基于深度學(xué)習(xí)的中藥寒熱屬性預(yù)測(cè)研究

張冰冰 朱 琦 張晶新 蘆 煜 王曦廷 盧 濤

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京,102401; 2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所,北京,100010; 3 中國(guó)科學(xué)院數(shù)學(xué)與系統(tǒng)科學(xué)研究院,北京,100190)

中藥藥性理論可溯源自《素問(wèn)·至真要大論篇》“陽(yáng)勝則熱,陰勝則寒”[1]。藥性(溫、熱、寒、涼、平)是中藥藥性理論的基本內(nèi)容,是中藥臨床應(yīng)用和方劑配伍的理論依據(jù)之一?；谥兴幩幮岳碚?有學(xué)者提出將中藥藥性化從化學(xué)角度定義為能夠表征對(duì)其進(jìn)行表征的化學(xué)成分或組分[2]。其中,“中藥藥性味化學(xué)”旨在揭示中藥藥性味相關(guān)化學(xué)組分并闡明其作用于機(jī)體的靶點(diǎn)和趨勢(shì)[3-4]。竇德強(qiáng)和匡海學(xué)[2]提出藥性具有非線性加合性,其物質(zhì)基礎(chǔ)具有可拆分、可組合的特點(diǎn)。從中藥“性-構(gòu)”關(guān)系探索構(gòu)建中藥性味成分表征體系有助于為現(xiàn)代中藥藥性理論研究和科學(xué)詮釋探索一條新的思路。

隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展,中藥的成分與功效研究方法日益豐富,為揭示中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新途徑[5]。信息技術(shù)和生物網(wǎng)絡(luò)計(jì)算等交叉學(xué)科也為闡述中藥復(fù)雜調(diào)控機(jī)制提供了新方法[6-8]。魏國(guó)輝等[9]通過(guò)距離度量學(xué)習(xí)算法度量紫外圖譜的相似性,結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建符合中醫(yī)藥特色的中藥寒熱藥性預(yù)測(cè)識(shí)別模型。吳思媛等[10]應(yīng)用隨機(jī)森林方法實(shí)現(xiàn)中藥寒熱藥性分類(lèi)預(yù)測(cè)。龍偉等[11]應(yīng)用支持向量機(jī)(Support Vector Machine,SVM)于分子描述符構(gòu)建了中藥寒熱預(yù)測(cè)系統(tǒng),并提出了原子數(shù)、氫鍵受體數(shù)等5個(gè)化學(xué)描述符,用于解釋中藥寒熱藥性的化學(xué)基礎(chǔ)。此外,也有學(xué)者借助數(shù)據(jù)挖掘與機(jī)器學(xué)習(xí)方法,在化合物的大數(shù)據(jù)中,尋找藥物的潛在共性規(guī)律,對(duì)中藥及其化合物的性味歸經(jīng)等屬性進(jìn)行預(yù)測(cè)和特征分析[12]。深度學(xué)習(xí)方法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的特征提取能力,也可適用于探討大數(shù)據(jù)綜合屬性特征預(yù)測(cè)等問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 資料來(lái)源 相關(guān)數(shù)據(jù)信息來(lái)源:TCMID中藥信息數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.megabionet.org/tcmid/)、ETCM中藥信息數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)。數(shù)據(jù)處理相關(guān)工具有:Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/gp/index.html)、微生信在線平臺(tái)(https://www.bioinformatics.com.cn/)、RDKit(http://www.rdkit.org/)、DGL-LifeSci、PyTorch(v1.8.1)、Python(v3.10)、Scikit-Learn(v0.23)。

1.1.2 細(xì)胞 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心,編號(hào):1101RAT-PUMC000024。使用加入體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 藥物 根據(jù)加權(quán)分?jǐn)?shù)梯度以及上述獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)通路確定中藥化合物。所選寒性中藥化合物分別為脫水穿心蓮內(nèi)酯(Dehydroandrographolide,Deh)、野黃芩苷(Scutellarin,Scu)及常春藤皂苷元(Hederagenin,Hed)均購(gòu)自上海陶術(shù)生物科技有限公司批號(hào)分別為155731、228147和130939。

1.1.4 試劑與儀器 低糖/高糖DMEM培養(yǎng)基(批號(hào):C11875500BT)、青-鏈霉素溶液(貨號(hào):15140-122)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(貨號(hào):25200-072)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清(批號(hào):04-001-1A)、Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液(批號(hào):02-023-1A)購(gòu)自以色列Biological Industries公司;細(xì)胞增殖-毒性測(cè)試試劑盒(北京蘭博利德生物科技有限公司,貨號(hào):CK001-500T);AnaeroPack厭氧產(chǎn)氣系統(tǒng)(MGC公司,日本,型號(hào):C-1);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo科技有限公司,美國(guó),型號(hào):311);倒置顯微鏡(Nikon公司,日本,型號(hào):TE2000-U);多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek儀器有限公司,美國(guó),型號(hào):ELX800型);旋渦振蕩器(上海靳瀾儀器制造有限公司,型號(hào):JI-D);細(xì)胞培養(yǎng)皿(Coring公司,美國(guó),型號(hào):430166);96孔板(Coring公司,美國(guó),型號(hào):3599)。

1.2方法

1.2.1 數(shù)據(jù)收集與預(yù)處理 使用中藥數(shù)據(jù)庫(kù)(Traditional Chinese Medicine Integrated Database,TCMID)獲取中藥及化合物信息[13];并使用學(xué)者提出的中藥性味歸經(jīng)及中藥化合物綜合數(shù)據(jù)集構(gòu)建樣本集[12]。首先,構(gòu)建中藥化合物分子圖表征算法,將化合物SMILES表示編碼為基于分子圖論的高階矩陣。使用RDKit將化合物表示的SMILES文件格式轉(zhuǎn)換為Mol文件格式。使用RDKit與DGL計(jì)算庫(kù),計(jì)算分子的鄰接矩陣、原子特征等,并生成分子圖表示。使用RDKit,計(jì)算分子的分子指紋、分子描述符等。隨后,使用隨機(jī)函數(shù)并設(shè)置隨機(jī)數(shù)種子,將研究樣本集隨機(jī)劃分為訓(xùn)練集(80%)與測(cè)試集(20%)。

1.2.2 圖卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與機(jī)器學(xué)習(xí)模型的構(gòu)建 構(gòu)建了圖卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Graph Convolutional Network,GCN)模型用于預(yù)測(cè)中藥化合物的寒熱屬性的工作流程。見(jiàn)圖1。該流程為數(shù)據(jù)表示法使數(shù)據(jù)歸一,再進(jìn)行模型構(gòu)建。首先,形成化合物分子的原子鄰接矩陣。隨后,初始化原子特征向量。使用Numpy進(jìn)行矩陣運(yùn)算操作,生成分子的圖表征編碼?；赑yTorch深度學(xué)習(xí)框架構(gòu)建圖卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要包括初始化分子圖嵌入層(Graph Embedding)、圖卷積層(Graph Convolutional Layer)、信息讀出層(Readout Layer)及全連接預(yù)測(cè)層(Fully Connection Layer)。分子圖嵌入層以初始化分子鄰接矩陣和原子嵌入特征矩陣為輸入并進(jìn)行矩陣乘法運(yùn)算,隨后通過(guò)全連接層將分子圖嵌入信息映射為60維度的特征向量。預(yù)測(cè)層使用使用兩層全連接層,隱藏層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為256。全連接層最后使用Sigmoid函數(shù),損失函數(shù)使用torch.nn.BCELoss。模型訓(xùn)練階段,設(shè)置隨機(jī)數(shù)種子,并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)打散,將數(shù)據(jù)加載為小批次樣本,批次規(guī)模為128個(gè)樣本。初始化學(xué)習(xí)率設(shè)置為0.001,使用批標(biāo)準(zhǔn)化(Batch Normlization)和添加丟失層(Drop-out Layer)來(lái)提升模型性能并防止模型過(guò)擬合。此外,基于Scikit-Learn構(gòu)建了K-近鄰(K-Nearest Neighbour,KNN)、決策樹(shù)(Decision Tree,DT)、隨機(jī)森林(Random forest,RF)、SVM機(jī)器學(xué)習(xí)模型,作為對(duì)照模型。研究中,某一成分的寒熱屬性標(biāo)簽來(lái)源于其所屬中藥,故不同寒熱屬性的中藥,可能具有某一相同成分。因此,本研究將化合物成分的寒熱屬性預(yù)測(cè)定義為多標(biāo)簽分類(lèi)任務(wù)。

圖1 圖卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型寒熱屬性預(yù)測(cè)工作流程

1.2.4 寒熱屬性化合物生物學(xué)潛在機(jī)制探究 作為案例研究,選取典型的寒性中藥(大黃、黃芩、金銀花、地骨皮、穿心蓮)和溫?zé)嵝灾兴?附子、刺五加、厚樸、山茱萸、丁香)。并使用寒熱分子GCN預(yù)測(cè)模型對(duì)寒熱中藥的成分進(jìn)行篩選。寒(熱)分類(lèi)預(yù)測(cè)概率高于80%的定義為重點(diǎn)寒(熱)屬性化合物。設(shè)置預(yù)測(cè)概率即加權(quán)分?jǐn)?shù)0.8為閾值,使用ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)收集化合物靶點(diǎn)[15]。進(jìn)一步,整理出“寒性熱性化合物-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)對(duì),分別將寒性與熱性中藥化合物靶點(diǎn)集合作為查詢(xún)列表,使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)[16],物種設(shè)置為“H.sapiens”,設(shè)置P<0.01進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。分別選取top 20通路繪制富集氣泡,借助微生信在線平臺(tái)進(jìn)行可視化處理。

1.2.5 梯度寒性中藥成分篩選 在加權(quán)分?jǐn)?shù)閾值>0.7的基礎(chǔ)上,劃分為1.0～0.9高概率、0.9～0.8中概率和0.8～0.7低概率,3個(gè)區(qū)間確定3個(gè)寒性中藥成分。保證相鄰差值不小于0.05不大于0.15,同時(shí)確保化合物可以獲得。

1.2.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 分組與模型制備 取出PC-12細(xì)胞,重復(fù)培養(yǎng)傳代2～3次后待其鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶壁形成單層致密細(xì)胞,后胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(Ctl組),空白模型組(Mod組)和模型給藥組?？瞻讓?duì)照組用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),不施加任何處理因素;空白模型組進(jìn)行氧糖剝奪再灌注(Oxygen Glucose Deprivation/Reperfusion,OGD/R)。將長(zhǎng)勢(shì)良好的PC-12細(xì)胞更換為低糖DMEM培養(yǎng)基置于厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)中,低糖低氧培養(yǎng)16 h,后更換為高糖DMEM培養(yǎng)基,復(fù)糖復(fù)氧3 h后觀察細(xì)胞形態(tài),較造模前細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)絲狀貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞即造模成功。模型給藥組即在造模成功的基礎(chǔ)上,以3種藥物給藥濃度均為(5、25、50、100 μmol/L),孵育24 h。該組分別記為Mod+5組、Mod+25組、Mod+50組、Mod+100組。

1.2.6.2 細(xì)胞增殖與毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-12細(xì)胞,以3×103個(gè)/孔的密度接種至96孔板中,每孔100 μL細(xì)胞懸液,每組4個(gè)復(fù)孔。放至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 d后,進(jìn)行氧糖剝奪再灌注造模后給藥24 h,加入10 μL細(xì)胞增殖-毒性測(cè)試試劑,孵育90 min,于多功能酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定OD吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,組間采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥寒熱屬性分析 本研究從TCMID中共收集了中藥646味,中藥成分10 053個(gè)。中藥的寒熱屬性統(tǒng)計(jì)分析,屬于溫性中藥223個(gè)(34.5%),熱性中藥18個(gè)(2.8%),寒性中藥223個(gè)(34.5%),涼性中藥40個(gè)(6.2%),平性中藥142個(gè)(22.0%)(圖2A)。此外,對(duì)于中藥成分屬于溫性中藥成分4 011個(gè)(39.9%),熱性中藥成分412個(gè)(4.1%),寒性中藥成分3 327個(gè)(33.1%),涼性中藥成分503個(gè)(5.0%),平性中藥成分1 860個(gè)(18.5%)(圖2B)。

圖2 中藥及其成分寒熱屬性分析

2.2 模型性能評(píng)價(jià) 結(jié)果顯示,基于GCN的中藥化合物寒熱屬性預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確率為82.12%、精確率為69.19%、召回率為50.51%、F值為0.58、AUC值為0.76。與之相對(duì),RF模型在召回率為54.50%與F1值為0.60,SVM模型在精確率為69.03%。見(jiàn)表1。

表1 中藥化合物寒熱屬性預(yù)測(cè)模型性能比較

2.3 寒熱代表性成分靶點(diǎn)及通路分析 預(yù)測(cè)概率閾值為0.8時(shí),得到寒性分子靶點(diǎn)295個(gè)及熱性分子靶點(diǎn)118個(gè)。KEGG富集結(jié)果顯示,寒性化合物靶點(diǎn)相關(guān)富集通路共442條,主要富集通路:尼古丁成癮(Nicotine Addiction)、血脂與動(dòng)脈粥樣硬化(Lipid and Atherosclerosis)、安非他明成癮(Amphetamine Addiction)、類(lèi)固醇激素生物合成(Steroid Hormone Biosynthesis。見(jiàn)圖3A。熱性化合物靶點(diǎn)相關(guān)富集通路共665條主要富集通路:檸檬酸循環(huán)(Citrate Cycle)、阿爾茨海默病(Alzheimer Disease)、致病性大腸桿菌感染(Pathogenic Escherichia Coli Infection)、胰液分泌(Pancreatic Secretion)。見(jiàn)圖3B。

圖3 寒熱化合物KEGG富集通路氣泡圖

GO分析結(jié)果,寒性化合物參與的生物學(xué)過(guò)程(Biological Processes,BP)相關(guān)條目1 455條,涉及膜電位調(diào)節(jié)(Regulation of Embrane Potential)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)(Cellular Response to Organic Cyclic Compound)、單原子離子跨膜運(yùn)輸(Monoatomic Ion Transmembrane Transport);細(xì)胞組分(Cellular Components,CC)相關(guān)條目129條,涉及離子通道絡(luò)合物(Ion Channel Complex)、突觸膜(Synaptic Membrane);分子功能(Molecular Functions,MF)相關(guān)條目264條,涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(Neurotransmitter Receptor Activity)等。見(jiàn)圖4A。熱性化合物BP相關(guān)條目761條,涉及激素應(yīng)答(Response to Hormone)、三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic Acid Cycle),MF相關(guān)條目109條,涉及類(lèi)固醇結(jié)合蛋白(Steroid Binding)、氧化還原酶(Oxidoreductase Activity)。見(jiàn)圖4B。

圖4 寒熱化合物GO富集通路條形圖

2.4 梯度寒性中藥成分對(duì)低糖低氧損傷PC-12細(xì)胞的保護(hù)作用 選擇的梯度寒性中藥化合物,Deh為高概率寒性中藥化合物,Suc為中概率寒性中藥化合物,Hed為低概率寒性中藥化合物。見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組比較。見(jiàn)圖5A。Deh濃度在100 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力小于50%,顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞殺傷作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。見(jiàn)圖5B。Suc在100 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力在70%,較Deh細(xì)胞殺傷作用減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。與空白對(duì)照組比較,Hed濃度在50 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力在83%,細(xì)胞殺傷作用最弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。并且與空白模型組比較,Hed濃度在25 μmol/L時(shí),顯示出細(xì)胞保護(hù)作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。見(jiàn)圖5C。

表2 基于深度學(xué)習(xí)計(jì)算模型的典型寒性中藥化合物及加權(quán)分?jǐn)?shù)

圖5 梯度寒性中藥成分對(duì)低糖低氧損傷PC-12細(xì)胞活力的影響(n=4)

3 討論

近年來(lái),中藥寒熱藥性研究日益深入。多組學(xué)技術(shù),如基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)推動(dòng)藥性認(rèn)識(shí)由“宏觀”轉(zhuǎn)入“微觀”[17];為深入探究中藥寒熱藥性的內(nèi)在作用機(jī)制?；诨蚪M學(xué)方法,學(xué)者隋峰等[17]通過(guò)寒(熱)性中藥成分誘導(dǎo)TRPV1和TRPM8 mRNA表達(dá)調(diào)控變化,發(fā)現(xiàn)寒(熱)性中藥成分可對(duì)相反的病理變化具有逆轉(zhuǎn)作用。學(xué)者周煒煒等[19]運(yùn)用蛋白組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)寒(熱)性中藥單體成分顯著調(diào)節(jié)UCP1表達(dá)。學(xué)者陶欣等[20]觀察6種寒(熱)性中藥對(duì)小鼠脂質(zhì)和能量代謝的影響情況,探索得到寒熱屬性中藥對(duì)生物機(jī)體響應(yīng)情況。深度學(xué)習(xí)(尤其圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))在計(jì)算生物學(xué)領(lǐng)域?yàn)橛?jì)算分子的諸多屬性提供了新的可解釋性學(xué)習(xí)新途徑[21-22]。大數(shù)據(jù)與深度學(xué)習(xí)特征提取的方法,成為在化合物的大數(shù)據(jù)中尋找寒熱屬性的潛在共性規(guī)律的方法之一[23-24]。已有研究表明,中藥藥性味與相關(guān)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)之間也存在一定的關(guān)聯(lián)關(guān)系[25-26]。

本研究基于中藥藥性“性-構(gòu)”學(xué)說(shuō),應(yīng)用圖卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)了中藥化合物分子的寒熱屬性預(yù)測(cè)。模型實(shí)現(xiàn)了中藥化合物的分子圖嵌入編碼,以表征化合物和中藥的計(jì)算編碼,其可以從中藥化合物寒熱屬性中,學(xué)習(xí)同一藥性化合物所表達(dá)的共性向量權(quán)重規(guī)律。GCN與傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)模型比較仍在模型性能上仍具有一定的差異,綜合各個(gè)指標(biāo)表現(xiàn)較優(yōu)。構(gòu)建中藥化合物分子表征與屬性計(jì)算模型,可為觀察組分化合物配伍的性味歸經(jīng)屬性預(yù)測(cè)提供借鑒。

其次,本研究基于中藥化合物結(jié)構(gòu)以中藥寒熱屬性角度預(yù)測(cè)進(jìn)行了“性-構(gòu)-效”富集分析,發(fā)現(xiàn)寒性中藥成分在成癮性戒斷相關(guān)通路富集效果顯著。有研究表明,苦菜(性寒涼)可通過(guò)改變神經(jīng)遞質(zhì)含量改善尼古丁戒斷癥狀[27]。據(jù)此可推斷寒性中藥的戒斷作用可能與寒性成分結(jié)構(gòu)相關(guān)。以此作為案例分析,為中藥寒熱藥性作用機(jī)制研究提供新的方向。許多疾病機(jī)制研究中藥物作用首先是基于藥物對(duì)細(xì)胞增殖與毒性的檢驗(yàn)。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),脫水穿心蓮內(nèi)酯是性寒中藥穿心蓮提取物的有效成分之一,主要為抗菌消炎等活性,其如中醫(yī)學(xué)中清熱解毒[28]。常春藤皂苷元廣泛分布于性溫的威靈仙和性寒的金銀花等藥用植物中[29]。已有研究表明,其可通過(guò)降低三酰甘油的含量來(lái)保護(hù)細(xì)胞正常生理活動(dòng)[30]。而三酰甘油的降低與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)[31]。通過(guò)單味中藥探究藥物對(duì)人體寒熱變化機(jī)制復(fù)雜,且仍不明晰。因此可以通過(guò)中藥成分寒熱屬性加權(quán)的角度,來(lái)進(jìn)一步探究明晰寒熱屬性程度不同的中藥對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制,本研究初步發(fā)現(xiàn)中藥成分寒性概率值越小即寒性程度越低對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用越顯著。

本研究鑒于當(dāng)前模型專(zhuān)注于化合物結(jié)構(gòu)拓?fù)湫畔?后續(xù)可采用更為豐富的生物活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)等信息,以拓展中藥化合物表征生物信息的豐度,從而提升計(jì)算模型的準(zhǔn)確性和生物機(jī)制解釋性。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)潛在生物信息提供了新的助力。

利益沖突聲明:無(wú)。