DNA甲基化在紫外線相關(guān)皮膚病中的研究進(jìn)展

陳雯婷, 鐘欣妮, 李巍

蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院,江蘇 蘇州 215025

DNA甲基化于1925年首次在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn),此后的100年間,DNA甲基化蓬勃發(fā)展,研究逐漸發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于生物界,且大多在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要抑制作用[1]。隨著甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展,越來越多的差異甲基化位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。研究表明,DNA甲基化與腫瘤、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病如阿爾茨海默癥的發(fā)生息息相關(guān)[2]。皮膚是人體對抗外界環(huán)境的第一道防御屏障,許多皮膚病的發(fā)生與環(huán)境有關(guān),如空氣污染、吸煙、紫外線輻射等。其中紫外線輻射是參與DNA甲基化的重要一環(huán),許多光源性皮膚病的發(fā)生均與其有關(guān)。本文對DNA甲基化在紫外線相關(guān)皮膚病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為光源性皮膚病的研究提供新思路。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是真核生物在染色體水平控制基因表達(dá)的重要機(jī)制,是指S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體,在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的催化下,將甲基(CH3-)轉(zhuǎn)移到DNA雙鏈胞嘧啶的第5個(gè)碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶(5-mc)[3]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi),DNA甲基化大多發(fā)生在二核苷酸殘基上,而非甲基化CG常在基因組中成簇分布,這些長度約300～3 000 bp且CG含量高達(dá)60%的區(qū)域,就稱為CpG島(CpG islands,CGIs)。約60%人類基因啟動(dòng)子含有CpG島,約6%的啟動(dòng)子在早期分化過程中發(fā)生甲基化。然而,CpG島并不是發(fā)生DNA甲基化的唯一區(qū)域,其也可能發(fā)生在CpG島岸即靠近CpG島的低密度區(qū)域,常與轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)。已有文獻(xiàn)表明基因編碼區(qū)的DNA甲基化能防止異常轉(zhuǎn)錄事件,以保證mRNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的保真性[4]。自1992年起亞硫酸氫鹽測序技術(shù)逐步成為甲基化定量及定位的金標(biāo)準(zhǔn)[1],DNA甲基化研究進(jìn)入了全基因組譜的時(shí)代,越來越多的疾病與DNA甲基化有關(guān)的假設(shè)被提出并證實(shí),如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、代謝性疾病、心血管系統(tǒng)疾病等[5],在皮膚病領(lǐng)域,DNA甲基化也屢見不鮮。

2 DNA甲基化與紫外線相關(guān)皮膚病

2.1 皮膚光老化

皮膚老化由遺傳因素和環(huán)境因素共同決定,遺傳因素所致的老化稱為時(shí)間老化或固有老化,而環(huán)境因素主要是紫外線輻射所致的老化,稱為光老化,常集中于曝光部位。皮膚老化的外觀常表現(xiàn)為皮膚松弛、皺紋、干燥、粗糙、毛細(xì)血管擴(kuò)張等,此外,色素改變?nèi)琰S褐斑、雀斑、炎癥后色素沉著等亦與光老化密切相關(guān),同時(shí)可伴有多種良惡性腫瘤的發(fā)生。

近年來,甲基化在光老化中的研究越來越深入。多個(gè)證據(jù)表明,受到紫外線暴露后,DNA甲基化整體是缺失的。有研究在UVA誘導(dǎo)人體成纖維細(xì)胞光老化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),UVA照射后的成纖維細(xì)胞與空白對照組相比,全基因組甲基化水平(A450值)顯著降低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=97.402,P<0.01)[6]。Vandiver等[7]通過全基因組亞硫酸氫鹽測序,比較青年組(<35歲)和老年組(>60歲)防曬和暴露部位全層皮膚甲基化變化,發(fā)現(xiàn)在老年組暴露部位224個(gè)甲基化組塊中,有185個(gè)組塊存在甲基化缺失,缺失程度5%～23%不等,與青年組防曬部位相比,平均低9%,且低甲基化程度與光老化相關(guān)臨床指標(biāo)如Griffiths制定的光損傷臨床分級高度相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R2=0.61,P<0.001)。

隨著研究的深入,多個(gè)特異性甲基化指標(biāo)逐步被證實(shí),如單個(gè)CpG島或部位甲基化位點(diǎn)的變化。多個(gè)體外實(shí)驗(yàn)表明,紫外線照射能夠提高P16、RASSF1A等腫瘤抑制基因啟動(dòng)子甲基化,其轉(zhuǎn)錄受到抑制[8-9]。WNT1是在細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮重要作用的基因,研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)UVB照射后,WNT啟動(dòng)子低甲基化,其mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)呈UVB劑量依賴性增加,表明P16、RASSF1A、WNT1均是光老化生物學(xué)指標(biāo)[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中亦有UV所致的甲基化變化,Yang等[11]用60 J/cm2的UVB每周2次,持續(xù)25周照射SKH-1無毛小鼠,構(gòu)建光老化動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)在Slco5a1、Ogfrl1、Bend6、Mgat4a、Creg2等基因存在高甲基化,在Npbwr1、Plekhb2、Klf7、Mgat5、Ube2t、Phlda3等基因存在甲基化缺失。然而人體樣本研究開展較少, 2015年巴西一項(xiàng)人體實(shí)驗(yàn)檢測前臂內(nèi)側(cè)和外側(cè)皮膚表皮和真皮,預(yù)測可能參與甲基化的MMP9、miR-137、KRT14及19均未見甲基化改變[12]。之后用相同方法檢測miR-9-1、miR-9-3和MTHFR也未見甲基化改變[13]。

此外,有學(xué)者利用表觀遺傳時(shí)鐘通過相關(guān)CpG島減少的甲基化水平,可計(jì)算出給定樣本生物學(xué)年齡的年齡預(yù)測模型。經(jīng)典的Horvath表觀遺傳時(shí)鐘[14]基于Illumina27K或Illumina450K芯片獲得的7 844例非腫瘤樣本的甲基化數(shù)據(jù),對泛組織泛細(xì)胞的DNA甲基化水平進(jìn)行評估,可以較準(zhǔn)確地預(yù)測甲基化年齡。近年來針對成纖維細(xì)胞的表觀遺傳時(shí)鐘逐漸被開發(fā)[15],可以靈敏而準(zhǔn)確地跟蹤離體成纖維細(xì)胞的動(dòng)態(tài)老化,有助于體外老化模型的定量研究和開展光老化等衰老相關(guān)疾病的因果關(guān)系研究。

2.2 日光性皮炎

日光性皮炎又稱日曬傷、曬斑,是指強(qiáng)烈日光(主要是UVB)照射后引起的皮膚急性炎癥反應(yīng)。Tilburg等[16]發(fā)現(xiàn)UVA照射48 h內(nèi),體外成纖維細(xì)胞454 543個(gè)CpG位點(diǎn)中,有248個(gè)差異甲基化,其中2/3甲基化丟失,且主要與IGFIR、FOXO1、RPTOR等細(xì)胞衰老基因有關(guān)。而UVA照射后1周,有162個(gè)位點(diǎn)差異甲基化,其中116個(gè)位點(diǎn)高甲基化,與PAX2、FOXG1、DELTA1、NOTCH4等參與細(xì)胞生長發(fā)育、防御的基因有關(guān)。表明皮膚受紫外線輻射后,DNA甲基化是持續(xù)波動(dòng)的,在光損傷急性反應(yīng)中,衰老相關(guān)基因低甲基化,可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的表達(dá)。

2.3 光化性角化病

光化性角化病(actinic keratosis,AK)又名日光性角化病,主要是長期受紫外線輻射而引起的一種光線性皮膚病,被認(rèn)為是皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)的癌前病變。有研究通過850K芯片技術(shù)比較正常、AK及cSCC人群皮損,發(fā)現(xiàn)AK和cSCC表現(xiàn)出相似的異常甲基化模式,且AK樣本已表現(xiàn)出趨向cSCC樣本的特征,即高甲基化的CpG島及低甲基化的層相關(guān)結(jié)構(gòu)域(lamina-associated domains,LADs),表明甲基化參與光化性角化病的發(fā)生,且從表觀遺傳層面上證實(shí)光化性角化病是皮膚鱗狀細(xì)胞的癌前病變[17]。進(jìn)一步研究分析關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)調(diào)節(jié)閾中甲基化譜的區(qū)別,西班牙一項(xiàng)研究[18]表明AK/cSCC具有雙源細(xì)胞起源模型,且表現(xiàn)出不同的臨床特征,如表皮干細(xì)胞樣起源的AK/cSCC具有更強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移性,而角質(zhì)形成細(xì)胞樣起源的AK/cSCC預(yù)后則更好。用差異DNA甲基化譜鑒別細(xì)胞起源,將有助于對腫瘤患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估,為進(jìn)行下一步精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

2.4 皮膚腫瘤

2.4.1 皮膚鱗狀細(xì)胞癌 皮膚組織起源于外胚葉及中胚葉,組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜,發(fā)生皮膚腫瘤的種類繁多,其中鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、黑色素瘤占國內(nèi)皮膚惡性腫瘤的絕大多數(shù)[19-20]。cSCC又稱表皮樣癌,簡稱“鱗癌”,常發(fā)生于AK等癌前疾病的基礎(chǔ)上,或由各種癌前期疾病演變而來,與紫外線輻射有明顯相關(guān)性。

惡性腫瘤表觀遺傳學(xué)中的共性特征之一是抑癌基因或潛在的抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)沉默,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生,cSCC也不例外。AKAP12是AKAP蛋白激酶家族的一員,其功能是將蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和細(xì)胞周期素錨定在質(zhì)膜上。在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均被檢測到AKAP12缺失,且其缺失被認(rèn)為與啟動(dòng)子超甲基化有關(guān)。Wu等[21]發(fā)現(xiàn),在sSCC樣本中,AKAP12啟動(dòng)子區(qū)CpG島也存在超甲基化,其mRNA及蛋白質(zhì)低表達(dá)。對AKAP12更深入的研究發(fā)現(xiàn),其表達(dá)與貝伐珠單抗等抗VRGF治療相關(guān)腫瘤的敏感度呈負(fù)相關(guān)[22]。p16INK4a、p14ARF、CDH1、RB1、MGMT、RASSF1、ID4、FLIP1L等參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、上皮細(xì)胞粘連與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因啟動(dòng)子CpG島甲基化也會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄沉默[23-25]。進(jìn)一步明確上述基因與cSCC的關(guān)系,用甲基化抑制劑或去甲基化酶穩(wěn)定表達(dá),將有助于探索皮膚腫瘤的新型治療靶點(diǎn)。

此外,其他相關(guān)基因啟動(dòng)子低甲基化也參與cSCC的發(fā)生。DSS1是參與DNA雙鏈斷裂錯(cuò)配修復(fù)的基因,當(dāng)DNA雙鏈斷裂錯(cuò)配時(shí),會(huì)導(dǎo)致染色體易位促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。Venza等[26]發(fā)現(xiàn)cSCC患者DSS1的啟動(dòng)子常低甲基化,DSS1常高表達(dá),與sSCC的轉(zhuǎn)移(P<0.001)、潰瘍(P=0.003)、生存期低呈正相關(guān),且DSS高表達(dá)的患者平均生存期11.07個(gè)月,而DSS低表達(dá)鱗癌患者為20.79個(gè)月。用5-Azacytidine(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)抑制啟動(dòng)子甲基化后,DSS1的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加(P<0.001),與cSCC預(yù)后不良存在顯著關(guān)聯(lián)。

2.4.2 基底細(xì)胞癌 基底細(xì)胞癌(basal cell carcinorna,BCC)又名基底細(xì)胞上皮瘤,是最常見的非黑素瘤性皮膚惡性腫瘤,約占皮膚惡性腫瘤的90%[27]。臨床回顧性研究及Meta分析均證實(shí)紫外線輻射是誘導(dǎo)BCC發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[28-29]。BCC分子生物學(xué)機(jī)制被認(rèn)為主要與HH通路及相關(guān)基因、TP53、MYCN/FBXW7、Hippo-YAP、TERT等基因有關(guān)[30]。而編碼Ras癌基因結(jié)合蛋白的RASSF1A也參與基底細(xì)胞癌的發(fā)生,過去在喉癌、食管鱗癌研究中較為廣泛,近年來發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因的高甲基化與UVB誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[31]。此外,Wnt信號通路在表皮干細(xì)胞生長、角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及皮膚的穩(wěn)態(tài)與再生中發(fā)揮重要作用,NB-UVB抑制HaCaT細(xì)胞的增值及促進(jìn)凋亡可能是通過下調(diào)Wnt信號通路實(shí)現(xiàn)的。張勝逆等[32]檢測了62例BCC皮損組織標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)原癌基因Wnt1在BCC中的陽性率為87.10%,遠(yuǎn)高于在脂溢性角化中的陽性率25%,提示W(wǎng)nt1參與BCC的發(fā)生。Lang等[33]進(jìn)一步研究表明,表觀遺傳沉默引起Wnt的過表達(dá),特別是Wnt1、2、5A、11、13及16均與BCC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

2.4.3 惡性黑色素瘤 惡性黑素瘤來源于黑素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,被認(rèn)為是最具侵襲性的皮膚腫瘤。其發(fā)病機(jī)制至今未明,紫外線通過氧化應(yīng)激和遺傳物質(zhì)改變誘導(dǎo)皮膚趨癌環(huán)境形成是黑素瘤主要的病因之一。研究表明has-miR-300-GADD45B通過影響ROS清除和DNA損傷修復(fù)參與黑素瘤細(xì)胞的增殖、遷移和周期進(jìn)展[34]。表觀遺傳調(diào)控致遺傳物質(zhì)改變也會(huì)影響黑素瘤細(xì)胞異常增殖。Roos等[35]通過322例健康白人女性臍周部皮膚活檢,發(fā)現(xiàn)一系列備選基因在黑色素瘤和良性痣的啟動(dòng)子區(qū)存在差異甲基化,如位于基因體的TERT、CLPTM1L、TET2等,以及位于CpG島岸的MC1R、PARP1、DOCK3等,這些基因常與細(xì)胞分化調(diào)控、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、PI3K/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)癌癥種系抗原(CGAs)通過DNA去甲基化在多種腫瘤中表達(dá),在黑素瘤中,CGA表達(dá)增強(qiáng)與抗PD-1的敏感度相關(guān),而與CTL4的敏感性無關(guān)[36],提示CGA的治療性再激活可增強(qiáng)抗PD-1抑制劑的有效性,而不利于抗CTL4抑制劑的治療。黑素瘤惡性程度高,易轉(zhuǎn)移。有研究表明PD-1抑制劑免疫治療在黑色素瘤患者體內(nèi)效果欠佳且易耐藥,通過去甲基化促進(jìn)CGAs表達(dá),有望增加PD-1治療敏感度[36-37]。

DNA甲基化與皮膚惡性腫瘤密切相關(guān)。阿扎胞苷、地西他濱等作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1(DNMT1)抑制劑已被廣泛用于骨髓增生綜合征等血液系統(tǒng)疾病的治療,在皮膚惡性腫瘤治療中尚屬起步階段,其療效仍有待觀察。靶向5-甲基胞嘧啶雙加氧酶(TET)被認(rèn)為是惡性腫瘤治療的新突破。有數(shù)據(jù)表明,TET1與免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICI)治療更高的客觀有效率、更好的持久臨床獲益、更長的無進(jìn)展生存期和更好的總生存期有關(guān)[38]。此外,槐耳提取物可以通過調(diào)節(jié)CDKN2A和TP53的甲基化抑制cSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[39]。這將推進(jìn)皮膚惡性腫瘤的傳統(tǒng)和表觀遺傳治療結(jié)合的聯(lián)合治療策略。

2.5 紅斑狼瘡

紅斑狼瘡(lupus erythematosus,LE)歸屬于自身免疫性結(jié)締組織病,其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,目前統(tǒng)一的觀點(diǎn)是易感個(gè)體,在環(huán)境因素及性激素的作用下,產(chǎn)生異常免疫反應(yīng),紫外線輻射可以誘發(fā)LE,加重系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的皮損。成年紅斑狼瘡患者40%～90%存在光過敏現(xiàn)象[40]。光過敏也是美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)提出的系統(tǒng)性紅斑狼瘡11條診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[41]。

SLE是較為常見的臨床類型,其特征是免疫細(xì)胞的失調(diào),包括樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)、輔助性T細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等。其中,CD4+T細(xì)胞是SLE中研究最為廣泛的細(xì)胞。Li等[42]用UVB照射SLE患者的CD4+T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)核蛋白Gadd4過表達(dá),進(jìn)而CD4+T細(xì)胞DNA甲基化水平降低,甲基化敏感基因如PRF1、TNFSF7等表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致T細(xì)胞的自身反應(yīng)性增加,提示紫外線可能通過這一通路加重SLE病情。此外,紫外線加重SLE的作用機(jī)制也可能是通過調(diào)控CD4+T細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶含量。有實(shí)驗(yàn)表明[43],UVB呈劑量依賴性SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞DNMT酶催化活性,加重DNA低甲基化。

SLE患者CD8+T細(xì)胞中也存在表觀遺傳學(xué)調(diào)控。Miller等[44]發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比,SLE患者CD8+T細(xì)胞存在188個(gè)低甲基化CpG位點(diǎn),其中大部分位點(diǎn)與HLA-DRB1、STAT1有關(guān),提示CD8+T細(xì)胞在狼瘡中的致病機(jī)制可能存在表觀遺傳調(diào)控。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是介導(dǎo)多種自身免疫性疾病發(fā)生的重要細(xì)胞,SLE、炎癥性腸病(inflammation bowel disease,IBD)等自身免疫性疾病中均可見Treg數(shù)量及功能受損。Cheng等[45]首次發(fā)現(xiàn)SLE患者Treg細(xì)胞中AHR的下調(diào)抑制了TET2的表達(dá)并上調(diào)了NT5E啟動(dòng)子的甲基化水平。

SLE患者B淋巴細(xì)胞甲基化的研究相對較少,相較于CD4+T細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等,B細(xì)胞可能有更廣泛的甲基化改變,并且以啟動(dòng)子高甲基化為主,如DDR1、TM4SF19、DLK1基因等,其中TNF是這些高甲基化基因的重要上游調(diào)節(jié)因子[46]?？筎NF治療在炎風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)、IBD等免疫性疾病中的運(yùn)用已十分成熟,然而在SLE中尚存爭議。TNF下游基因的B細(xì)胞高甲基化可能解釋了系統(tǒng)性紅斑狼瘡中TNF失調(diào)的新機(jī)制。

此外,也有少數(shù)基因啟動(dòng)子低甲基化在SLE患者T、B淋巴細(xì)胞等不同細(xì)胞類型中共同存在,如IFI44L、PLSCR1等[46],部分學(xué)者甚至提出IFI44L啟動(dòng)子低甲基化可以作為診斷SLE生物標(biāo)志物的建議[47],但仍有爭議。差異甲基化位點(diǎn)作為診斷生物標(biāo)志物的有效性有待被證實(shí),與最常見的診斷性自身抗體之間的關(guān)系尚缺乏實(shí)質(zhì)性證據(jù),有待后續(xù)完善。

3 結(jié)語與展望

綜上所述,DNA甲基化與紫外線輻射息息相關(guān)。DNA甲基化是一種復(fù)雜的多種酶促反應(yīng)參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,目前大量研究已證實(shí)紫外線刺激影響甲基化修飾,且照射時(shí)間長短與修飾程度有關(guān),在日光性皮炎、光化性角化病、皮膚腫瘤、紅斑狼瘡等紫外線相關(guān)的皮膚疾病中存在眾多靶點(diǎn)的甲基化,通過影響靶點(diǎn)表達(dá),改變靶點(diǎn)功能,進(jìn)而促進(jìn)疾病的發(fā)生。但目前對DNA甲基化與光源性皮膚病發(fā)生的具體機(jī)制的認(rèn)識仍不夠,青少年春季疹、日光性蕁麻疹等更多光源性皮膚疾病的甲基化靶點(diǎn)有待進(jìn)一步總結(jié)歸納。甲基化是近年來皮膚病領(lǐng)域持久的研究熱點(diǎn),隨著甲基化檢測水平的提升,越來越多皮膚病中的差異甲基化位點(diǎn)被陸續(xù)發(fā)現(xiàn),這使得甲基化藥物的臨床研究有廣闊的前景。地西他濱(Decitabine)、阿扎胞苷(Azacitidine)、澤不拉林(Zebularine)等甲基化抑制劑現(xiàn)已被廣泛用于臨床惡性腫瘤的治療,新型的RSC133、DNMT3A-IN-1等DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑也已在逐漸運(yùn)用。但甲基化抑制劑在皮膚惡性腫瘤中的運(yùn)用尚不多見,在常見光老化等紫外線相關(guān)皮膚病中的應(yīng)用尚有待開發(fā)研究。