線粒體功能障礙導(dǎo)致白癜風(fēng)的機(jī)制: 基于生物信息學(xué)方法

張佳林, 陳逴凡, 徐英萍, 史曉蔚, 王天晶, 任盈盈, 羅光浦

南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院,廣東 廣州 510091

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性皮膚病,臨床表現(xiàn)為皮膚、黏膜等部位黑色素細(xì)胞的選擇性丟失致皮膚、粘膜失去顏色,變成白斑,世界范圍內(nèi)發(fā)病率為0.1%～2%[1]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確,可能與免疫功能紊亂、氧化應(yīng)激損傷、黑色素細(xì)胞功能異常、線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷、miRNA異常表達(dá)等相關(guān),治療及預(yù)防復(fù)發(fā)較困難[2]。目前白癜風(fēng)的治療仍以局部/系統(tǒng)使用免疫抑制劑和光療為主。而隨著對其發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入,外用或口服JAK抑制劑開始應(yīng)用于治療白癜風(fēng),但療效不一,因此尚未能成為治療的首選藥物[3]。

線粒體功能障礙被認(rèn)為是白癜風(fēng)失去氧化還原穩(wěn)態(tài)(高自發(fā)活性氧產(chǎn)生和缺乏抗氧化網(wǎng)絡(luò))的關(guān)鍵。黑色素細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中功能失調(diào)的線粒體對于誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞凋亡具有重要意義。研究證明氧化應(yīng)激在減少線粒體產(chǎn)生ATP的同時,可顯著抑制黑色素細(xì)胞的遷移能力,說明黑色素細(xì)胞的遷移與線粒體功能息息相關(guān)[4]。線粒體功能障礙會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基的堆積,可能會導(dǎo)致白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死,致使白癜風(fēng)發(fā)病[2]。線粒體—黑素細(xì)胞的相互作用可能是白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。因此,從分子層面尋找線粒體功能障礙導(dǎo)致白癜風(fēng)的機(jī)制具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究基于生物信息學(xué)方法,探討線粒體功能障礙導(dǎo)致白癜風(fēng)的機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 獲取白癜風(fēng)—線粒體功能障礙基因集

從以下開源數(shù)據(jù)庫獲取白癜風(fēng)相關(guān)的靶基因:CTD(http://ctdbase.org/),GeneCards(https://www.genecards.org/),OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org), NCBI Gene(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),取并集。截止至2022年7月1日,MITOMAP人類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫收錄了56 910份人類線粒體的全長序列數(shù)據(jù)和接近1.9萬個變異基因位點(diǎn),且列舉了可能有致病性的變異位點(diǎn)相關(guān)的臨床表型,是線粒體疾病測序最常用的數(shù)據(jù)庫之一。本研究從MITOMAP數(shù)據(jù)庫(https://mitomap.org/MITOMAP)下載線粒體功能障礙的相關(guān)基因。使用維恩圖工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)和Microsoft Excel進(jìn)一步獲得白癜風(fēng)與線粒體功能障礙之間的交集基因。

1.2 構(gòu)建蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)

PPI網(wǎng)絡(luò)有助于更好地了解靶基因在蛋白質(zhì)水平上涉及的生物學(xué)機(jī)制,使用STRING 11.5數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),物種設(shè)置為“Human”,置信度評分設(shè)置為>0.4[5]。使用Cytoscape 3.9.1軟件(https://cytoscape.org/) 對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析和可視化,使用Cytoscape軟件的網(wǎng)絡(luò)分析器插件cytoHubba計算靶點(diǎn)度值 (degree),degree排列前10 的作為核心基因。

1.3 交集基因的GO和通路富集分析

為了解白癜風(fēng)和線粒體功能障礙中共同基因的功能特征,通過g:Profiler (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)對交集基因進(jìn)行GO富集分析,物種設(shè)置為“Human”,adjustP<0.05的GO條目被認(rèn)為具有顯著性的富集意義;采用Metascape數(shù)據(jù)庫(http://www.metascape.org/)對交集基因進(jìn)行通路富集分析,參數(shù)設(shè)置為“H species”。

1.4 TF-基因和miRNA-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

TF是可以與特定DNA序列結(jié)合并調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白質(zhì),介導(dǎo)mRNA降解或翻譯抑制的miRNA是一類內(nèi)源性短非編碼RNA。采用NetworkAnalyst 3.0(https://www.networkanalyst.ca/)對核心基因構(gòu)建TF-基因和miRNA-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并使用Cytoscape 3.9.1軟件對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.5 候選藥物的預(yù)測

使用Toppgene數(shù)據(jù)庫(https://toppgene.cchmc.org/help/help.jsp)預(yù)測靶向核心基因的潛在藥物。Toppgene數(shù)據(jù)庫的藥物數(shù)據(jù)來源于DrugBank、STITCH、 CTD和Broad Institute CMAP Down 4個數(shù)據(jù)庫。候選藥物按照P從小到大排序,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白癜風(fēng)—線粒體功能障礙數(shù)據(jù)集

分別從CTD/OMIM/GeneCards/NCBI Gene數(shù)據(jù)庫收集到了9 995、30、1 252、242個白癜風(fēng)靶基因,通過合并和去除重復(fù)項后得到10 606個白癜風(fēng)靶基因(圖1A)。從MITOMAP數(shù)據(jù)庫下載參與線粒體疾病中的結(jié)構(gòu)核基因及非結(jié)構(gòu)核基因,總共159個相關(guān)基因,其中12個基因收錄了別稱。通過在兩組基因中取交集,獲得90個白癜風(fēng)—線粒體功能障礙的交集基因(圖1B)。

圖1 白癜風(fēng)與線粒體功能障礙共同基因的篩選 1A:白癜風(fēng)的相關(guān)基因并集圖;1B:白癜風(fēng)基因與線粒體功能障礙基因的韋恩圖

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將90個共同基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),并使用 Cytoscape進(jìn)行可視化處理,PPI網(wǎng)絡(luò)由90個節(jié)點(diǎn)和1 027條邊緣組成(圖2)。使用cytoHubba插件列出degree值排前10的核心基因,共13個核心基因(其中4個基因并列第10),分別為COX10、NDUFS3、NDUFA9、SURF1、NDUFV1、BCS1L、NDUFS1、NDUFS8、COX15、NDUFS7、NDUFS4、NDUFS2和LRPPRC。

圖2 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖(紅色的節(jié)點(diǎn)代表核心基因,淡黃色的節(jié)點(diǎn)代表非核心的共同基因,線代表互相作用的關(guān)系)

2.3 基因本體和通路富集分析

以GO數(shù)據(jù)庫為注釋源,分為三類富集條目,包括生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cellular components,CC)和分子功能(molecular function,MF)。結(jié)果顯示BP主要富集在線粒體呼吸鏈復(fù)合體組裝等; CC主要富集在線粒體;MF主要富集在為氧化還原驅(qū)動的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、氧化還原酶活性等(圖3)。通過Metascape數(shù)據(jù)庫得到通路富集結(jié)果(圖4),其中富集度較高的通路包括呼吸電子傳輸、線粒體tRNA氨基化、細(xì)胞色素復(fù)合物組裝、線粒體復(fù)合體Ⅳ組裝、泛醌生物合成過程、線粒體翻譯的調(diào)節(jié)、呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ(中間Ⅴ/380kD和Ⅵ/480kD),活性氧物種代謝過程等。

圖3 GO功能富集分析結(jié)果圖

圖4 KEGG富集分析結(jié)果圖

2.4 TF-基因和miRNA-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

TF-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)由 82個節(jié)點(diǎn)和99條邊組成,呈現(xiàn)了5個核心基因和TF的相互作用(圖5A)。其中,SURF1受40個TF調(diào)控,LRPPRC受19個TF調(diào)控,NDUFS1受21個TF調(diào)控,NDUFS4受12個TF調(diào)控,NDUFA9受7個TF調(diào)控。TF-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中轉(zhuǎn)錄因子ATF1、KDM5A的度值均為4。KDM5B、PHF8、SAP30的度值均為3。miRNA-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包括77個節(jié)點(diǎn)和75條邊,由4個基因和73個miRNA組成(圖5B)。其中,hsa-mir-1-3p、hsa-mir-16-5p的度值均為2。

圖5 TF-基因和miRNA-基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(紅色的節(jié)點(diǎn)代表基因,藍(lán)色的節(jié)點(diǎn)代表TF或miRNA) 5A:TF-基因互作圖;5B:miRNA-基因互作圖

2.5 候選藥物的預(yù)測

預(yù)測藥物根據(jù)P值取排名前20的藥物(表1),結(jié)果表明thiamine triphosphate(三磷酸硫胺)、Benit(貝尼特)、Isoniazid(異煙肼)、acetoacetate(乙酸乙酯)、thiamine pyrophosphate(焦磷酸硫胺)、Bioquinon(生物醌)、beta-hydroxybutyrate(β-羥基丁酸)、lipoic acid(硫辛酸)、Phosphoryl(磷酰)、pyruvic acid(丙酮酸)、ubiquinols(還原型輔酶Q10)、lactate(乳酸)、NADH、riboflavin 5’-phosphate(核黃素5’-磷酸)、AC1L1AN5、AC1L3O4T、phencarol(苯酚)、PQQ Cofactor(PQQ輔因子)、Dexon、reduced diphosphopyridine nucleotide(還原二磷吡啶核苷酸)可能是治療白癜風(fēng)的藥物。

表1 靶向核心基因的預(yù)測藥物

3 討論

研究表明,線粒體功能障礙可能是導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的原因之一,在白癜風(fēng)的發(fā)病中起重要作用[2]。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)得到90個白癜風(fēng)和線粒體功能障礙的相關(guān)基因。為保留表達(dá)更多的基因信息,本研究將90個共同基因進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果提示線粒體呼吸鏈復(fù)合體組裝是白癜風(fēng)和線粒體功能障礙共同參與的關(guān)鍵生理過程,KEGG富集分析提示呼吸電子傳輸是重要的分子作用通路,線粒體呼吸鏈在其中起關(guān)鍵作用。線粒體呼吸鏈由4個多蛋白的復(fù)合物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)及泛醌(輔酶Q)和細(xì)胞色素C等組成,其氧化磷酸化過程為機(jī)體提供95%以上的能量供應(yīng),同時消耗大量的氧氣。呼吸鏈中ROS的產(chǎn)生最主要部位是復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ,且貫穿呼吸運(yùn)動的整個過程[6]。既往研究表明,在病理狀態(tài)下細(xì)胞呼吸頻率增加時,呼吸鏈效率降低,進(jìn)而使細(xì)胞色素含量降低,影響細(xì)胞呼吸的適應(yīng)性,使其更容易氧化過激,使細(xì)胞內(nèi)ROS增多[7]。蓄積的大量ROS會對線粒體DNA、呼吸鏈復(fù)合酶和脂質(zhì)等造成損傷[8],進(jìn)一步影響線粒體的功能,產(chǎn)生更多的ROS,形成惡性循環(huán)。ROS的過度蓄積可以導(dǎo)致細(xì)胞膜過氧化,線粒體膜電位降低導(dǎo)致白癜風(fēng)表皮中黑素細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生空泡化及凋亡[9],促使白癜風(fēng)的進(jìn)展。此外,氧化應(yīng)激可致黑素細(xì)胞的遷移能力減弱,使白癜風(fēng)的復(fù)色難度增加。

本研究得到白癜風(fēng)和線粒體功能障礙的13個核心基因,并預(yù)測出其相互作用的TF與miRNA,其中NDUFA9、SURF1、NDUFS1、NDUFS4和LRPPRC也是預(yù)測出的排名前列藥物的靶點(diǎn),提示上述5個基因在白癜風(fēng)發(fā)病中的關(guān)鍵作用。NDUFA9的突變可影響線粒體復(fù)合物Ⅰ的組裝[10];SURF1編碼的蛋白對維持人線粒體電子呼吸鏈中細(xì)胞色素C氧化酶(COX)的抗氧化劑穩(wěn)定性具有重要作用[11];NDUFS1的突變可導(dǎo)致其所編碼的呼吸鏈蛋白復(fù)合物Ⅰ的穩(wěn)定性降低,并破壞復(fù)合物Ⅰ中兩個鐵硫簇之間的電子轉(zhuǎn)移[12];LRPPRC編碼蛋白的缺失不僅會降低線粒體mRNA的穩(wěn)定性,還會導(dǎo)致mRNA多腺苷酸化的喪失和線粒體翻譯異常的出現(xiàn)[13];NDUFS4為線粒體疾病明確的致病基因,NDUFS4突變可導(dǎo)致NDUFS4蛋白缺乏,致使線粒體內(nèi)膜上的鐵硫蛋白變形,影響復(fù)合物Ⅰ的裝配和激活,降低復(fù)合物Ⅰ的穩(wěn)定性[14-15]。NDUFS4的表達(dá)缺失可導(dǎo)致線粒體的形態(tài)異常及活性氧水平增加,影響線粒體功能[16]。因此,5個關(guān)鍵基因在線粒體發(fā)揮正常功能中均起到關(guān)鍵作用。研究表明,線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的含量下降,使ROS產(chǎn)生增加,破壞了黑素細(xì)胞核DNA,導(dǎo)致大量促炎因子及抗黑色素合成細(xì)胞因子釋放,刺激機(jī)體發(fā)生自身免疫反應(yīng),參與白癜風(fēng)的發(fā)生[17]。但這5個基因與白癜風(fēng)目前尚無直接研究,未來可成為白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制研究的新方向。

本研究構(gòu)建了miRNA-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果提示hsa-mir-1-3p、hsa-mir-493-3p、hsa-mir-16-5p等可能發(fā)揮重要作用。miR-1是一種單鏈非編碼RNA,作為微調(diào)因子在凋亡過程的調(diào)節(jié)中起著重要作用。miR-1表達(dá)的缺乏可通過線粒體細(xì)胞凋亡途徑,影響神經(jīng)嵴和顱面骨骼的發(fā)育,導(dǎo)致黑色素細(xì)胞發(fā)育缺陷[18]。Mansuri等[19]通過測定白癜風(fēng)患者和對照組全血miRNA表達(dá)譜分析,表明miR-1可能作為白癜風(fēng)的潛在生物標(biāo)志物。而作為節(jié)段型白癜風(fēng)患者的候選生物標(biāo)志物,miR-493-3p在循環(huán)外泌體和皮損周圍皮膚中的表達(dá)增加,導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞中多巴胺的分泌增加,ROS和黑色素細(xì)胞凋亡顯著增加,可能是節(jié)段型白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[20]。此外, miR-493過表達(dá)可導(dǎo)致AKT2蛋白表達(dá)減少,影響PI3激酶-AKT通路中涉及的蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致線粒體電位喪失和細(xì)胞色素C釋放,促使細(xì)胞凋亡[21]。miR-1、miR-493均在白癜風(fēng)和線粒體功能障礙的發(fā)病中至關(guān)重要,可能是今后研究的重要方向或藥物潛在靶點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄因子是可以與特定DNA序列結(jié)合并調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白質(zhì),對保證目的基因表達(dá)的強(qiáng)度、時間性和空間性有重要作用。本研究構(gòu)建的TF-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)ATF1、KDM5A、KDM5B等轉(zhuǎn)錄因子度值較高。其中ATF1可能通過對NADPH氧化酶中催化亞基NOX1的誘導(dǎo),影響線粒體呼吸鏈,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的增加[22]。KDM5A、KDM5B均屬于組蛋白去甲基化酶,是KDM5 4種亞型中的2種,參與表觀遺傳調(diào)控過程。實(shí)驗(yàn)證明KDM5B可能通過調(diào)節(jié)SIRT3,影響線粒體葡萄糖和脂質(zhì)的代謝,導(dǎo)致線粒體代謝功能障礙和ROS過度產(chǎn)生促進(jìn)[23]。因此ATF1、KDM5可能是白癜風(fēng)治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究預(yù)測得到三磷酸硫胺素、Benit、異煙肼、乙酰乙酸鹽、焦磷酸硫胺鹽、生物醌、β-羥基丁酸酯、硫辛酸、磷酸、丙酮酸、輔酶Q10等為白癜風(fēng)治療的候選藥物,其中硫辛酸、輔酶Q10均是抗氧化劑。有研究在白癜風(fēng)患者接受窄譜紫外線(NB-UVB)治療期間,加用含有α-硫辛酸的抗氧化劑,發(fā)現(xiàn)患者的過氧化氫酶活性和活性氧生成量明顯降低,且治療成功率提高,說明聯(lián)合口服含有α-硫辛酸的抗氧化劑可顯著提高NB-UVB的臨床有效性,減少氧化應(yīng)激[24]。臨床觀察發(fā)現(xiàn),口服硫辛酸聯(lián)合倍他米松注射液和NB-UVB治療進(jìn)展期的非節(jié)段型白癜風(fēng)安全有效,推測硫辛酸可以加速色素沉著的初始反應(yīng)[25-26]。Passi 等[27]證明在白癜風(fēng)患者中,輔酶Q10的含量明顯下降。輔酶Q10除了在線粒體中作為電子和質(zhì)子載體的功能外,還以其還原形式作為一種強(qiáng)大的抗氧化劑,阻止生物膜中脂質(zhì)過氧化反應(yīng),是重要的抗氧化劑和非特異性免疫增強(qiáng)劑。目前輔酶Q10作為口服抗氧化的藥物,尚未有隨機(jī)對照研究證實(shí)其治療白癜風(fēng)的有效性,今后可能成為新的白癜風(fēng)治療藥物。

綜上所述,本研究通過生物信息學(xué)方法篩選得到90個白癜風(fēng)和線粒體功能障礙的共同致病基因,主要參與的關(guān)鍵生理過程是呼吸鏈復(fù)合體組裝,分子作用通路是呼吸電子傳輸,同時還得到miR-1等相關(guān)的miRNA和ATF1、KDM5等相關(guān)的TF,預(yù)測硫辛酸、輔酶Q10等為白癜風(fēng)治療的候選藥物,較完整地分析了線粒體功能障礙在白癜風(fēng)發(fā)病中的可能作用,發(fā)掘了潛在的治療靶點(diǎn),為白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的闡明和藥物治療提供新的視角。但本研究數(shù)據(jù)均來源于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫信息,仍需完善相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。