± 1.88***40.46 ± 2.64***31.98 ± 1.87***Transwell遷移細胞數(shù)355.00 ± 31.32 154.00 ± 19.20***59.00 ± 4.55***33.33 ± 2.49***

為了探究刺五加苷B 對肺癌A549 和H460 細胞侵襲能力的影響，應(yīng)用Transwell 侵襲實驗進行觀察。在Transwell 小室中首先鋪上一層基質(zhì)膠，待基質(zhì)膠干至膠狀，加入細胞，與0 mmol/L 組比較，加藥組中通過小室的細胞數(shù)量呈劑量依賴性減少。結(jié)果見圖6～7。

圖6 Transwell細胞侵襲實驗檢測刺五加苷B對A549細胞侵襲的影響（×100）

圖7 Transwell細胞侵襲實驗檢測刺五加苷B對H460細胞侵襲的影響（×100）

3.3 刺五加苷B 對肺癌細胞E-cadherin、Slug、Snail蛋白表達水平的影響

EMT上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程在腫瘤的轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色。上述實驗已經(jīng)證實刺五加苷B可以抑制肺癌A549和H460細胞遷移侵襲，接下來探究刺五加苷B是否通過EMT 過程調(diào)控遷移侵襲。Western blot 表明，刺五加苷B 使E-cadherin 蛋白表達水平上調(diào)，EMT 轉(zhuǎn)錄因子也使侵襲促進因子Slug和Snail表達水平以濃度依賴的方式被抑制。結(jié)果圖8 和表4、5。因此結(jié)合劃痕實驗、Transwell 遷移侵襲實驗以及Western blot 實驗結(jié)果共同說明刺五加苷B以濃度依賴調(diào)控EMT進程抑制肺癌A549和H460細胞遷移侵襲。

圖8 蛋白質(zhì)印跡法檢測EMT相關(guān)蛋白表達情況

表4 刺五加苷B作用A549細胞EMT相關(guān)蛋白表達情況（±s））

表4 刺五加苷B作用A549細胞EMT相關(guān)蛋白表達情況（±s））

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

刺五加苷B濃度/（mmol/L）0（歸一化）Snail蛋白相對水平1.00 ± 0.00 0.83 ± 0.02**0.57 ± 0.07***0.43 ± 0.04***15 25 35 n3 3 3 3 E-cadherin蛋白相對水平1.00 ± 0.00 1.87 ± 0.21*2.48 ± 0.31**2.95 ± 0.40***Slug蛋白相對水平1.00 ± 0.00 0.81 ± 0.03*0.66 ± 0.05**0.27 ± 0.11***

表5 刺五加苷B作用H460細胞EMT相關(guān)蛋白表達情況（±s））

表5 刺五加苷B作用H460細胞EMT相關(guān)蛋白表達情況（±s））

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

刺五加苷B濃度/（mmol/L）0（歸一化）Snail蛋白相對水平1.00 ± 0.00 0.84 ± 0.05*0.77 ± 0.09**0.50 ± 0.02***15 20 25 n3 3 3 3 E-cadherin蛋白相對水平1.00 ± 0.00 2.56 ± 0.33**2.93 ± 0.28***3.24 ± 0.32***Slug蛋白相對水平1.00 ± 0.00 0.86 ± 0.05*0.69 ± 0.05***0.46 ± 0.05***

4 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的危害人類健康的一種惡性腫瘤，我國肺癌的發(fā)病率和病死率居于所有惡性腫瘤的榜首［4］，肺癌患者確診時大多都是處于肺癌晚期狀態(tài)。常用的治療肺癌的方法包括手術(shù)、化療和放療，這些治療方法會造成患者的生活質(zhì)量低下、不良反應(yīng)增多同時也給患者造成沉重負擔(dān)。中藥及其活性成分被證實具有增強機體抗腫瘤作用，降低放化療的不良毒副作用并改善患者的生活質(zhì)量，延長患者生存期［5］。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可以促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［6-7］，也能夠使腫瘤細胞獲得侵襲性［8］。EMT 最重要的標志是E-cadherin 蛋白表達降低，大量文獻報道E-cadherin蛋白表達水平降低可以促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［9-11］，E-cadherin 蛋白是跨膜糖蛋白的成員，其有維持細胞穩(wěn)固和粘連的作用，并發(fā)現(xiàn)其是通過介導(dǎo)鈣依賴性細胞間黏附的形成來發(fā)揮作用。EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs）Snail、Slug、ZEB1、Twist 等的過表達及異常激活占有重要地位［12-15］，有研究已經(jīng)報道，Snail、Slug 參與EMT 過程并調(diào)控細胞黏附蛋白，Snail通過調(diào)控組蛋白甲基化和去乙?；M一步抑制上皮基因的表達，在肝癌細胞中通過穩(wěn)定Slug 蛋白的表達可促進EMT發(fā)生［16］。

綜上所述，刺五加苷B 具有抗腫瘤作用，本研究表明刺五加苷B 明顯抑制肺癌A549 和H460 細胞生長、遷移侵襲，并發(fā)現(xiàn)其可通過影響EMT 進程發(fā)揮其藥理作用。